Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Введение в метод проточной ДНК-цитометрии и принцип анализа ДНК-цитометрических кривых 12
1.1. Метод проточной ДНК-цитометрии и принцип анализа ДНК-цитометрических кривых 12
1.2. Принципы анализа ДНК-цитометрических кривых 16
Резюме 21
Глава 2. Разработка метода компьютерного анализа ДНК цитометрических данных 22
2.1. Задачи исследования 22
2.2. Принцип алгоритма компьютерного анализа распределения клеток по содержанию ДНК 23
2.3. Назначение и условия применения алгоритма анализа ДНК-цитометрических данных 25
2.4. Проверка работоспособности алгоритма и программы на модельных примерах и в сравнении с другими программами 27
2.5. Сравнение результатов компьютерного ДНК-цитометрического анализа с данными экспериментального определения доли пролиферирующих клеток в популяции 34
Резюме 36
Глава 3. Материалы, использованное оборудование, методики исследований 37
3.1. Материалы и использованное оборудование 37
3.2. Приготовление материала для исследования 38
3.3. ДНК-цитометрия образцов 39
3.4. Статистическая обработка данных 41
3.5. Сопоставление результатов ДНК-цитометрии опухолей с клиническими данными 41
Резюме 43
Глава 4. ДНК-цитометрическое исследование некоторых злокачественных опухолей человека. Анализ корреляции ДНК-плоидности опухолевых клеток, морфологических характеристик опухолей и особенностей клинического течения опухолевого процесса 44
4.1. Опухоли молочной железы 44
4.1.1. ДНК-плоидность в злокачественных новообразованиях молочных желез и ее прогностическая значимость (литературная справка) 44
4.1.1.1. ДНК-плоидность и ее связь с размером опухоли, стадией заболевания 45
4.1.1.2. ДНК-плоидность и ее взаимосвязь с морфологическими характеристиками 47
4.1.1.3. ДНК-плоидность и пролиферативная активность и их связь с рецидивированием РМЖ 49
4.1.1.4. Связь ДНК-плоидности с чувствительностью к проводимым лечебным мероприятиям 51
4.1.1.5. ДНК-плоидность в первичных опухолях и их метастазах 52
4.1.1.6. Связь ДНК-плоидности и содержания рецепторов стероидных гормонов 52
4.1.1.7. Взаимосвязь между ДНК-плоидностью и выживаемостью больных 53
4.1.2. Анализ и сопоставление ДНК-цитометрических данных с клиническими факторами прогноза (собственные исследования)...57
4.1.2.1. Контингент больных 57
4.1.2.2. ДНК-плоидность и стадия заболевания 57
4.1.2.3. ДНК-плоидность, частота и сроки возвратов заболевания... 58
4.1.2.4. ДНК-плоидность и гистопатологические параметры 61
4.1.2.5. ДНК-плоидность и статус рецепторов стероидных гормонов 62
4.1.2.6. ДНК-плоидность и выживаемость больных РМЖ 63
4.1.2.7. ДНК-плоидность первичных и метастатических РМЖ 64
4.1.2.8. ДНК-плоидность и эффективность химио- и лучевой терапии при РМЖ 72
4.1.2.9. Многофакторный анализ значимости ДНК-плоидности при РМЖ 73
Резюме 75
4.2. Раки слизистой оболочки полости рта и гортани 76
4.2.1. ДНК-цитометрия и прогнозирование течения опухолевого процесса при раках слизистой оболочки полости рта и гортани (литературная справка) 76
4.2.1.1. ДНК-анеуплоидия при раках слизистой оболочки рта и гортани 77
4.2.1.2. ДНК-плоидность, возраст, пол и локализация опухоли 78
4.2.1.3. ДНК-плоидность и стадия заболевания 78
4.2.1.4. ДНК-плоидность и гистологическая степень злокачественности 80
4.2.1.5. ДНК-плоидность и состояние регионарных лимфатических узлов 81
4.2.1.6. ДНК-плоидность и выживаемость больных 83
4.2.2. Анализ содержания ДНК в опухолевых клетках и сопоставление лабораторных данных с течением опухолевого процесса больных раком слизистой оболочки орофарингеальной области (собственные исследования) 87
4.2.2.1. Контингент больных 87
4.2.2.2. Опухоли слизистой оболочки полости рта и гортани 88
4.2.2.3. Опухоли гортани 92
4.2.2.4. Опухоли слизистой оболочки полости рта 103
4.2.2.5. Многофакторный анализ значимости ДНК-плоидности... 111
Резюме 113
4.3. Опухоли легкого 114
4.3.1. ДНК-цитометрическая характеристика опухолей легкого (литературная справка) 114
4.3.2. Анализ и сопоставление ДНК-цитометрических данных с клиническими показателями (собственные исследования) 121
4.3.2.1. Контингент больных 121
4.3.2.2. ДНК-плоидность, стадия заболевания и гистоморфологические характеристики 121
4.3.2.3. ДНК-плоидность и частота рецидивирования 123
4.3.2.4. ДНК-плоидность и выживаемость 125
4.3.2.5. ДНК-плоидность и выживаемость больных раками легкого в зависимости от примененного лечения 127
Резюме 128
4.4. Опухоли прямой и ободочной кишки 129
4.4.1. ДНК-плоидность при злокачественных новообразованиях прямой и ободочной кишки (литературная справка) 129
4.4.1.1. ДНК-плоидность и стадия заболевания 130
4.4.1.2. ДНК-плоидность и дифференцировка опухоли 133
4.4.1.3. ДНК-плоидность, возраст и пол больных 134
4.4.1.4. ДНК-плоидность и локализация опухоли 134
4.4.1.5. Плоидность ДНК и продолжительность жизни 135
4.4.1.6. Индекс ДНК и прогноз при колоректальном раке 139
4.4.1.7. Пролиферативная активность и прогноз колоректального рака 141
4.4.2. Анализ и сопоставление ДНК-цитометрических данных с клиническими факторами прогноза при колоректальном раке (собственные исследования) 145
4.4.2.1. Контингент больных 145
4.4.2.2. ДНК-плоидность,пол, стадия заболевания и локализация опухоли 149
4.4.2.3. ДНК-плоидность и дифференцировка опухоли 152
4.4.2.4. ДНК-плоидность и частота прогрессирования заболевания 153
4.4.2.5. ДНК-плоидность и выживаемость больных 158
4.4.2.6. Многофакторный анализ значимости ДНК-плоидности в прогнозе колоректального рака 167
Резюме 168
Глава 5. ДНК-плоидность опухолевых клеток важнейший прогностический показатель течения опухолевого процесса в ряду иных клинических прогностических признаков при некоторых злокачественных эпителиальных новообразованиях человека (обсуждение результатов) 169
Резюме 187
Выводы 189
Список литературы 191
- Метод проточной ДНК-цитометрии и принцип анализа ДНК-цитометрических кривых
- Проверка работоспособности алгоритма и программы на модельных примерах и в сравнении с другими программами
- ДНК-плоидность и пролиферативная активность и их связь с рецидивированием РМЖ
- ДНК-плоидность и стадия заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современный метод проточной цитомет-рии позволяет с высокой точностью на статистически достоверном материале измерить количество исследуемых веществ в клетках и их ядрах. В основе определения - измерение естественной люминесценции или люминесценции специальных красителей, избирательно связывающихся с изучаемыми веществами.
Отдельное место среди методов проточной цитометрии занимает ДНК-цитометрия. Своеобразие этого заключается в том, что содержание ДНК в нормальной жизнеспособной клетке не является постоянным, а зависит от фазы жизненного цикла клетки. При разных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке не всегда бывает одинаковым (диплоидным), но может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения (гипоплоидия) или чаще - в сторону увеличения (гиперплоидия). Последнее (гипердиплоидия, трип-лоидия, тетраплоидия и т.д) часто имеет место при злокачественном росте.
При анализе распределения нормальных клеток по содержанию ДНК учитывается как количество ДНК в покоящихся клетках (плоидность), так и изменения количества ДНК (вплоть до удвоения) в делящихся клетках. Поскольку при патологии высока вероятность одновременного присутствия в популяции нормальных (диплоидных) и патологически измененных (анеуплоидных) клеток, а также нормальных и измененных клеток, синтезирующих ДНК, очевидно, что анализ смеси таких субпопуляций является сложной математической задачей, осуществляемой с помощью специально разработанных программ.
ДНК цитометрические характеристики опухолевых клеток являются предметом самостоятельного изучения. Исследованиями указанным методом было показано, что далеко не все злокачественные опухоли характери-
зовались измененным кариотипом [Зубрихина, 1990]. Многие из них обладали диплоидным хромосомным набором, ДНК-цитометр.ически не отличавшимся от нормального. Разрешающая способность применяемого метода ДНК-цитометрии не позволяла отличить нормальный диплоидный ка-риотип от псевдодиплоидного. В последнем, несмотря на стандартное диплоидное количество ДНК, вероятны структурные перестройки хромосом. Кроме того, было показано, что перестройки в хромосомах могут также происходить на уровне отдельных генов, что, понятно, не может быть зарегистрировано путем суммарного определения ДНК в геноме клеток.
В последние годы получил признание способ прогнозирования течения опухолевого процесса на основании определения плоидности клеток в опухолевом узле. Подвергались изучению различные новообразования человека, их ДНК-цитометрические характеристики сопоставлялись с клиническими данными. В результате такого сопоставления для разных видов опухолей выявлены некоторые общие закономерности: диплоидные опухоли имели более благоприятное течение, чем анеуплоидные. Для ряда опухолей также были отмечены некоторые специфические особенности. Сопоставление с клиническими факторами прогноза показало высокую информативность показателя плоидности ДНК опухолевых клеток и позволило рассматривать его как независимый прогностический признак.
Литература последних лет содержит сведения о высокой информативности ДНК-плоидности опухолевых клеток при различных новообразованиях человека. Приведенные работы подчас противоречивы, не всегда выполнены на достаточном количестве наблюдений, что не позволяет в полном объеме судить о прогностической значимости определения ДНК-плоидности для онкологической клиники.
В настоящее время, несмотря на большое число работ, окончательного мнения не сложилось о прогностической значимости ДНК-цитометри-ческих данных при злокачественных опухолях молочной железы, головы и
шеи, легких и толстой кишки. Между тем, заболеваемость перечисленными раками имеем стойкую тенденцию к росту. Для решения вопроса о степени допустимой органосохранности необходимого оперативного вмешательства хирургу требуются прогностические данные. Клинические прогностические критерии (локализация, стадия, форма роста, распространенность и др.) достаточно хорошо изучены и преимущественно характеризуют состояние опухолевого процесса в настоящий момент. В то же время ДНК-цитометрические показатели, характеризующие биологические свойства опухолевых клеток, могут прогнозировать их поведение в будущем. Отсюда, актуальность темы определяется следующими соображениями.
Существующие способы (алгоритмы) математической обработки ДНК-цитометрических данных не всегда дают сопоставимые результаты. Большинство их сложно и требует мощного компьютерного обеспечения. Внедрение метода ДНК-цитометрии в клинику требует создания относительно простого метода расчета ДНК-цитограмм, правильно интерпретирующего клеточную кинетику и выдающего стандартизованные результаты.
Накопленные материалы ДНК-цитометрического изучения новообразований человека в недостаточной степени описывают изучаемые нами злокачественные опухоли. Опухоли указанных локализаций являются достаточно распространенными, их прогрессирование рано приводит к генерализации процесса и гибели больных. Поэтому является актуальным и важным изучение их биологических особенностей и их прогностической значимости с целью поиска объективных прогностических критериев опухолевого процесса.
Цели исследования: разработать метод компьютерного анализа ци-тометрических данных; применить разработанный метод для изучения ДНК-цитометрических характеристик опухолей молочной железы, головы и шеи, легких и толстой кишки человека; выработать и обосновать ДНК-цитометрические критерии прогноза течения изучаемых злокачественных новообразований человека.
Задачи исследования. Для достижения намеченных целей необходимо решить следующие задачи:
Разработать алгоритм математического анализа данных ДНК-гистограмм, полученных на проточном цитофлу ори метре 1СР-22.
Сравнить результаты ДНК-цитометрического анализа, полученного на основе разработанного алгоритма, с данными обработки иными способами.
Изучить ДНК-цитометрические характеристики (плоидность) больных раками молочной железы, головы и шеи, легкого и толстой кишки человека.
Сопоставить полученные показатели плоидности опухолей с клиническими (стадия заболевания, распространенность процесса, наличие местных и отдаленных метастазов, сроки послеоперационного рецидивирования и метастазирования, сроки выживаемости и др.) и патоморфологическими (форма роста, степень дифференцировки и др.) данными.
Сопоставить данные ДНК-цитометрии с клинической эффективностью примененного лечения (химиотерапия, лучевая или комбинированная терапия).
Провести многофакторный анализ и определить значимость ДНК плоидности в прогнозе изученных раков человека.
Научная новизна. Впервые в пределах РФ и СНГ разработаны новый алгоритм и программа анализа ДНК-цитометрических данных, позволяющие максимально близко к реальному вычислить в популяции долю ДНК синтезирующих клеток, выделить статистически значимо различающиеся субпопуляции, в едином стандарте охарактеризовать их плоидность.
Впервые с помощью разработанного алгоритма и программы были изучены ДНК-цитометрические характеристики и классифицированы по
плоидности новообразования молочной железы, головы и шеи, легкого и толстой кишки.
Впервые путем сопоставления полученных на основе разработанного алгоритма ДНК-цитометрических данных с материалами историй болезни и многофакторного анализа полученных данных определена клиническая значимости ДНК-плоидности в изученных опухолях. Показано, что ДНК-плоидность является одним из высокозначимых информативных прогностических признаков среди других клинических и морфологических критериев прогноза. Анеуплоидия опухоли является неблагоприятным показателем в прогнозе изученных нами новообразований.
Практическая значимость. Разработанный алгоритм и программа озволяет более точно классифицировать изучаемые новообразования по плоидности, что повышает уровень воспроизводимости прогноза. ДНК-плоидность является показателем биологических особенностей изученных нами раков человека.
Наши исследования показали, что анеуплоидные раки протекают в 2-3 раза более агрессивно, чем диплоидные. Плоидность ДНК изученных нами новообразований является важным и независимым, статистически значимым прогностическим фактором. В практической деятельности необходимо учитывать значения ДНК-плоидности при выборе метода лечения и последующих наблюдениях за пациентами.
Практическое использование ДНК-плоидности способствует выделению групп, нуждающихся в более интенсивном лечении, а также поможет оценке эффективности различных вариантов адьювантного и неадью-вантного лечения больных различными опухолями.
Публикации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на Республиканских и международных конференциях. По итогам исследований в журналах, сборниках и материалах конференций опубликовано 50 работ.
Метод проточной ДНК-цитометрии и принцип анализа ДНК-цитометрических кривых
Проточная ДНК-цитометрия применяется в различных областях науки, в том числе биологии и медицине. В последние годы распространение этого метода возросло, т.к. этот метод позволяет в короткие сроки после относительно несложного приготовления образцов исследовать и проанализировать статистически большой материал, состоящий из многих тысяч бактериальных и животных клеток. Проточная цитометрия имеет свои корни в цитологии. В 1934 г. Andrew Moldavan сделал первый шаг на пути к проточной цитометрии. Был изобретен прибор, считавший с помощью фотодетектора эритроциты и дрожжевые клетки.
Импульсная цитофотометрия является дальнейшим усовершенствованием цитофотометрического метода, предложенного в 1936 г. шведским исследователем Caspersson. Он использовал микроскоп с кварцевой оптикой для фотографирования клеток в ультрафиолетовом свете.
В 1940 г. для идентификации малигнизированных клеток были применены флюоресцентные красители. В разработке проточных цитометров большую роль сыграло применение фотодетектора в флюоресцентном микроскопе.
Crosslanaylor J. в 1953 г. создал первую модель проточного анализатора, суть которого заключалась в том, что исследуемые клетки вводились в середину движущегося потока жидкости. Создавался ламинарный поток, в котором поступающие клетки выстраивались в цепочку, окруженную током оболочечной жидкости. В 1965 г. Kamentsky разработал методику цитофотометрирования клеток в ламинарном потоке, проходящем через пучок ультрафиолетовых лучей. Разработка метода определения величины светопоглощения окрашенных клеток привела к созданию импульсной цитометрии, являющейся наиболее быстрым методом количественного анализа клеточной популяции.
В 1969 г. Dittrich W. и Goende W. предложили модель проточного автоматизированного импульсного цитометра в котором в качестве источника возбуждения флуоресценции окрашенных флуорохромами клеток используют ртутно-кварцевую лампу.
Схема работы проточных систем заключается в том, что окрашенные красителем - флуорохромом клетки с током жидкости проходят мимо детектора. Последний регистрирует величину люминесценции каждой клетки и передает образовавшийся электрический импульс в память многоканального анализатора. Величина электрического импульса пропорциональна количеству красителя, а количество связанного красителя в случае определения ДНК пропорционально количеству ДНК. Другими словами, величина регистрируемого импульса в каждом случае пропорциональна количеству ДНК в клетке. Зарегистрированные прибором импульсы анализируются и разбираются по уровню. В результате строится кривая распределения импульсов по величине. Поскольку величина каждого импульса пропорциональна количеству ДНК в клетке, полученная интегральная кривая является ничем иным как кривой распределения клеток по содержанию ДНК в изучаемой популяции.
В качестве источника излучения в современных проточных анализаторах применяют ртутно-кварцевые лампы и лазерные источники света. Последние имеют ряд преимуществ: большая плотность энергии и моно-хромность. Эти преимущества позволяют с большей разрешающей способностью измерить флуоресценцию красителей, связанных с нуклеиновыми кислотами или белками [Koss и соавт., 1989]. В качестве специфиче 14
ских красителей ДНК применяют митрамицин, пропидиум иодид, этидиум бромид, диамино-фенил-индол (DAPI), Hoechst 33258 и др. Митрамицин чаще применяют в комбинации с этидиум бромидом, поскольку последний является специфическим ДНК-интеркалятором, а митрамицин усиливает интенсивность флюоресценции комплекса ДНК-этидиум бромид. Наиболее специфические ДНК-красители, такие как Hoechst 33258 окрашивает нуклеотидную пару аденин-тимин, а хромомицин A3, окрашивающий нук-леотидную пару гуанин-цитидин, требуют очень высокой энергии излучения, что возможно только при свете лазерного луча.
При классификации клеток по содержанию ДНК их можно делить на покоящиеся (неделящиеся) и пролиферирующие (синтезирующие ДНК и делящиеся). Содержание ДНК в отдельно взятой клетке в норме не является постоянным, а зависит от функционального состояния и фазы жизненного цикла. В своем жизненном цикле клетка удваивает количество ДНК, после чего путем митоза делится на две новые клетки с нормальным диплоидным содержанием ДНК. В фазе G1/0 количество ДНК стабильно идет подготовка к синтезу новой ДНК. В фазе S происходит синтез ДНК и количество ее нарастает (удваивается) в пределах от 2 с (диплоидные) до 4с. В фазе G2/M завершается подготовка к делению, а клетки содержат удвоенный (тетраплоидный) набор ДНК (4с). В фазах G1/0 и G2/M клетки могут выходить из цикла, вступая в состояние покоя (R). Показано, что при разных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке (как и количество хромосом) у одного и того же организма не всегда бывает одинаковым (диплоидным). Оно может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения (гипоплоидия) или, чаще, в сторону увеличения (гиперплоидия). Последнее (гиперплои-дия, триплоидия, тетраплоидия) может иметь место при злокачественных новообразованиях различного генеза. Таким образом, при анализе распределения клеток по содержанию ДНК в популяции необходимо учитывать как количество ДНК в покоящихся клетках, так и циклические изменения количества ДНК (вплоть до удвоения), связанные с синтезом ДНК в делящихся клетках. При этом надо учитывать вероятность того, что при общей патологии, или только в патологических очагах высока вероятность одновременного присутствия нормальных (диплоидных), патологически измененных (анеуплоидных) клеток, а также нормальных клеток, синтезирующих ДНК [Петрова, Зубрихина, 1990]. Очевидно, что анализ смеси указанных субпопуляций является сложной математической задачей.
Проверка работоспособности алгоритма и программы на модельных примерах и в сравнении с другими программами
Задача настоящей части исследования - разработка метода математического (компьютерного) анализа результатов ДНК-цитометрических измерений, производимых на проточном цитофлуориметре ICP-22 и регистрируемых прибором в виде интегральных кривых распределения клеток по содержанию ДНК. Основная задача включала в себя: разработку алгоритма математического анализа ДНК-цитометрических данных для создания компьютерной программы. сравнение результатов ДНК-цитометрического анализа, получаемых с помощью разработанного алгоритма, с данными обработки ДНК-цитометрических кривых другими способами, а также путем прямого (экспериментального) определения числа (доли) ДНК-синтезирующих и пролиферирующих клеток.
Для решения указанных задач, наряду с научными было необходимо решить ряд технических задач. Примененный нами проточный цитофлуо-риметр ICP-22 выдает только аналоговые данные в виде поканальной цифровой распечатки и интегральной кривой. Прибор не оснащен ЭВМ. Поэтому одна из технических задач состояла в стыковке цитофлуориметра ICP-22 и ЭВМ в единый комплекс. Разработанное на базе нашего алгоритма программное обеспечение указанного комплекса должно было предусматривать, наряду с автоматическим вводом в ЭВМ данных измерений, также ручной ввод с клавиатуры начальных параметров измерений. В состав комплекса с цитофлуориметром ICP-22 использовали ЭВМ IBM-PS/2 или IBM-AT28 [Б.Н.Басов и соавт., 1987].
В основу алгоритма заложен принцип нормального распределения клеток в локальных максимумах (пиках) кривой, например во фракциях GO/1, G 2/М и др. (рис 1). Пределы поиска месторасположения пиков на кривой распределения не лимитированы, что позволяет вести свободный поиск таких локальных максимумов (пиков) по всей длине кривой. При математической обработке кривой был применен метод предварительного сглаживания данных по 7 точкам, что вместе с вычитанием 1% базового шума позволило избавиться во всех каналах от инструментальных шумов. Способом математического моделирования нами было показано, что при сглаживании по избранным 7 точкам уровень средних ошибок был наименьшим.
По результатам анализа банка данных была принята длина участка поиска локальных максимумов (пиков) равная 21 каналу. Каждый найденный максимум (пик) принимался сначала за центр локальной зоны шириной в 2 средних квадратических отклонения (2а). Полученная предварительная таблица локальных зон подвергалась анализу на взаимное перекрытие. В случаях их перекрытия меньший по значению максимум поглощался большим.
Эксперименты показали, что при многократных измерениях ДНК-цитограмм нормальных лимфоцитов человека, принятых за диплоидный (внешний) стандарт, вершина 1-го пика с 95% вероятностью приходилась на 185+10 каналов прибора, что в единицах плоидности ИДНК вычисляется как отношение реального номера канала 1-го пика к стандартному каналу плоидности, т.е. в пределах 0,94-1,06. С учетом литературных данных значение ИДНК плоидности для диплоидных клеток были уточнены и приняты равными 0,94-1,1.
Принцип построения алгоритма математического анализа кривых распределения клеток по содержанию ДНК
По причине выработки ФЭУ прибора вершина 1-го пика внешнего стандарта (лимфоцитов) со временем слабо мигрировала в сторону нарастания номера канала, месторасположение которого периодически проверялось. Плоидность (ИДНК) 2-го, 3-го и др. найденных пиков рассчитывали по отношению к 1-му среднестатистическому пику (РО) (Рис.1)
Площади под распределениями G0/1 и G 2/М - фракций клеток вычисляли с учетом 95% вероятности в пределах 2 средних квадратических отклонений. Значение асимметрии площадей пиков не учитывали. Число каналов S-фазных клеток (переходная зона) подсчитывали как разность между левой границей 2-й зоны и правой границей 1-й зоны. При наличии 3-х и более пиков (до 6) переходные зоны между ними вычисляли аналогично.
Алгоритм предусматривает вычисление стандартизированной величины (в %) G0/1 фракции (1-я зона), S-фракции (промежуточная зона), G2/M фракции (2-я зона), промежуточной зоны Р (между 2-й и 3-й зоной), 3-й зоны и т.д. и остатка. Для всех максимумов (зон) предусмотрено вычисление коэффициента вариации (cv).
ДНК-плоидность и пролиферативная активность и их связь с рецидивированием РМЖ
Содержание ДНК тесно связано с течением заболевания. Ewers и соавт., (1984), анализируя содержание ДНК в 639 случаях РМЖ показали, что частота рецидивирования у больных анеуплоидными РМЖ 1-ІI стадий заболевания была в 2 раза выше, чем у больных диплоидными и тетрапло-идными РМЖ. По данным ряда авторов частота рецидивирования и выживаемость больных РМЖ достоверно коррелировала с ДНК-плоидностью опухоли при многофакторном анализе [Corneliss и соавт., 1984; Coulson и соавт., 1984; Torad и соавт., 1986]. Arnerlov и соавт., (1988) изучали ДНК-плоидность методом микроспектрофотометрии 91 случай местнораспрост-раненного РМЖ, наблюдавшихся 4 года после мастэктомии. Авторы не нашли рецидивов у 72% больных диплоидными РМЖ и у 43% больных анеуплоидными РМЖ. Noguchi и соавт., (1992) обнаружили высокий ИДНК у 207 больных инвазивным РМЖ III-IV стадии с метастазами в ак-силлярные и внутренние лимфоузлы. Больные без метастатических поражений аксиллярных лимфоузлов имели хороший прогноз. Чиквашвили (1993) не наблюдал различий в частоте метастазирования в начальных стадиях заболевания (32,4% и 37,5% для диплоидных и анеуплоидных РМЖ соответственно). В III стадии РМЖ анеуплоидия являлась плохим прогностическим признаком. При этом среди больных анеуплоидными РМЖ про-грессирование отмечалось в 74,3%, а у больных диплоидными новообразованиями в 5,1% при сроке наблюдения 36-98 мес. Pfisterer и соавт., (1995) отмечали, что анеуплоидия увеличивалась с числом пораженных метастазами лимфоузлов. Подобная связь между анеуплоидией и частотой рецидиви-рования и метастазирования продемонстрирована в работах Гуляк и соавт., (1996); Ottesen и соавт., (1996); Uner и соавт., (1997); Бычкова и соавт., (1998); Pinto и соавт., (1999); Jaszcz-Gruchala и соавт., (2001).
Hatschek и соавт., (1994) изучали 85 случаев РМЖ у мужчин и считают, что ДНК-плоидность не коррелировала со статусом лимфоузлов. Machado Santelli и соавт., (1994) на 193 случаях РМЖ отметили, что анеуплоидия возрастала в поздних стадиях заболевания. Но так же как и предыдущие авторы не нашли связи между ДНК-плоидностью, статусом лимфоузлов и метастазированием.
Wenger и соавт., (1993) на большом материале показали, что анеуплоидия с увеличенной долей клеток в S-фазе коррелирует с размером опухоли и метастазами в подмышечные лимфатические узлы. По их данным плоидность и доля S-фазных клеток в сочетании с гистологическими характеристиками могут предсказать дальнейшее течение опухолевого процесса. Полученные предыдущими авторами сведения подтверждены данными Naguib и соавт., (1999); Bagwell и соавт., (2001). Тем не менее, некоторые авторы [Stal и соавт., 1994; Witzig и соавт., 1994; Dressier, 1993; Mansou и соавт., 1994; Camplijon и соавт., 1995; Hatschek и соавт., 1994; al-Alwan, 2000] считают, что частота рецидивов и метастазов не коррелирует с ДНК-плоидностью опухоли, а зависит от доли клеток в S-фазе. Michels и соавт., (2000); Arnerlov и соавт., (1992) пришли к выводу, что плоидность не коррелирует с прогнозом. При многофакторном анализе выявлено, что доля пролиферирующих (S) клеток была независимым фактором прогноза только при наличии метастазов в подключичные лимфоузлы у больных РМЖ II и III стадиями. По данным Winter и соавт., (1994) безрецидивный период был коротким, если доля пролиферирующих клеток была, была больше 10%. Stal и соавт., (1993) показали увеличение уровня S клеток при опухолях, размер которых был больше 11 мм. По их данным, если доля S-фазных клеток была менее 10%, то безрецидивный период был в три раза дольше, чем при более высоких показателях числа S-клеток. Тем не менее, по данным Basari и соавт., (1992); Witsig и соавт., (1993); Meyer и соавт., (1994); Elledge и соавт., (1940); Brooks и соавт., (1993); De-lene и соавт., 1993; Lonn и соавт., 1994; Pfisterer и соавт., (1995); Romain и соавт., (2001); Prasad и соавт., (2001) плоидность и величина фракции пролиферирующих клеток не коррелировали с клинико-патологическими характеристиками опухолевого процесса.
Связь ДНК плоидности с чувствительностью к проводимым лечебным мероприятиям
Некоторые исследователи показали, что плоидность может служить показателем чувствительности опухолей к химио- и лучевой терапии. По данным Dressier и соавт., (1993), Robertson и соавт., (1994) анеуплоидные опухоли были более чувствительны к указанному лечению, чем диплоидные. Имеются сведения о том, что изменения плоидности и фракции S-клеток не предсказывали ответа к проводимой химиотерапии. При этом отмечают, что диплоидные РМЖ достоверно чаще (р=0,04) отвечали на лечение (Chang и соавт., 2000). По наблюдениям Чхиквадзе и соавт., (2001) 5- и 7-летняя выживаемость различалась в группах больных диплоидными РМЖ, леченными по разным схемам (неоадьювантное лечение с адриами-цином, химиотерапия по схеме CVF и Купера и без предоперационной химиотерапии). Выживаемость была лучше у больных, получавших неоадьювантное лечение с адриамицином по сравнению с другими схемами.
Представляют интерес сведения о том, что плоидность первичной опухоли и метастазов в лимфоузлы могут различаться (Зубрихина, 1990; Николаева, 1994; Kung и соавт., 2000). По данным Зубрихиной (1990) изучение содержания ДНК проводилось на 36 доказанных случаях (морфологически) метастазов РМЖ. У 10 больных первичная опухоль была диплоидной по содержанию ДНК, у 26 - анеуплоидной. Метастазы анеуплоидных первичных опухолей также содержали анеуплоидную линию клеток, которая в большинстве случаев (20) имела тот же ИДНК, что и первичная опухоль. У двух больных первичная опухоль содержала 2 линии анеуплоидных клеток, которые обнаружены и в метастазе. В 6 случаях ИДНК первичной опухоли и метастаза не совпадали, в 4 наблюдениях незначительно. Alam и соавт., (1992) также отметили несовпадение содержания ДНК в 25 первичных РМЖ и их метастазах в лимфоузлы. Анеуплоидные первичные РМЖ наблюдались в 6 случаях метастатических РМЖ. Tsutsui и соавт., (2002) сравнивали содержание ДНК в первичных опухолях и синхронных метастахах в лимфоузлы и рецидивах. Совпадение содержания ДНК в последних составило 77% и 71%.
ДНК-плоидность и стадия заболевания
Wong и соавт., (1996) сообщили о статистически значимых различиях в 5 летней выживаемости 70 больных диплоидными и анеуплоидными раками слизистой оболочки полости рта. Gomez и соавт., (1992) изучали содержание ДНК в 38 раках языка и обнаружили статистически значимую корреляцию ДНК-плоидности и выживаемости при однопараметровом анализе (р=0,01), но не выявили такой значимости при многофакторном анализе. Tytor, Olofsson, (1992) сообщили о статистически значимой прогностической взаимосвязи (р 0,005) ДНК-плоидности и выживаемости у 176 больных плоскоклеточными раками слизистой оболочки полости рта. Zhao и соавт., (1995) провели многофакторный анализ прогностической значимости таких клинических факторов прогноза как стадия заболевания, метастазы в лимфатические узлы, выживаемость и плоидность. В результате анализа была продемонстрирована независимая прогностическая значимость ДНК-плоидности в 67 случаях плоскоклеточных раков языка . Плоидность ДНК оказалась прогностическим фактором безрецидивной выживаемости, независимым от других проанализированных клинико-патологи-ческих характеристик после проведения многовариантного анализа данных 73 больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта I—II стадий [Mishra, Mohanty, 1996]. Hemmer и соавт., (1997) оценивали значимость ДНК-плоидности для прогноза выживания 93 первичных больных раком слизистой оболочки полости рта с метастазами в регионарные лимфоузлы. 5-летняя выживаемость больных диплоидными опухолями существенно отличалась от таковой больных анеуплоидными опухолями - (87,0% и 31% при р 0,001). У больных диплоидными опухолями рецидивы выявлялись в единичных случаях, а у больных анеуплоидными опухолями последние обнаруживались в 55%. Пятилетняя выживаемость анеуплоидных больных с рецидивами (без метастазов в лимфоузлы) была достоверно лучше, чем у больных с метастазами в лимфоузлы (41% и 26%). Авторы высказывают мнение о том, что благоприятному прогнозу больных диплоидными опухолями способствовало радикальное удаление рецидивов, если оно проводилось до возникновения анеуплоидной линии клеток в удаляемом диплоидном рецидиве. Кроме того отмечают, что, по-видимому, анеуплоидные линии клеток обладают свойствами, способствующими инвазии и метаста-зированию. При этом авторы подчеркивают высокую информативность ци-тометрического определения содержания ДНК в опухолевых клетках, которая все чаще используется как часть диагностической процедуры. Бычкова и соавт., (1998) подтвердили значимую корреляцию ИДНК с выживаемостью 49 больных раками слизистой оболочки полости рта.
Многофакторный анализ клинических показателей прогноза и данных о плоидности ДНК проведен в работе Bueno и соавт., (1998). Регрессионный анализ продемонстрировал, независимую прогностическую значимость ДНК-плоидности в прогнозировании развития рецидива и выживаемости (р 0,001) 93 больных плоскоклеточными раками орофарингеаль-ной области. По полученным Hemmer и соавт., (1999) данным плоидность ДНК и наличие локальных метастазов в лимфатическме узлы предопределяют безрецидивную выживаемость. В группах больных без вовлечения лимфатических узлов ДНК-плоидность является прогностическим статистически достоверным и независимым фактором общей и безрецидивной выживаемости при многофакторном анализе данных 429 больных раками слизистой оболочки полости рта.
Однако в литературе представлена и противоположная точка зрения Farrar и соавт., (1989), анализируя данные о 60 больных плоскоклеточными раками языка не отметили корреляции между плоидностью и выживаемостью. Zatterstrom и соавт., (1991) в результате многофакторного анализа клинических показателей прогноза выживаемости и ДНК-плоидности при раках головы и шеи показали, что ДНК-плоидность не оказывала влияния на выживаемость. Аналогичный анализ был выполнен на материале 80 больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта Beltrami и соавт., (1992). Достоверность показателя ДНК-плоидности в этом исследовании не была статистически значимой. Bimgaard и соавт., (1992) не нашли корреляции между ДНК-плоидностью и выживаемостью 78 больных раком слизистой оболочки полости рта. Cooke и соавт., (1994) сообщили об отсутствии прогностической значимости ДНК-плоидности при анализе выживаемости 81 больного раком языка. В исследовании King и соавт. (1995) выживаемость 34 больных раком языка не была связана с плоидностью ДНК.
Подводя итоги рассмотрения исследований, посвященных ДНК-цитометрическому изучению опухолей орофарингеальной области и сопоставлению их результатов с клинико-морфологическими показателями, необходимо отметить следующее. За последнее десятилетие накоплен большой материал, свидетельствующий о прогностической значимости ДНК-цитометрических параметров опухолевых клеток. Многими авторами, применительно к разным локализациям эпителиальных новообразований, было показано, что диплоидные опухоли являются прогностически более благоприятным, чем анеуплоидные. Что касается эпителиальных опухолей орофарингеальной области, являющихся объектом нашего исследования, они менее изучены по сравнению с другими опухолями. По имеющимся данным, на эти опухоли также распространяются основные закономерности, касающиеся прогностической значимости ДНК-цитометрических характеристик опухолевых клеток. Тем не менее, ряд моментов требует специального изучения и уточнения.
