Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы "Маркеры метилирования ДНК в опухолях человека" 6-27
1.1. Введение 6-7
1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов 7-17
1.3. Профиль гиперметилированных генов в опухолях 17-22
1.4. Методы определения статуса метилирования CpG-динуклеотидов в ДНК 22-24
1.5. Использование маркеров метилирования ДНК в клинической практике 24-27
Глава 2. Материалы и методы исследования 28-42
2.1. Список использованных реактивов 28-29
2.2. Клинические материалы 30
2.3. Клеточные линии 30
2.4. Обработка клеточных линий деметилирующим агентом 30
2.5. Выделение ДНК 31-32
2.5.1. Одновременное выделение ДНК и РНК 31
2.5.2. Выделение ДНК из лейкоцитов 31-32
2.6. Выделение плазмидной ДНК 32
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 32
2.6.2. Выделение плазмидной ДНК на колонках 32
2.7. Обработка ДНК рестриктазами 33
2.8. Бисульфитная конверсия ДНК 33-34
2.8.1. Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 33-34
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах 34
2.9. Полимеразная цепная реакция 34-37
2.9.1. Праймеры 35
2.9.2. Метилчувствительная П1ДР 36
2.9.3. Метилспецифическая ПЦР 36-37
2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК после бисульфитной конверсии 37
2.10.1. Препаративное получение продукта ПЦР 37-38
2.10.2. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозных гелях 38
2.10.3. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 38-39
2.10.3.1. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на колонках 38
2.10.3.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на DEAE-целлюлозе 38-39
2.11. Клонирование продуктов ПЦР 39-40
2.11.1. Описание плазмид, использованных в работе в качестве вектора 39
2.11.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 39-40
2.11.3. Трансформация клеток Escherichia coli 40
2.12. Блот-гибридизация 40 2.12.1. Получение препаратов ДНК, меченных Р32 40-41
2.13. Реакция обратной транскрипции 41-42
Глава 3. Результаты: 43-62
3.1. Анализ метилирования CpG-островка гена RAR-/32 в опухолях шейки матки 43-49
3.2. Анализ метилирования CpG-островка гена ТІМР-2 в опухолях шейки матки 50-63
3.2.1. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом блот гибридизации по Саузерну 50-52
3.2.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МЧ ПЦР 52-56
3.2.3. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом секвенирования ДНК после бисульфитной конверсии 57-59
3.2.4. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МС ПЦР 59-61
3.2.5. Влияние деметилирующих агентов на экспрессию TIMP-2 61-63
3.2.6. Сравнение частоты метилирования генов TIMP-2 и TIMP-3 в опухолях шейки матки 63
3.3. Определение статуса метилирования TIMP-2 в опухолях молочной железы 63-65
3.4. Профиль метилирования генов в опухолях шейки матки 65-69
Глава 4. Обсуждение 70-75
Выводы 76
Список литературы 77-92
- Профиль гиперметилированных генов в опухолях
- Полимеразная цепная реакция
- Анализ метилирования CpG-островка гена RAR-/32 в опухолях шейки матки
- Анализ метилирования CpG-островка гена ТІМР-2 в опухолях шейки матки
Введение к работе
В качестве объекта исследования в работе использовали одну из наиболее распространенных форм опухолей - рак шейки матки. По частоте заболеваемости, и смертности рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска» (HPV 16, 18 и родственные им, WHO, Press Release, 1996). Период от начала инфекции до возникновения опухоли может занимать несколько лет. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании клеточных генов, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических событий (мутаций), так и вследствие эпигенетических изменений (наследуемых при делении клетки изменений, не связанных с изменением последовательности ДНК). К эпигенетическим изменениям, часто наблюдаемым в опухолях всех типов, относятся нарушения паттерна метилирования ДНК. Гиперметилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках они, как правило, не метилированы. Метилирование промоторов и первых экзонов генов сопровождается подавлением их транскрипции. Таким образом, гиперметилирование 5' регуляторных районов приводит к таким же последствиям для функций генов, как и инактивирующие мутации. Исследования последних лет показали, что опухоли разных типов отличаются по набору генов, инактивируемых вследствие гиперметилирования. В связи с этим необходимо выявление маркеров аберрантного метилирования для каждого типа опухолей.
Выявление генов - потенциальных маркеров аберрантного метилирования кардинальным образом расширяет список генов, вовлеченных в канцерогенез, что в свою очередь расширяет возможности для молекулярного подхода к диагностированию, мониторингу и прогнозированию течения заболевания.
Цель настоящей работы: идентификация генов, инактивированных в опухолях шейки матки, вследствие гиперметилирования промоторов.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1) Определить частоту метилирования в опухолях шейки матки гена рецептора
ретиноевой кислоты RARJ3-2;
Выяснить, связано ли наблюдаемое в опухолях шейки матки подавление экспрессии гена TIMP-2 (тканевой ингибитор металлопротеиназ 2) с метилированием 5*области гена;
В случае обнаружения метилирования определить район 5' области гена TIMP-2, метилирование которого коррелирует с подавлением транскрипции;
Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в опухолях шейки матки;
Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в другой форме эпителиальных опухолей — раке молочной железы.
Профиль гиперметилированных генов в опухолях
По мере исследования статуса метилирования многих известных генов и выявления новых генов, дифференциально метилированных в опухолевых и нормальных клетках, стало очевидно, что аберрантное метилирование промоторного района является широко распространенным механизмом инактивации генов в опухолях всех форм. Для ряда опухолей было показано, что нарушение метилирования не ограничивается одним геном, а может затрагивать одновременно несколько известных генов, повреждение функций которых существенно для развития опухолей. В последнее время были разработаны методы, позволяющие вести анализ CpG-островков отдельно от остальной части ДНК и одновременно дискриминировать метилированные и неметилированные CpG-островки. С помощью одного из таких методов было проведено масштабное исследование аберрантного метилирования в семи различных типах опухолей (Costello et al, 2000). В общей сложности было исследовано около 100 опухолей и нормальных тканей и в каждой из них более 1000 случайно отобранных CpG-островков, ассоциация которых с конкретными генами не была известна. По числу гиперметилированных CpG-островков исследованные опухоли разделились на две группы с относительно высокой и низкой частотой метилирования. Было установлено, что метилирование CpG-островков проявляет, с одной стороны, определенную опухолевую специфичность (т.е. существуют CpG-сайты, метилированные во многих опухолях разной локализации и неметилированные в норме), и, с другой стороны, некоторую специфичность по отношению к разным видам опухолей (т.е. некоторые CpG-сайты метилированы в одних опухолях и не метилированы в других). По оценкам, сделанным авторами, из 45000 CpG-островков, имеющихся в геноме человека, одновременно гиперметилированными могут оказаться в среднем 600 с довольно широким разбросом - от 0 до 4500 в отдельных опухолях. Таким образом, нарушение регуляции метилирования CpG-островков носит общий характер в опухолевых клетках. Возможно, что не все гиперметилированные CpG-островки из этого числа окажутся ассоциированными с генами, вовлеченными в канцерогенез, но и в этом случае, очевидно, что аберрантное метилирование 1-10% CpG-островков в клетке должно приводить к фенотипической нестабильности и нарушению экспрессии многих генов. В этой работе при масштабной оценке статуса метилирования анонимных CpG-островков, выявились закономерности, которые хорошо согласуются с данными многочисленных исследований профилей гиперметилированных генов в опухолях. В этих работах исследовали частоту метилирования большого числа известных маркеров метилирования (от 6 до 25 генов) в различных формах опухолей. Было обнаружено, что наряду с общими для разных форм опухолей маркерами метилирования (INK4A, Е-кадхерин(С)Я7), MGMT, И4Р-киназа и другие) существуют гены, которые метилирваны с высокой частотой в одной или нескольких формах опухолей (GST-ж-І, в опухолях простаты и печени, Rb - в спорадических ретинобластомах, АРС (от англ. Adenomatous polyposis coli protein) - в опухолях пищевода) (Toyota et al, 1999; Esteller et al, 2001; Kawakami et al, 2000; Eads et al, 2000). Более того, показано, что разные гистологические типы опухолей одной локализации отличаются друг от друга по профилю маркеров метилирования. Так, частота метилирования АРС в аденокарциномах и плоскоклеточных карциномах шейки матки различаются более чем в 4 раза (Dong et al, 2001, табл 2). Различаются между собой по профилю метилированных генов первичные карциномы и линии клеток мелкоклеточного и немелкоклеточного раков легкого (Toyooka et al, 2001; Virmani et al, 2002), а также карциноиды и эндокринные опухоли поджелудочной железы (Chan et al, 2003), почечноклеточные карциномы и опухоли Вилмса (Morris et al, 2003). Таким образом, аберрантное метилирование промоторов генов в опухолевых клетках возникает, по-видимому, не случайным образом, а в какой-то мере зависит от принадлежности клетки к определенному типу ткани.
Опухоли одного гистогенеза различаются между собой по числу одновременно метилированных генов. Для опухолей, в которых наблюдается метилирование сразу нескольких генов-супрессоров (до 4-6) было введено понятие «метиляторный» фенотип (CIMP+ от англ. CpG island methylator phenotype). Среди опухолей одной локализации и гистогенеза, обычно одновременно присутствуют группы опухолей CIMP+ и CIMP-, (ни один из исследованных маркеров не метилирован или метилированы единичные маркеры) (Toyota et al, 1999; Toyota et al, Cancer Res, 1999). Причины, определяющие «метиляторный» фенотип опухоли, неизвестны. Появилась только одна публикация, в которой было показано, что пациенты с опухолями толстого кишечника, характеризующимися «метиляторными» фенотипом, достоверно чаще происходили из семей, с отягощенной онкологической наследственностью, чем пациенты, в опухолях которых ни один ген не был метилирован (Frazier et al, 2003). Эта публикация - первое указание на возможную генетическую предрасположенность больных к системному нарушению метилирования в опухолевой клетке
Полимеразная цепная реакция
модификации амплифицировали с использованием набора праймеров, не содержащих в своем составе CG нуклеотидов, на втором этапе использовали метилспецифичные праймеры в двух вариантах: 1) CG-динуклеотиды в составе праймеров заменены на TG (специфичны для неметилированного варианта матрицы); 2) CG-динуклеотиды присутствуют в составе праймеров метилированы (специфичны для метилированного варианта матрицы). Для RAR-ffo реакцию на первом этапе проводили в конечном объеме 50 мкл в v следующих условиях: 1 буфер для ПЦР, 1,0 мМ MgCb, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид-трифосфатов, 20 пмоль каждого праймера и 1 ед. акт. Taq ДНК полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия). Амплификацию проводили при следующем режиме: 94С-2мин; 35 циклов: 94С-15сек, 53 С-15сек, 72С-30сек; 72С-5мин Второй этап проводился по схеме, аналогичной первому, но с добавлением 10% глицерина. Амплификация проходила в следующем режиме: 94С-2мин; 35циклов: 94С-30сек, 58С-30сек, 72С-30сек; 72С-5мин-для метилированных праймеров. 94С-2мин; 40циклов: 94С-30сек, 50С-30сек, 72С-30сек; 72С-5мин-для неметилированных праймеров. Для TIMP-2 реакцию на первом этапе проводили в конечном объеме 50 мкл в следующих условиях: Iх буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCb, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид-трифосфатов, 20 пмоль каждого праймера и 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия) в присутствии 8% глицерина. Амплификацию проводили в следующем режиме: 94С-2мин; 35циклов: 94С-15сек, 52С-15сек, 72С-30сек; 72С-5мин. Второй этап проводился в условиях «горячий старт». Амплификацию проводили в следующем режиме: 94С-Змин; ЗОциклов: 94С-30сек, 67С-20сек, 72С-20сек; 72С-5мин-для метилированных праймеров. 94С-Змин; ЗОциклов: 94С-30сек, 64С-20сек, 72С-20сек; 72С-5мин-для неметилированных праймеров. 2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК после бисульфитной конверсии Для определение статуса метилирования всех CpG-динуклеотидов в исследуемом районе гена TIMP-2, получали фрагменты ДНК гнездовой и полугнездовой ПЦР, используя конвертированную биульфатом натрия ДНК в качестве матрицы и набор праймеров, не содержащих CG-динуклеотидов (табл 4). Затем проводили сиквенс как суммарного продукта ПЦР, так и индивидуальных клонов этого же продукта ПЦР после клонирования в бактериальном векторе на автоматическом секвинаторе в НИИ Молекулярной биологии им. Энгельгарда, Россия. 2.10.1. Препаративное получение продукта ПЦР. Для TIMP-2 (гнездовая ПЦР) реакцию на первом этапе проводили в конечном объеме 50 мкл в следующих условиях: Iх буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCh, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид-трифосфатов, 20 пмоль каждого праймера и 2,5 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия) в присутствии 8% глицерина. Амплификацию проводили при следующем режиме: 94С-2мин; 35циклов: 94С-30сек, 54С-30сек, 72С-30сек; 72С-5мин. Второй этап проводился по той же схеме со сменой одного или обоих праймеров. Амплификацию проводили в следующем режиме: 94С-2мин; 35циклов: 94 С-30сек, 52С-30сек, 72С-30сек; 72С-5мин - для гнездовой ПЦР.
Анализ метилирования CpG-островка гена RAR-/32 в опухолях шейки матки
Белковый продукт гена RAR-P2 - является одним из ядерных рецепторов ретиноевой кислоты (RA) (см. обзор литературы). К началу нашего исследования была известна только одна работа, в которой было описано снижение уровня мРНК RAR-P2 в некоторых опухолях шейки матки по сравнению с нормальными тканями (Comerci JT, 1997). В предварительных экспериментах в лаборатории молекулярной биологии вирусов было подтверждено, что в 12 из 25 (40%) карцином шейки матки уровень мРНК RAR-(52 значительно снижен. Практически полное отсутствие мРНК наблюдалось в трех клеточных линиях HeLa, SiHa, CaSki. Для выяснения вопроса, не является ли метилирование промотора причиной дефицита мРНК, вначале мы исследовали статус метилирования RAR-f52 в этой группе опухолей двумя независимыми методами: Саузерн-блот гибридизацией с использованием метилчувствительных рестриктаз и метил-специфической ПЦР - МС ПЦР (Herman et al, 1996). Расположение сайтов метил-чувствительной рестриктазы НраІІ в промоторной области и первом, транскрибируемом экзоне гена RAR-/12, а также размеры фрагментов, которые могут получаться в случаи метилирования сайтов рестриктазы представлены на рис 3. На рисунке 4 представлены результаты типичного анализа метилирования промоторной зона гена RAR-/32 методом гибридизации по Саузерну. H6 Рестрикционная карта района промотор-экзон гена RARfi-2 для метил-чувствительного фермента НраІІ. Жирной линией показана ДНК-фрагмент 680п.н. Ожидаемые фрагменты ДНК в случае метилирования сайтов Н1-Н5 указаны в нижней части карты. Старт транскрипции указан кривой стрелкой. Позиции праймеров для МС ПЦР (F-bis; R-bis; F-m,u; R-m,u) указаны стрелками. Фрагмент 146п.н. - это продукт амплификации со специфическими метилированными и неметилированными праймерами (F-m,u; R-m,u) в МС ПЦР. Треугольником показано расположение в промоторном районе двух RAREs (retinoic acid response elements). Цифры в скобках - позиции сайтов рестриктазы НраІІ по отношению к старту транскрипции в п.н. Контрольная обработка ДНК рестриктазой Mspl (сайт узнавания такой же, как у НраІІ, но разрезается ею независимо от статуса его метилирования) дает только одну полосу 1,1х103 п.н. (рис. 4; дорожки 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15). Отсутствие этой полосы, а также полос размером от 1,15х103до 1,6х103п.н. указывает на то, что сайты НраІІ с 1 по 5 метилированы (рис. 4; дорожки 8, 10, 12, 14, 16). Присутствие полосы 1,1х103 п.н. и отсутствие дополнительных полос указывает на то, что эти сайты НраІІ неметилированы (рис. 4; дорожки 2,4, 6).
Гибридизацией по Саузерну, было показано, что в анализируемых карциномах с дефицитом мРНК все исследуемые сайты рестриктазы НраІІ метилированы, также как и в двух клеточных линий HeLa и SiHa. Таким образом, снижение или отсутствие мРНК RAR-/32 коррелирует с наличием метилированиия промотора и 1 экзона гена. Метилирование исследуемого района отсутствовало в большинстве случаев морфологически нормальных тканей, прилегающих к опухоли, однако в одном случае было выявлено метилирование гена в прилегающей нормальной ткани (рис. 4; дорожки 1,2).
Те же образцы ДНК анализировали методом МС ПЦР, который позволяет работать на небольших количествах ДНК (50нг) и обнаруживает метилированные и неметилированные аллели после обработки ДНК бисульфитом натрия. Наличие в опухолевом образце нормальных клеток (фибробластов, клеток крови и нормального эпителия) не препятствует выявлению метилирования. Чувствительность метода такова, что позволяет обнаружить один метилированный аллель на 103 неметилированных. (Herman et al, 1996). Результат такого анализа с использованием набора праймеров к фрагменту ДНК в 146 п.н. (в области 4 и 5 сайта НраІІ), представлен на рис 4. Праймеры позволяют анализировать статус метилирования 6 CpG- динуклеотидов в этом районе. Наличие продукта в реакции с праймерами, специфичными к метилированной последовательности (М), указывает на метилирование исследуемого района (рис 5; образцы 4430, 2820, 2340, 2860). Отсутствие этого продукта указывает на отсутствие метилированных аллелей (рис 5; 286Н, 444Н, 4440). Наличие продукта амплификации с праймерами к неметилированной последовательности (Н) служит контролем на присутствие и полноту конверсии ДНК бисульфитом натрия в случае отсутствия амплификации в реакции со специфическими метилированными праймерами. Наличие продукта в реакции амплификация только с праймерами, которые специфичны для неметилированной последовательности, указывает на то, что этот район неметилирован. Следует заметить, что во всех опухолевых образцах, выявленных, как 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 4,.:,.
Блот гибридизовали ДНК-пробой размером 680п.н. меченой 32Р; жирной стрелкой показан минимальный фрагмент 1,1 х103п.н, узнаваемый этой пробой. Дорожки 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 - это ДНК, обработанные рестриктазой неметилчувствительной Mspl; дорожки 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16- это ДНК, обработанная метилчувствительной рестриктазой НраІІ; дорожки 1,2- ДНК 439, норма; 3, 4 - ДНК 439, опухоль; 5,6-ДНК 409, норма, 7, 8 - ДНК 409, опухоль; 9, 10 - SiHa; 11,12- CaSki. 4430 2820 2340 286Н 2860 444 Н 4440 Мр Рис. 5. Анализ статуса метилирования 5 области гена RAR /32 в опухолях шейки матки методом метилспецифической ПЦР. Н - морфологически нормальные ткани и О - опухоли шейки матки; Мр - маркер. ДНК обработана бисульфитом натрия и амплифицирована с метилированными праймерами - (М) и неметилированными праймерами - (Н). Стрелка справа от рисунка указывают размер продукта ПЦР в парах нуклеотидов. метилированные, присутствует почти всегда и продукт со специфическими неметилированными праймерами, что связано, как указано выше, с присутствием в опухоли нормальных клеток. Обе пары метил-специфических праймеров (метилированные и неметилированные) не давали продукта амплификации с ДНК, не обработанной бисульфитом натрия (данные не представлены). Результаты анализа МС ПЦР подтвердили метилирование 5 области гена RAR-P2 в опухолях со сниженным уровнем экспрессии мРНК и во всех трех негативных по RAR-/32 клеточных линиях (HeLa, SiHa и CaSki); а также отсутствие метилирования в этой области в остальных образцах ДНК с нормальным уровнем экспрессией (таблица 5). По результатам анализа двумя методами метилирование 5 области гена RAR-02 было обнаружено в 12 из 25 опухолей и в 3 из 3 исследованных клеточных линий. Метилирование RAR-p2 отсутствовало в ДНК из лейкоцитов больных (0 из 13 случаев) При этом метилирование гена коррелирует со снижением уровня мРНК RAR-02 в опухолях и клеточных линиях. Метилированные аллели гена RAR-/32 отсутствуют в морфологически нормальных тканях, прилегающих к опухоли, за исключением 3 образцов (1 случай выявлен по Саузерну и 2 по МС-ПЦР). Обнаружение метилированных аллелей RAR-@2 в тканях без морфологических признаков трансформации может служить косвенным свидетельством в пользу того, что нарушения метилирования гена является ранним событием в канцерогенезе шейки матки. Метилирование RAR-/32 не коррелировало ни с размером опухоли, ни с наличием метастазов в регионарные лимфоузлы.
Анализ метилирования CpG-островка гена ТІМР-2 в опухолях шейки матки
Для того чтобы определить, связано ли подавление экспрессии мРНК гена с метилированием 5 области TIMP-2, мы проверили статус метилирования этого района в трех клеточных линиях (HeLa, SiHa, CaSki) и нескольких первичных цервикальных опухолях методом гибридизации по Саузерну (рис 7).
Использованный нами зонд для гибридизации позволяет анализировать статус метилирования CpG-динуклеотидов в 13 сайтах метилчувствительной рестриктазы НраІІ, которые расположены вокруг старта транскрипции гена ТІМР-2 (рис 6). Обработка ДНК ферментом Mspl (узнает тот же сайт, что и НраІІ, но разрезает его независимо от метилирования) дает только одну полосу размером 0,78kb (рис 7; дорожки 1, 3, 5, 10, 12). Когда сайты метилчувствительной рестриктазы НраІІ метилированы, обработка ею ДНК приводит к образованию набора фрагментов различной длины (рис 6). Отсутствие полос размером 0,78 и 0,9-l,5kb после обработки НраІІ указывает на метилирование ее сайтов с 1 по 13 (рис 7; дорожки 2, 6, 7, 11, 13). Наличие фрагмента размером 0,78kb и отсутствие дополнительных полос большего размера указывает на отсутствие метилирования сайтов НраІІ (рис 7, дорожки
Жирной линией показана ДНК-проба для гибридизации размером 423п.н. Ожидаемыеразмеры фрагментов, выявляемых этой пробой, когда сайты рестриктазы НраІІ метилированы и не могут быть ею разрезаны, указаны в верхней части карты. Старт транскрипции указан ломаной стрелкой. Позиции праймеров для МЧ ПЦР указаны стрелками F(-705;-685) и R(-301;-282), цифры в скобках указывают расстояние в парах нуклеотидах по отношению к старту транскрипции . Н - сайты рестриктазы НраІІ. Большинство исследуемых сайтов НраІІ были метилированы в двух из трех клеточных линий (SiHa, CaSki), в нескольких опухолях и в одной прилегающей к опухоли условно нормальной ткани (рис 7; дорожки 2, 6, 7, 11, 13). По-видимому, плотность метилирования этих сайтов различна в разных опухолях, так как в некоторых случаях присутствовали фрагменты размером 1,1-1,9 тыс п.н. (данные не представлены). Таким образом, с помощью анализа фрагмента ДНК 2 тыс. п.н. в 5 области гена TIMP-2 было выявлено метилирование большинство сайтов НраІІ, расположенных в нем.
Анализ метилирования CpG-островка гена ТІМР-2 методом МЧ ПЦР. Для скрининга панели цервикальных опухолей методом метил-чувствительной ПЦР (МЧ ПЦР) нами был выбран район 5 области CpG-островка гена ТІМР-2 (от -705 до -282 п.н., рис 6). Этот район содержит 4 сайта метилчувствительных рестриктаз, которые были метилированы в опухолях, исследованных методом блот-гибридизации по Саузерну (1 для НраІІ и 3 для Hhal; рис 6). После обработки ДНК рестриктазами амплификация её не проходит, если 1 из 4 сайтов неметилирован и разрезается своей рестриктазой. На рис 8 представлен результат типичного анализа набора образцов ДНК методом МЧ ПЦР. Для облегчения амплификации GC-богатого района предварительно ДНК обрабатывали мелкощепящей рестриктазой Rsal, сайты узнавания которой отсутствуют в исследуемом фрагменте ДНК. В нормальных тканях, обработанных метилчувствительными рестриктазами (НраІІ и Hhal) продукт амплификации отсутствует (рис 8; дорожки 8, 12). В то же время этот продукт амплификации присутствует в 286 и 234 опухолях, и в двух клеточных линиях SiHa и CaSki (рис 8; дорожки 10, 14 и 4, 6 соответственно). Следует заметить, что определение статуса метилирования гена TIMP-2 двумя методами (гибридизацией по Саузерну и МЧ ПЦР) в клеточных линиях HeLa, SiHa, CaSki дали совпадающие результаты (рис 7; дорожки 2, 4, 6; рис 8; дорожки 2, 4, 6; табл 6а). Результаты анализа парных образцов ДНК от 39 больных методами МЧ ПЦР суммированы в таблице 6. Метилирование исследованного района обнаружено в 16 из 39 (41%) опухолях и в 5 условно нормальных тканях шейки матки.
