Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы стр.7
Раздел 1.1. Ангиогенез, основные регуляторы стр.7
1.2. Семейство факторов роста эндотелия сосудов VEGF стр.10
1.2.1. Фактор роста VEGF-A стр.11
1.2.2. VEGF-C стр.12
1.2.3. VEGF-D стр.14
1.3. Рецепторы факторов роста семейства VEGF стр.15
1.4. Регуляция экспрессии генов факторов роста эндотелия семейства VEGF стр.19
1.4.1. Общие сведения о регуляции экспрессии генов VEGF-C и VEGF-D стр.19
1.4.2. Регуляция экспрессии генов факторов роста VEGF ретиноидами стр.24
1.5. Экспрессия факторов роста эндотелия VEGF и их рецепторов в опухолях стр.29
1.5.2. Рак мочевого пузыря стр.33
1.5.3. Саркома Капоши стр.39
Глава 2. Материалы и методы стр.45
2.1. Выделение РНК из тканей опухолей и культивируемых клеток стр.45
2.1.2.Особенности выделения РНК из тканей стр.47
2.2. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) стр.48
2.2.1. Обратная транскрипция стр.48
2.2.2. Полимеразная цепная реакция (PCR) стр.50
2.3. Иммуногистохимическое окрашивание стр.52
2.4. Работа с культурами линий клеток человека стр.53
2.5. Клинический материал, использованный в работе стр.54
2.5.1. Клинический материал, полученный от пациентов с меланомой и СК стр.54
2.5.2. Материал, полученный от больных раком мочевого пузыря человека стр.54
2.5.3. Характеристика линий клеток, использованных в работе стр.56
ГЛАВА 3. Результаты стр.58
3.1. Экспрессия генов факторов роста эндотелия VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 в образцах саркомы Капоши стр.58
3.1.1. Изучение экспрессии исследуемых генов методом RT-PCR в образцах СК..стр.58
3.1.2. Иммуногистохимическое исследование образцов саркомы Капоши стр.60
3.1.3. Экспрессия генов факторов роста эндотелия VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 в образцах меланомы и метастазов меланомы...стр.65
3.1.4. Обсуждение стр.68
3.2. Экспрессия мРНК факторов роста эндотелия VEGF-C, VEGF-D, VEGF-A и их рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 в образцах, полученных от пациентов с РМП...стр.74
3.2.1. Введение стр.74
3.2.2. Изучение экспрессии мРНК факторов роста VEGF-C, VEGF-D, а также их рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 в образцах опухолей, полученных от пациентов с 1-Й стадиями рака мочевого пузыря стр.74
3.2.3. Изучение экспрессии мРНК фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A в образцах опухоли, полученных от пациентов с I-II стадиями РМП стр.77
3.2.4. Изучение экспрессии мРНК рецептора факторов роста эндотелия VEGFR-3, а также длинной изоформы этого рецептора VEGFR-3L в образцах, полученных от пациентов с 1-Й стадиями РМП стр.80
3.2.5. Изучение экспрессии мРНК генов факторов роста эндотелия и их рецепторов в образцах, полученных от пациентов с рецидивом заболевания стр.82
3.2.6. Изучение экспрессии генов VEGF-C и VEGF-D и их рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 в рецидивах рака мочевого пузыря стр.82
3.2.7. Изучение экспрессии мРНК фактора роста VEGF-A и его рецептора VEGFR-2 в рецидивах рака мочевого пузыря стр.84
3.2.8. Изучение экспрессии мРНК VEGFR-3, а также длинной изоформы рецептора VEGFR-3L в образцах, полученных от пациентов с рецидивом заболевания стр.86
3.2.9. Экспрессия мРНК изучаемых генов в образцах нормальной ткани мочевого пузыря человека стр.87
3.2.10. Обсуждение стр.92
3.3 Исследование участия сигнального пути, опосредованного рецептором ретиновой кислоты RARa, в регуляции активности генов факторов роста эндотелия VEGF-C,
VEGF-Dw. их рецепторов стр.96
3.3.1. Характеристика линий клеток, использованных в работе стр.96
3.3.2. Экспрессия рецептора RARa в исследованных клетках стр.97
3.3.3. Экспрессия гена фактора роста эндотелия VEGF-A в клетках стр.102
3.3.4.Экспрессия мРНК фактора роста эндотелия VEGF-C в клетках стр.105
3.3.5. Экспрессия мРНК фактора роста эндотелия VEGF-D в клетках стр.108
3.3.6. Экспрессия гена рецептора VEGFR-3 в клетках стр.109
3.3.7. Экспрессия гена рецептора VEGFR-2 в клетках стр.112
3.3.8. Обсуждение стр.114
Заключение стр.119-124
- Общие сведения о регуляции экспрессии генов VEGF-C и VEGF-D
- Экспрессия факторов роста эндотелия VEGF и их рецепторов в опухолях
- Иммуногистохимическое исследование образцов саркомы Капоши
- Изучение экспрессии мРНК фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A в образцах опухоли, полученных от пациентов с I-II стадиями РМП
Введение к работе
^ Исследование факторов роста эндотелия сосудов семейства VEGF — одна из
наиболее актуальных тем современной биологии и медицины. Для онкологии актуальность этой темы связана, а первую очередь, со способностью данных факторов индуцировать ангиогенез. Ангиогенез — процесс возникновения новых капилляров из предшествующей сосудистой сети — является необходимым условием для роста опухолей. Развитие новой сосудистой сети происходит под действием секретируемого клетками опухоли ангиогенного фактора роста VEGF-A, роль которого в неоангиогенезе опухолей доказана /FerraraN., 2003; Alitalo К., 2000/.
На данный момент семейство VEGF насчитывает 6 факторов роста: P1GF,
позже, чем VEGF-A, и их роль в жизнедеятельности как нормальных, так и Л
опухолевых клеток и тканей исследована недостаточно. Факторы роста семейства VEGF, взаимодействуя со своими рецепторами, VEGFR, способны индуцировать миграцию, пролиферацию, дифференцировку клеток эндотелия. Известны три рецептора факторов роста семейства VEGF: VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3. Существует специфичность взаимодействия факторов роста этого семейства со своими рецепторами, так: VEGF-A связывается с VEGFR-1 и VEGFR-2, но не с VEGFR-3, тогда как VEGF-C и VEGF-D опосредуют свое действие через VEGFR-2 и VEGFR-3, но не через VEGFR-1 /Nicosia R., 1998/.
Один из рецепторов VEGF-C и VEGF-D - VEGFR-3 экспрессируется
преимущественно клетками эндотелия лимфатических сосудов. Взаимодействуя с этим рецептором VEGF-C и VEGF-D вовлекаются в регуляцию лимфангиогенеза — процесса, влияющего на способность опухоли к метастазированию /Alitalo К., 2000/. В ряде работ найдена корреляция между повышением экспрессии VEGF-C, VEGF-D или VEGFR-3 и метастазированием опухолей в лимфоузлы /Zeng Y., 2004; Akagi К.,
2000; Niki T, 2000; Kitadai Y., 2001; Hashimoto I., 2001; Kurebayashi J., 1999/. С другой
стороны, VEGF-C и VEGF-D, очевидно, могут участвовать в образовании
кровеносных сосудов опухоли через связывание со вторым рецептором — VEGFR-2.
Роль различных рецепторов в процессах ангиогенеза и лимфангиогенеза в оупухолях
"" с участием VEGF-C и VEGF-D исследована недостаточно.
В лаборатории генетики опухолевых клеток в последние годы получены данные,
позволяющие полагать, что при некоторых злокачественных новообразованиях
экспрессия генов, кодирующих VEGF-C и его рецептор VEGFR-3, либо снижается
при прогрессии заболевания, либо не повышается по сравнению с их экспрессией в
нормальных тканях /Шушанов С, 2001/. Обнаружено, что в злокачественных
"*) опухолях щитовидной железы человека исчезает одна из изоформ рецептора
\ VEGFR-3 - его длинная изоформа /Shushanov S., 2000/.
Известно в то же время, что экспрессия VEGF-A и его рецептора VEGFR-2 в
злокачественных новообразованиях часто нарастает /Ferrara N., 2003; Alitalo К.,
г* 2000/. Сопоставление степени экспрессии генов разных факторов семейства VEGF на
разных стадиях развития злокачественных новообразований может прояснить роль
каждого из данных факторов в развитии опухолевого процесса. Такой подход может
также привести к обнаружению новых молекулярных маркеров определенных этапов
прогрессии новообразования.
Данная работа посвящена исследованию экспрессии генов VEGF-C и VEGF-D, а также генов, кодирующих их рецепторы VEGFR-2 и VEGFR-3 на разных стадиях развития опухолей мочевого пузыря и саркомы Капоши. Экспрессия генов VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2 и VEGFR-3 при этих двух формах злокачественных новообразований была исследована мало или не исследована совсем (см. раздел «Обзор литературы»). Мы сопоставили экспрессию этих генов и экспрессию гена VEGF-A, наиболее исследованного фактора роста этого семейства С целью понимания молекулярных механизмов, определяющих различия в экспрессии
исследуемых генов на разных этапах развития злокачественных новообразований,
необходимо исследовать регуляцию данных генов. В данной работе мы исследовали участие сигнального пути, контролируемого ретиноидами, в регуляции активности изучаемых нами генов. В частности, было проведено исследование участия рецептора ретиноевой кислоты в регуляции активности генов VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2 и VEGFR-3, а также VEGF-A.
Новизна темы.
Экспрессия VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2, VEGFR-3 в опухолях человека
интенсивно исследуется в последние годы. В этих работах, как правило, изучается
корреляция между экспрессией VEGF-C, VEGF-D, и/или VEGFR-3 и способностью
' опухоли к метастазированию в лимфоузлы и корреляция обычно обнаруживается.
3 Работ, в которых исследуется экспрессия VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов на
разных стадиях развития злокачественных новообразований мало. В нашей работе
впервые исследована связь экспрессии генов VEGF-C, VEGF-D, а также рецепторов
<* VEGFR-2 и VEGFR-3 с различными этапами развития опухолей мочевого пузыря
человека. Проведено сравнение экспрессии этих генов и гена, кодирующего VEGF-A.
Впервые изучена экспрессия генов VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2 и VEGFR-3 в саркомах Капоши на различных стадиях этого заболевания. Впервые экспрессия этих генов сопоставлена с экспрессией гена и белка VEGF-A при прогрессировании саркомы Капоши. Впервые механизмы регуляции генов VEGF-C, VEGF-D, VEGF-A и генов, кодирующих их рецепторы, исследованы в культивируемых клетках гематобластозов человека с введеным геном рецептора ретиноевой кислоты RARa.
* Цель планируемого исследования:
Целью настоящей работы является выяснение вопроса об участии изменений активности генов VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов в процессе прогрессии опухолей различных локализаций.
Задачи исследования:
Определить экспрессию исследуемых генов в образцах ткани от больных саркомой Капоши методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). Сравнить экспрессию генов VEGF-C и VEGF-D с экспрессией VEGF-A. Рассмотреть взаимосвязь между экспрессией генов и различными стадиями заболевания, а также этиологией опухоли.
Определить экспрессию исследуемых генов в образцах ткани от больных с раком мочевого пузыря и в нормальной ткани мочевого пузыря методом RT-PCR. Сравнить экспрессию генов VEGF-C и VEGF-D с экспрессией VEGF-A. Рассмотреть корреляцию экспрессии генов со стадиями анаплазии, клиническим прогнозом, появлением рецидивов и другими характеристиками опухолей.
3. Исследовать участие гена рецептора ретиноевой кислоты RARa в регуляции
экспрессии генов VEGF-C и VEGF-D и их рецепторов в культивируемых клетках
гематобластозов человека разных типов дифференцировки. Сравнить экспрессию генов
VEGF-C и VEGF-D с экспрессией гена VEGF-A.
Научно-практическая значимость исследования:
Картина экспрессии генов VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2 и VEGFR-3 при раке мочевого пузыря человека и саркоме Капоши позволила получить новые факторы прогноза течения заболеваниий. Характер экспрессии VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2 и VEGFR-3 при саркоме Капоши и опухолях мочевого пузыря человека на разных стадиях заболеваний позволила выяснить новые закономерности экспрессии в опухолях различных факторов роста семейства VEGF и их рецепторов. Впервые показано, что гиперэкспрессия гена RARa может существенно влиять на экспрессию факторов роста эндотелия сосудов семейства VEGF и их рецепторов в клетках гематобластозов человека, что может влиять на чувствительность гемобластозов к терапии препаратами ретиноевой кислоты.
Общие сведения о регуляции экспрессии генов VEGF-C и VEGF-D
Поскольку одной из наших задач было исследование регуляции экспрессии факторов роста VEGF-D и VEGF-C и их рецепторов, мы рассмотрим данные литературы о регуляции этих генов. Регуляция экспрессии мРНК изучаемых нами генов может дать важные сведения, необходимые для разгадки биологических функций и молекулярных регуляторов ангиогенеза в опухолях, особенно на разных стадиях развития злокачественных новообразований. В ранней работе Chilov D. et.al. была исследована регуляторная область мышиного и человеческого генов VEGF-C. Найдены возможные сайты связывания трёх хорошо изученных факторов транскрипции: Sp-І, Ар-2 и NF-кВ /Chilov D., 1997/. Все эти регуляторные элементы и могут определять регуляцию, экспрессию и биологию этого фактора роста эндотелия.
Показано, что уровни экспрессии мРНК VEGF-A и VEGF-C в «голодающих» клетках в культуре (бессывороточная среда) увеличивались при добавлении сыворотки, но в меньшей степени в ответ на добавление PDGF и TGF-р, двух основных факторов роста сыворотки /Enholm В., 1997/. Авторы предполагают, что, так как лимфангиогенез был описан при заживлении ран, то VEGF-C может быть индуцирован в ответ на факторы роста сыворотки и может способствовать заживлению ран /Enholm В., 1997/. Экспрессия гена VEGF-D не регулируется факторами роста сыворотки /Orlandini М., 2003/.
Активация онкогенов увеличивала уровни мРНК VEGF-A в культуре, что свидетельствовало о связи между прогрессией опухолей и ангиогенезом. Активация рекомбинантного конструкта, несущего ген ras, повышала уровни мРНК VEGF-A, тогда как уровни VEGF-C и VEGF-B не изменялись. Таким образом, активация Ras не влияет на уровни мРНК VEGF-C и Grb-Shc-Sos-Ras сигнальный путь не вовлекается в регуляцию экспрессии гена VEGF-C /Enholm В., 1997/. Мутантный опухолевый ген-супрессор р53, который является сильным индуктором мРНК VEGF-A, не влиял на уровни мРНК VEGF-C. Форболовый эфир, ТРА, индуцировал увеличение уровня мРНК VEGF-C, возможно через взаимодействие с АР-1 сайтом в промоторе гена VEGF-C /Enholm В., 1997; Chilov D., 1997/. В статье /Chilov D., 1997/ в промоторной области гена VEGF-C сайт связывания фактора транскрипции АР-1 не обнаружен. VEGF-A также может индуцироваться при добавлении ТРА, и эта индукция экспрессии VEGF-A может быть опосредована именно через АР-11 /Diaz B.V., 2000/.
Индукция уровней мРНК VEGF-A гипоксией является одним из ключевых признаков этого гена и она обуславливает индукцию ангиогенеза в ишемических тканях и в течение роста солидных опухолей /Ferrara N., 2003/. VEGF-A отвечает на гипоксию через HIF-1 индуцированную активацию транскрипции и стабилизацию 3 -нетранслируемой области мРНК гена VEGF-A. Уровни экспрессии мРНК VEGF-C не повышались при гипоксии, делая VEGF-A единственным фактором в семействе VEGF, регулируемым гипоксией. Показано, что ни VEGF-B, ни VEGF-D прямо не регулируются гипоксией /Orlandini М., 2003/.
Показано, что время полужизни мРНК VEGF-B было очень длинным и составляло более 8 часов, тогда как время полужизни мРНК VEGF-C равно примерно 3,5 часа и составляло для VEGF-A около 1 часа. Время полужизни мРНК VEGF-C и VEGF-A увеличивалось при добавлении сыворотки, приводя к более высоким уровням мРНК. Так время полужизни мРНК VEGF-C увеличивалось с 3,5 часов до 5,5-6 часов. Эффект повышения количества мРНК VEGF-C происходил независимо от синтеза белка /Enholm В., 1997/. Таким образом, в присутствии сыворотки увеличивается стабильность мРНК как VEGF-A, так и VEGF-C, что свидетельствует о сходстве регуляции их экспрессии сывороткой.
Эффекты про-воспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли (TNF-a) и интерлейкина-1 (IL-lp) на экспрессию мРНК генов VEGF-A и VEGF-C исследованы in vitro /Ristimaki А., 1998/. Инкубация клеток с рекомбинантным IL-ip индуцировала транскрипцию гена VEGF-A и гена VEGF-C. Уровень секретируемого, частично созревшего белка VEGF-C также увеличивался в ответ на TNF-a и IL-lp. Показано данными на ядрах (nuclear run-on assay), что увеличенные уровни мРНК VEGF-C, индуцированные TNF-a и IL-ip, главным образом были результатом увеличенной транскрипции /Ristimaki А., 1998/. Для гена VEGF-A показано, что уровни мРНК VEGF-A регулируются как транскрипционно, так и при помощи посттранскрипционной стабилизации, опосредованной взаимодействия-ми РНК -белок в З -нетранслируемой области VEGF-A /Levy А.Р., 1996/.Можно заключить, что транскрипционная регуляция мРНК VEGF-C отличается от регуляции VEGF-A.
Промотор гена VEGF-C содержит возможные сайты связывания фактора транскрипции NF-кВ /Chilov D., 1997/, который может опосредовать активацию транскрипции, как это было описано для про-воспалительных цитокинов /Baeuerle Р. А., 1996/. Индукция мРНК VEGF-C про-воспалительными цитокинами ингибировалась дексометазоном, но не индометицином. По-видимому, простаноиды напрямую не опосредуют эффекты про-воспалительных цитокинов на транскрипцию мРНК VEGF-C /Ristimaki А., 1998/. Индукция транскрипции мРНК гена VEGF-A про-воспалительными цитокинами была непрямо опосредована простаноидами /Ben-Av Р., 1995; Abdel-Majid R.M., 2004/. Есть данные, что простагландин Е2 опосредует активацию фактора транскрипции СОХ-2, увеличивая транскрипцию мРНК VEGF-C /Su J.L., 2004/. Имеются и другие данные о NF-кВ-зависимой регуляции VEGF-C через р38/МАРК сигнальный путь в клетках рака молочной железы линии MCF-7 /Tsai P.W., 2003/. Можно думать, что регуляция мРНК VEGF-C про-воспалительными цитокинами свидетельствует о том, что VEGF-C регулирует функции лимфатических сосудов при воспалении.
Экспрессия факторов роста эндотелия VEGF и их рецепторов в опухолях
Нарушение регуляции экспрессии VEGF-A способствует развитию солидных опухолей, активируя ангиогенез. VEGF-A экспрессируется практически во всех изученных солидных опухолях, а также при новообразованиях системы кроветворения /Ferrara N., 2003; Alitalo К., 2000/. Ингибирование VEGF-A в экспериментальных опухолях уменьшает рост опухоли. Ингибирование передачи сигнала VEGF-A нарушает развитие различных опухолей у мышей /Kim K.J., 1993; Melnyk О., 1996; Millauer В., 1994/. Ясно, что VEGF-A весьма значим для прогрессии опухолей, так как VEGF-A является онкогенным фактором в клетках эндотелия /Arbiser J.L., 2000/. У пациентов найдена связь между экспрессией VEGF-A и различными параметрами, например корреляции с прогрессией заболевания, с выживаемостью больных /Vlaykova Т., 1999; Adams J., 2000; Gasparini G., 2001/. Данные в литературе о роли VEGF-A и его рецепторов в различных новообразованиях человека весьма многочисленны, и здесь у нас нет возможности разобрать хотя бы часть работ. VEGF-А экспрессируется и во многих линиях клеток, полученных от больных с различными гематологическими новообразованиями, включая: множественную миелому, Т-клеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз, лимфому Бёркита, хронический миелобластный лейкоз и другие /Gerber Н.Р., 2003/.
При исследовании экспрессии мРНК VEGF-C, показано, что ее экспрессия обнаруживается примерно в половине исследованных раков /Salven Р., 1998/. В норме мРНК VEGF-C у человека слабо экспрессируется в лимфоузлах, сердце, плаценте, скелетных мышцах и других тканях /Joukov V., 1996/. Уровни мРНК VEGF-C не коррелировали со степенью прогрессии рака кишечника человека /Andre Т., 2000/. Однако, целый ряд работ описывает корреляции между экспрессией VEGF-C в опухолях человека и формированием метастазов в региональные лимфоузлы. Обнаружена высокая степень корреляции повышенного уровня VEGF-C в первичных опухолях с метастазами в лимфоузлы при раке щитовидной железы /Bunone G., 1999/, опухолях простаты /Tsurusaki Т., 1999/, раке желудка /Yonemura Y., 1999/, раке нижнего отдела толстой кишки /Akagi К., 2000/, лёгкого /Niki Т., 2000/ и плоскоклеточном раке пищевода /Kitadai Y., 2001/. VEGF-C является фактором прогноза при раке шейки матки /Hashimoto I., 2001/. Гибридизация in situ показала, что мРНК VEGF-C локализована в клетках опухоли. Исследования на больных выявили позитивную корреляцию между экспрессией VEGF-C, инвазией и метастазированием в лимфатические узлы /Alitalo К., 2000/. Экспрессия VEGF-C при раке молочной железы коррелирует с метастазами в лимфоузлы, тогда как VEGF-D экспрессируется преимущественно в воспалительных поражениях молочной железы /Kurebayashi J., 1999/. При РМЖ VEGF-C найден в цитоплазме клеток опухоли, а его рецептор в кровеносных сосудах, предполагая ангиогенную роль для VEGF-C /Valtola R., 1999/. Клетки рака молочной железы человека, гиперэкспрессирующие VEGF-C, индуцировали лимфангиогенез внутри и вокруг имплантированных опухолей у мышей /Skobe М., 2001; Karpanen Т., 2001/. Все исследованные образцы лимфом содержали низкие уровни мРНК VEGF-C, отражая специфичный для данного вида клеток характер экспрессии VEGF-C в соответствующих нормальных клетках /Salven Р., 1998/.
У животных, опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие VEGF-C, индуцировали лимфангиогенез по периметру опухоли и вызывали инвазию клеток опухоли в лимфатические сосуды /Не Y., 2002; Mandriota S.J., 2001; Saaristo А., 2000/. VEGF-C может быть важным фактором, регулирующим взаимные паракринные взаимодействия между клетками опухоли и клетками эндотелия лимфатических сосудов /Salven Р., 1998/. Всё это позволяет полагать, что факторы роста VEGF-C и VEGF-D играют разные роли в различных опухолях.
VEGF-D присутствует в большинстве нормальных тканей человека, но особенно интенсивно экспрессирован в лёгком /Farnebo F., 1999/. В экспериментальных опухолях VEGF-D увеличивал рост лимфатических сосудов и метастазирование через лимфатические сосуды /Stacker S.A., 2001/. Кроме ангиогенеза и увеличенного метастазирования, опухоли, секретировавшие VEGF-D, также имели более высокую скорость роста. Рост опухоли, ангиогенез и образование метастазов ингибировалось нейтрализующими антителами к биологически активному региону VEGF-D. VEGF-D также найден в гладкомышечных клетках сосудов, но не в эндотелии сосудов толстой кишки /Achen M.G., 2001/. Предполагается, что VEGF-D играет роль в ангиогенезе и лимфангиогенезе. VEGF-D имеет прогностическое значение для инвазии лимфатических сосудов, его экспрессия может коррелировать с выживаемостью при определённых раках человека, подробнее см.обзор К. Alitalo и P. Carmeliet, 2002. Появились работы, в которых авторы выявляют связь различных клинических характеристик, чаще метастазирования, с экспрессией VEGF-D. Экспрессия VEGF-C и VEGF-D исследована для рака пищевода, а также в нормальных образцах слизистой /Ishikawa М, 2004/. Гетерогенная окраска на VEGF-C и VEGF-D наблюдалась во всех образцах рака простаты. Интенсивность окраски для VEGF-C ниже в доброкачественном эпителии, чем в злокачественной карциноме, но никаких различий нет для VEGF-D.
VEGFR-3 обнаружен в клетках эндотелия лимфатических сосудов в 18 из 37 образцов тканей рака простаты. Присутствие VEGFR-3 ассоциировано с метастазами в лимфоузлы при раке простаты /Zeng Y., 2004/. VEGFR-3 имеет важное значение в формировании опухоль-ассоциированной неоваскуляризации, так как он экспрессиро-ван в капиллярах в течение опухолевого ангиогенеза /Partanen Т.А., 1999/. В новообразованных сосудах опухоли VEGFR-3 повышается /Valtola R., 1999/. Есть и иные данные, так в нашей лаборатории было показано, что экспрессия мРНК длинной изоформы рецептора VEGFR-31 может снижаться в аденокарциномах, по сравнению с нормальной тканью щитовидной железы /Shushanov S.S., 2000/. Сходные данные получены при исследовании рака молочной железы. Авторы наблюдали потерю длинной VEGFR-31, но не короткой VEGFR-3s изоформ рецептора VEGFR-3 в раках по сравнению с нормой. Такое отличие в падении экспрессии длинной изоформы рецептора особенно ярко выражено в опухолях, которые дали метастазы /Gunningham S.P, 2000/. Инактивация VEGFR-3 антителами угнетает рост опухоли у голых мышей.
Иммуногистохимическое исследование образцов саркомы Капоши
Поскольку нами были обнаружены тенденции к различиям в экспрессии исследуемых нами генов между группой I образцов (начальная стадия заболевания) и группой II (образцы со стадией прогрессии), было решено проанализировать экспрессию белков этих генов в образцах сарком Капоши. В нашей работе была использована методика иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) гистологических срезов для исследования экспрессии VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3, а также экспрессии общепринятого маркёра клеток эндотелия CD34 и маркёра клеточной пролиферации Кі-67 в биопсиях СК на различных стадиях прогрессии заболевания. В качестве контрольної! группы были исследованы различные доброкачественные заболевания кожи (см. материалы и методы). В образцах СК оценивалось окрашивание только веретеновидных клеток и клеток эндотелия, тогда как в контрольных образцах при рассмотрении учитывались различные типы окрашенных клеток. Ниже будет приведено более детальное описание типов окрашенных клеток. Результаты ИГХ окрашивания представлены в таблице 3. Все образцы, исследованные иммуногистохимически, были разбиты на три группы. Группа I образцов СК (начальная стадия), группа II СК (пациенты на стадии прогрессии СК), контрольная группа доброкачественных заболеваний кожи. В таблице приведено количество положительных образцов по каждому из исследованных генов в каждой группе из общего числа исследованных образцов. Экспрессия VEGF-A была исследована в 19 образцах СК и 9 контрольных образцах тканей (табл 3, 4). Оценка интенсивности окрашивания приведена в таблице 4. г Интенсивное окрашивание (2+, 3+) цитоплазмы и мембраны большинства клеток сосудов было найдено во всех VEGF-A-положительных образцах СК. Веретеновидные клетки СК также были окрашены в обеих группах СК (в 9/9 образцов из I группы и в 8/10 образцов из группы II) (табл 3 и 4). В контрольной группе высокий уровень экспрессии VEGF-A (2+, 3+) был также найден в большинстве случаев (8/9 образцов), в которых окрашивались пролиферирующие клетки кожи и сосудов (таблица 4).
В 5 контрольных случаях клетки стромы были окрашены на VEGF-A и в 3 случаях (2 васкулита и одна ангиокератома) было обнаружено сильное окрашивание эпидермиса. Как следует из наших данных, VEGF-A экспрессируется в различных типах клеток (веретеновидные, эндотелиальные и другие) образцов СК, а также в доброкачественных заболеваниях кожи. Интенсивность окрашивания и число VEGF-A-положительных клеток были довольно высоки во всех исследуемых группах. Окрашивание на VEGF-A различалось в 2-х группах СК: в группе I все образцы были окрашены с интенсивностью 2+, 3+; тогда как в группе II 2/9 образцов СК были негативны, а 1 образец имел довольно низкий уровень окраски (табл 4). Таким образом, окрашивание образцов СК антителами к VEGF-A в группе I было более равно-мерным, чем в группе II (табл 4). Эти данные согласуются с результатами по экспрессии мРНК VEGF-A в двух группах образцов СК. Распределение окраски на VEGF-A в группе контрольных образцов было схожим с группой II СК (стадия прогрессии СК).
Оба рецептора VEGF-A экспрессировались в большинстве образцов СК. Это может означать, что VEGF-A-зависимая сигнальная система может быть активной в образцах исследованных тканей. Экспрессия рецептора VEGFR-1 была исследована в 10 случаях СК и 3-х контрольных образцах. Экспрессия VEGFR-2 изучалась в 9 случаях СК и 4 контрольных образцах ткани (табл 3). Никаких значительных различий (между 2 группами образцов СК и контрольной группой) по экспрессии VEGFR-1 и VEGFR-2 не было найдено. Наблюдалась тенденция уменьшения экспрессии белка VEGFR-1 в группе образцов сарком Капоши II, но, принимая во внимание малое число образцов, исследованных в группе I, эти различия не были статистически значимы. Веретеновидные клетки СК были окрашены антителами к VEGFR-1 и к VEGFR-2 в большинстве положительных образцов. Клетки эндотелия сосудов были положительны по окрашиванию антителами к этих двум рецепторам, как в группе СК, так и в контрольных образцах. Строма ткани и эпидермис были также иногда окрашены. Это свидетельствует либо об экспрессии этими тканями изученных белков, либо, что более вероятно, о недостаточной специфичности антител или некорректной окраске.
Экспрессия VEGFR-3 изучена в 18 образцах биопсий СК и 6 образцах контрольных доброкачественных заболеваниий кожи (табл 3). Во всех 11 случаях группы I было найдено интенсивное окрашивание (2+, 3+) 50-75% веретеновидных клеток (рис 4). Интересный результат дало окрашивание образцов СК группы II (стадия прогрессии): только одна из 7 биопсий (14,3%) была позитивна по VEGFR-3. Уровень окрашивания в этом образце был интенсивным (2+, 3+), но число VEGFR-3-положительных клеток было около 10%. В контрольной группе VEGFR-3-положительных образцов не найдено. Итак, VEGFR-3 был единственным из рассмотренных нами маркёром, который экспрессировался дифференциально в веретеновидных клетках СК при разных стадиях прогрессии и не экспрессировался в заболеваниях контрольной группы.
На рисунке 4 можно видеть иммуногистохимическое окрашивание образцов саркомы Капоши антителами к VEGFR-3. Можно заметить интенсивное окрашивание опухолевых веретеновидных клеток СК антителами к VEGFR-3. Экспрессия VEGF-A и рецепторов VEGF в биопсиях СК сравнивалась с экспрессией CD34, маркёра, специфичного для клеток эндотелия, который широко используется для окраски микрососудов. Экспрессия CD34 была изучена в 16 биопсиях СК (8 биопсий с начальной и 8 со стадией прогрессии СК) и в 8 контрольных образцах (Таблица 3).
Изучение экспрессии мРНК фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A в образцах опухоли, полученных от пациентов с I-II стадиями РМП
Сравним 2 пары образцов норма-рак, взятых от одного больного. В паре 27-N (норма) и 27-Оп (рак) мы видим (рисунок 12), что экспрессия мРНК VEGF-A намного выше в опухоли, тогда как в норме выше экспрессия VEGF-C и VEGFR-3. мРНК гена VEGF-D обнаружена в норме и раке на низком уровне и его экспрессия одинакова внутри этой пары, как и экспрессия VEGFR-2.
В паре образцов 28-N и 28-Оп экспрессия VEGF-C и VEGFR-2 выше в опухоли, чем в норме, как и VEGF-A. мРНК VEGF-A намного больше в раке, чем в норме. Экспрессия гена VEGFR-3 обнаружена не была. Нужно заметить, что почти во всех остальных раках (образцы 1-25) мы видели экспрессию мРНК этого рецептора. Экспрессия VEGF-D выражена и не отличается в норме и раке, как в и образцах 27-N и 27-Оп. В образце нормальной ткани 29-N мы видим очень слабую экспрессию мРНК генов VEGF-A и VEGF-D, тогда как VEGF-C и VEGFR-2 экспрессированы на достаточно высоком уровне.
Мы конечно не можем строго сравнивать экспрессию изучаемых генов в различных образцах нормальной ткани по техническим причинам. Строго мы можем сравнивать только образцы от одного больного в паре норма-рак, так как из рисунка 12 мы видим, что эти пары образцов были исследованы в одинаковых условиях и наносились на один гель.
Таким образом, мРНК изучаемых факторов роста и их рецепторов может быть обнаружена в образцах нормальной ткани мочевого пузыря уровни экспрессии всех изучаемых генов могут быть как высокими, так и низкими. Могут быть индивидуальные различия по экспрессии данных генов между образцами разных пациентов.
Теперь остановимся подробнее на экспрессии мРНК фактора роста VEGF-A в нормальной ткани мочевого пузыря и сравним с образцами рака. Мы отдаём себе отчёт о том, что экспрессия мРНК всех генов исследовалась только в 4-х образцах нормальной ткани. Но как было показано выше, во всех образцах нормальной ткани мы либо вообще не обнаружили экспрессии VEGF-A, либо уровень экспрессии бьш чрезвычайно низок. Как можно заметить из рисунка 12, при стандартном числе циклов амплификации мы не видим экспрессии мРНК VEGF-A во всех 4 образцах нормальной ткани (уровни экспрессии находятся за границей чувствительности при стандартных для всех образцов условиях). В то же время, во всех 25 образцах рака (см. рисунки 7 и 10) была найдена экспрессия VEGF-A на высоком уровне. Экспрессия в норме конечно есть, но она несоизмеримо ниже в образцах нормальной слизистой мочевого пузыря человека, по сравнению с раками. Если амплифицировать с кДНК, значительно увеличив число циклов (+5 циклов к стандартному числу), то можно увидеть (рис. 12, « »), что в образцах 27-N, 28-N и 29-N появляется невысокий уровень экспрессии гена VEGF-A, однако его уровень экспрессии намного ниже в норме, чем в раках. Мы видели, что во всех 27 образцах рака экспрессия VEGF-A выражена ярко, и примерно одинакова.
Если сравнивать экспрессию в этих раках с экспрессией в норме, то можно отметить огромную разницу в уровнях экспрессии VEGF-A. Сравнивая уровни экспрессии мРНК гена VEGF-A при увеличенном числе циклов нужно понимать, что на большом числе циклов прирост продукта может быть нелинеен, и разница может оказаться ниже.
Чтобы не возникало дополнительных вопросов, сравним уровни экспрессии мРНК гена VEGF-A в образцах нормальной ткани и раков, полученных от одного больного (пары 27-N & 27-Оп и 28-N & 28-Оп). Денситометрическая оценка интенсивности свечения продукта в геле показала, что уровень экспрессии VEGF-A в образце 27-Оп (рак) в 6,4-4 раза выше уровня в образце 27-N (нормальная слизистая мочевого пузыря того же пациента). Для другой пары образцов от одного пациента получили, что уровень экспрессии в образце 28-Оп (рак) в 3,8-3,3 раза выше уровня в образце 28-N (норма). Если же сравнить уровень экспрессии мРНК гена VEGF-A в образце 29-N и в любом образце из группы раков, то заметим, что разница в уровне экспрессии окажется примерно в 10 раз выше в раках, чем в норме. Таблица 8. Экспрессия мРНК гена VEGF-A в образцах рака мочевого пузыря человека (первичные раки и рецидивы) и образцах ткани нормальной слизистой мочевого пузыря человека.
Можно заключить, что в раках мочевого пузыря человека, во всех 27 образцах мы видели экспрессию мРНК VEGF-A на высоком уровне. Мы не обнаружили мРНК данного фактора роста во всех 4 образцах нормальной слизистой мочевого пузыря человека при стандартном числе циклов амплификации. Эта разница является статистически достоверной (оценено по критерию %2, вычислено по формуле с поправкой Йетсена), с вероятностью ошибки, существенно меньшей, чем 1 %, Р 1 %, смотрите таблицу 8.
Когда число циклов было значительно увеличено, выявлялся невысокий уровень экспрессии VEGF-A. Разница между нормой и раком составляла от 3,3 до 6,4 раз при сравнении образцов, полученныхот одного больного и до 10 раз при сравнении случайно выбранных раков и нормы. Таким образом можно предположить, что в опухоли происходит активация экспрессии VEGF-A, тогда как в норме ген экспресиирован но на совсем другом уровне, много более низком, чем в опухоли.
![Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов и компонентов системы активации плазминогена при раке эндометрия [Электронный ресурс]](/i/i/4243/210076.png "Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов и компонентов системы активации плазминогена при раке эндометрия [Электронный ресурс] Грицаенко Евгений Викторович")
