Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Функции ретиноевой кислоты и белка CRABP1 в норме и при опухолевой трансформации 11
1.1. Введение 11
1.2. Физиологические функции ретиноевой кислоты 12
1.3. Метаболизм и транспорт ретиноевой кислоты 14
1.4. Рецепторы ретиноевой кислоты 21
1.5. Роль РК и ее рецепторов в канцерогенезе 26
1.6. Строение и функции белка CRABP1 30
1.7. Влияние CRABP1 на чувствительность опухолевых клеток к РК 35
1.8. Экспрессия CRABP1 в опухолях человека 37
2. Материалы и методы 40
2.1. Растворы, реагенты и среды 40
2.2. Клеточные линии 42
2.3. Характеристика исследованных опухолевых образцов 42
2.4. Выделение нуклеиновых кислот 44
2.4.1 Выделение плазмидной ДНК 44
2.4.2. Выделение РНК из клеточных культур и образцов опухолевых тканей 45
2.4.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 46
2.5. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях 46
2.6. Молекулярное клонирование 47
2.6.1. Получение компетентных клеток E. coli 47
2.6.2 Тран сформация компетентных клеток E.coli 48
2.6.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 48
2.6.4. Реакция лигирования 48
2.6.5. Клонирование кодирующей последовательности гена CRABP1 с кДНК 49
2.6.6. Сайт-направленный му тагенез 50
2.7. Обратная транскрипция РНК 50
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 51
2.8.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 51
2.8.2. ПЦР в реальном времени 52
2.9. Трансфекция 53
2.10. Инфекция псевдовирусными частицами 54
2.11. Анализ белков 54
2.11.1. Приготовление белковых лизатов 54
2.11.2. Вестерн-блот гибридизация 55
2.12. Исследование клеточных характеристик in vitro 56
2.12.1. Анализ динамики роста клеток 56
2.12.2. Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность) 57
2.12.3. Тест на миграционную активность клеток 57
2.13. Анализ транскрипционной активности белков RAR 57
2.14. Исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа 58
2.15. Определение туморогенности 59
2.16. Иммуногистохимический анализ 59
2.17. Статистическая обработка данных 60
3. Результаты 61
3.1. Получение линии HT-1080 с гиперэкспрессией CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 R131A 62
3.2. Исследование туморогенности полученных линий HT-1080 с гиперэкспрессией CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 R131A 65
3.3. Исследование транскрипционной активности рецепторов РК - белков RAR, в полученных клеточных линиях 67
3.4. Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro 70
3.4.1. Исследование динамики роста полученных клеточных линий 71
3.4.2. Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность) 72
3.4.3. Исследование миграционной активности полученных клеточных линий 73
3.5. Исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа 75
3.6. Исследование экспрессии CRABP1 в образцах бифазных синовиальных сарком человека 78
3.7. Исследование экспрессии CRABP1 и CRABP2 в образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека 80
Обсуждение результатов исследования 86
Выводы 98
Список использованной литературы 99
Приложение 120
- Рецепторы ретиноевой кислоты
- Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
- Исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа
- Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность)
Введение к работе
Актуальность темы
Процессы, происходящие при опухолевой прогрессии от возникновения первичной опухоли до образования очагов вторичного роста, метастазов, очень разнообразны, многочисленны и затрагивают различные аспекты жизнедеятельности клетки. Несмотря на накопление многочисленных данных о молекулярных изменениях, возникающих при малигнизации, картина происходящего остается фрагментарной, а многие лежащие в основе злокачественной трансформации механизмы остаются непонятыми. В связи с этим, выявление и исследование ключевых белков и сигнальных путей, регулирующих процессы опухолевой трансформации и прогрессии, является актуальной задачей современной онкологии и молекулярной биологии.
Данное исследование посвящено изучению роли белков CRABP1 и CRABP2 в прогрессии опухолей человека. Белки CRABP относятся к семейству внутриклеточных белков, связывающих жирные кислоты. Основные функции данных белков опосредованы их способностью взаимодействовать с ретиноевой кислотой (РК) в цитоплазме клетки. Известно, что РК играет важную роль в процессах канцерогенеза, оказывает антипролиферативное действие на опухолевые клетки, может вызывать апоптоз, а также стимулировать дифференцировку. Считается, что белки CRABP участвуют в формировании клеточного ответа на действие РК. Несмотря на то, что участие РК в процессах канцерогенеза достаточно хорошо охарактеризовано, роль белков CRABP в этих процессах остается малоизученной.
Ранее в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка (линии HET-SR и HET-SR1) было обнаружено, что белок CRABP1 участвует в формировании злокачественного фенотипа опухолевых клеток мезенхимального происхождения. Так, на линии HET-SR, характеризующейся низкой туморогенностью и отсутствием эндогенной экспрессии CRABP1, было показано, что гиперэкспрессия
данного гена вызывала повышение туморогенности указанной линии. При этом на
линии HET-SR1, характеризующейся высокой туморогенностью и наличием эндогенной экспрессии CRABP1, показано, что подавление экспрессии данного гена вызывает снижение туморогенности, а также метастатического потенциала. Эти данные являются одним из первых экспериментальных свидетельств участия белка CRABP1 в процессах канцерогенеза.
Кроме того, по литературным данным, изменение экспрессии CRABP1 характерно для ряда опухолей человека. Причем такие изменения нередко коррелируют с клинико-морфологическими показателями и могут служить прогностическими факторами. Однако следует отметить, что данные об экспрессии CRABP1 в новообразованиях человека противоречивы. Изменения носят разнонаправленный характер в зависимости от типа опухоли. Так, при раке пищевода, раке печени, раке толстой кишки и серозном и светлоклеточном раке яичников отмечается снижении экспрессии CRABP1. В то время как в образцах глиом и аденокарцином эндометрия наблюдается повышение его экспрессии, которое зачастую коррелирует с неблагоприятным прогнозом. Все эти данные говорят о вовлеченности CRABP1 в процессы канцерогенеза и поднимают вопрос об участии данного белка в прогрессии опухолей человека.
Данная работа посвящена изучению влияния белка CRABP1 на свойства опухолевых клеток человека мезенхимального происхождения. Помимо этого, проведен анализ экспрессии CRABP1 в опухолях человека, как мезенхимального, так и эпителиального происхождения.
Таким образом, данная работа представляется чрезвычайно актуальной, поскольку направлена на установление роли CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа опухолевых клеток человека. В целом, настоящее исследование представляет большой научный интерес, как с точки зрения фундаментальной науки, так и клинической онкологии.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является изучение роли белка CRABP1 в прогрессии мезенхимальных опухолей человека, а также исследование экспрессии CRABP в опухолях человека различного гистогенеза.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи.
-
Изучить влияние экзогенной экспрессии CRABP1 на туморогенность линии HT-1080 в эксперименте in vivo.
-
Исследовать клеточные характеристики полученных линий in vitro, потенциально связанные с опухолевой прогрессией (скорость пролиферации, клоногенность, миграционная активность).
-
Исследовать влияние гиперэкспрессии мутантной формы CRABP1 R131A, не способной связывать РК, на туморогенность in vivo и клеточные характеристики in vitro.
-
Изучить влияние гиперэкспрессии CRABP1 и CRABP1 R131A на транскрипционную активность рецепторов ретиноевой кислоты – белков RAR.
-
Оценить влияние экспрессии CRABP1 на профиль экспрессии генов в клетках линии HT-1080.
-
Провести анализ продукции белка CRABP1 в образцах бифазных синовиальных сарком человека.
-
Провести исследование экспрессии CRABP1 и CRABP2 в образцах НМРЛ. Проанализировать результаты с учетом гистологического типа, степени дифференцировки опухоли, а также наличия регионарных метастазов.
Научная новизна и практическая значимость исследования
В данном исследовании выявлено участие CRABP1 в формировании злокачественного фенотипа опухолевых клеток человека. На модели клеточной линии фибросаркомы человека HT-1080 показано, что гиперэкспрессия CRABP1 вызывает повышение туморогенности in vivo, что является одним из первых экспериментальных свидетельств стимулирующего влияния белка CRABP1 на прогрессию опухолей человека. Помимо этого, в работе получены данные, свидетельствующие о существовании дополнительной функции у белка CRABP1, не связанной с его способностью взаимодействовать с ретиноевой кислотой. Следует отметить, что в литературе отсутствуют данные о других функциях белка
CRABP1. Кроме того, в рамках работы впервые исследована продукция белка CRABP1 в образцах бифазных синовиальных сарком и показано, что она характерна для всех исследованных образцов данного вида опухоли. Также впервые проведено исследование совместной экспрессии CRABP1 и CRABP2 в образцах немелкоклеточного рака легкого, в ходе которого выявлено частое повышение экспрессии обоих генов в опухолевой ткани, а также установлено существование положительной корреляции между их экспрессией.
Данная работа в первую очередь имеет фундаментальное значение с точки зрения установления роли CRABP1 в процессах канцерогенеза. Кроме того, дальнейшее изучение дополнительной функции данного белка расширит понимание о функционировании CRABP1 в клетке. Результаты, полученные в исследовании, также перспективны с точки зрения поиска прогностических маркеров течения онкологических заболеваний и мишеней для таргетной терапии опухолей.
Публикации и апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 15 ноября 2013 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, онкогеномики, механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Материалы работы неоднократно докладывались на конференциях, в том числе на VII Всероссийском съезде онкологов (2013 г., Санкт-Петербург, Россия), 5th EMBO meeting (2013 г., Амстердам, Нидерланды), 40th congress of International society of oncology and biomarkers (2012 г., Иерусалим, Израиль), Евразийском форуме по диагностике злокачественных новообразований (2011 г., Киев, Украина). По результатам диссертационной работы опубликованы 6 научных статей и 6 тезисов докладов.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков, 11 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов исследования»,
«Выводы», «Список использованной литературы», «Приложение». Глава «Список использованной литературы» содержит 214 источников.
Рецепторы ретиноевой кислоты
РК оказывает свое действие на клетки посредством связывания с ядерными рецепторами, которые напрямую регулируют транскрипцию генов. Данные рецепторы относятся к семейству рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов и являются лиганд-зависимыми транскрипционными факторами. Они, как и все рецепторы этого семейства, содержат три домена: N-концевой трансактивационный домен (AF-1), распознаваемый коактиваторами и/или другими транскрипционными факторами; центральный ДНК-связывающий домен (DBD), содержащий два мотива цинковых пальцев, и С-концевой лиганд-связывающий домен (LBD) [80]. Известно два класса рецепторов ретиноидов: RAR (retinoic acid receptor) и RXR (retinoid x receptor). С белками RAR связывается транс-РК и 9-цис-РК, с RXR способна связываться только 9-цис-РК. Однако известно, что транс-РК может превращаться в 9-цис-РК, поэтому высокие концентрации транс-РК (10-5 М) также активируют рецепторы RXR [81].
В состав каждого класса рецепторов входит 3 подтипа: , и , кодируемых различными генами. В каждом подтипе содержится несколько изоформ. Изоформы RAR либо транскрибируются с двух разных промоторов, либо образуются в результате альтернативного сплайсинга. Известны 2 изоформы RAR (l и 2) и RAR (l и 2) и 5 изоформ RAR (1-4 и Г). Изоформы RAR транскрибируются либо с промотора Р1 (класс I: RARl, i и з, l), либо с промотора Р2 (класс II: RAR2, 2 и 4, 2). Экспрессия всех изоформ класса II индуцируется при добавлении РК, поскольку в промоторе Р2 содержится респонсивный элемент, распознаваемый рецепторами РК (RARE). Известно по 2 изоформы RXR (l и 2), RXR (i и 2) и RXR (l и 2) [82].
Белки RAR функционируют в виде гетеродимера с белками RXR. Гетеродимер RAR-RXR связывается с определенной последовательностью ДНК в промоторе ретиноид-респонсивных генов, RARE (retinoic acid response element). В состав RARE входит два или более прямых повторов мотива (А/G)G(G/T)TCA, разделенных пятью (DR5), двумя (DR2) или одним (DR1) нуклеотидами [83]. В случае DR5 и DR2 элементов RXR связывается с 5Л участком, а RAR с 3 участком (5,-RXR-RAR-3,)_ В отличие от этого, в случае DR1 элемента связывание гетеродимера осуществляется с обратной полярностью (5-RAR-RXR-3), и лиганды RAR не могут активировать транскрипцию [84; 85].
Был предложен следующий механизм регуляции транскрипции гетеродимером RXR-RAR. В отсутствии агониста RAR гетеродимер RXR-RAR функционирует как репрессор транскрипции и связан с комплексом корепрессоров NCoR или SMRT, и такими факторами, как деацетилазы гистонов (HDAC) или ДНК-метилтрансферазы. Это приводит к конденсации хроматина и подавлению транскрипции. При связывании агониста RAR происходит высвобождение корепрессоров и привлечение коактиваторов, таких как SRC-1, -2 b -3, а также гистоновых ацетилтрансферазы (HAT) или гистоновые аргининметилтрансферазы, что в конечном итоге приводит к активации транскрипции [86; 87; 88; 89]. Помимо этого, недавно было показано, что добавление РК также вызывает связывание гетеродимера RXR-RAR de novo со множеством последовательностей RARE, которые в отсутствие РК не заняты ее рецепторами [90]. Следует отметить, что при одновременном связывании агонистов RAR и RXR наблюдается синергические влияние на активацию транскрипции. При этом селективные агонисты RXR в отсутствие лиганда к RAR не способны вызвать диссоциацию корепрессоров и активировать транскрипцию [91].
RXR может формировать гетеродимеры с целым рядом ядерных рецепторов, включая рецептор жирных кислот (PPAR, peroxisomal proliferator activated receptor), рецептор витамина D (VDR, vitamin D receptor), рецептор тиреоидного гормона (TR, thyroid hormone receptor), желчных кислот (FXR, farnesoid x receptor), ксенобиотиков (PXR, pregnane x receptor) и другие. Находясь в составе гетеродимера, RXR может играть роль активного либо пассивного партнера. Когда он функционирует как активный партнер гетеродимер чувствителен к 9-цис-РК, добавление обоих лигандов дает синергический эффект при активации транскрипции. Такое наблюдается, например, в случае PPAR, VDR, PXR и FXR. Таким образом, 9-цис-РК может участвовать в активации этих путей [92]. Когда RXR выполняет роль пассивного партнера, гетеродимер не чувствителен к 9-цис-РК.
Важная информация о роли различных подтипов RAR и RXR была получена в результате исследований на нокаутных мышах. Было показано, что в случае, когда мутация затрагивает только один подтип RAR, мыши жизнеспособны, а нарушения включают некоторые симптомы дефицита витамина А и ряд дополнительных врожденных нарушений. Это говорит о функциональной избыточности различных рецепторов RAR [93]. Для проверки данной гипотезы, были получены мыши с нокаутом двух подтипов RAR. Такие мыши погибали внутриутробно, либо вскоре после рождения в результате тяжелых врожденных дефектов, которые включали полный спектр нарушений, сходных с таковыми при дефиците витамина А во время внутриутробного развития [94]. Также были получены мыши с нокаутом различных подтипов RXR. Нокаут RXR у мышей приводил к гибели во время эмбриогенеза в результате гипоплазии миокарда. Следует отметить, что данный эффект наблюдался и на моделях с дефицитом витамина А, что доказывает важность RXR в передачи сигнала от РК [95]. Мыши с нокаутом RXR гибли внутриутробно в 50% случаев. Выжившие самцы были стерильными, но в остальном развивались нормально [96]. RXR-/- мыши оказались практически здоровы [97]. Нокаут нескольких подтипов RXR показывает, что для осуществления основных функций RXR достаточно одной копии RXR [97]. Таким образом, среди рецепторов RXR белок RXR играет основную роль в передачи сигнала от РК как минимум во время эмбриогенеза [93].
Обнаружено, что, помимо белков RAR и RXR, РК может связываться с другими ядерными рецепторами. Так показано, что РК является лигандом для рецептора PPAR/ [98; 99]. Ретиноевую кислоту к рецептору PPAR/ доставляет белок FABP5 (fatty acid binding protein 5). Этот процесс осуществляется аналогично доставке РК к рецепторам RAR белком CRABP2. Поскольку аффинность связывания РК с CRABP2/RAR выше, чем с FABP5/PPAR/, в большинстве типов клеток активируется преимущественно классический путь передачи сигнала, опосредованный белками RAR [100]. В клетках с высокой экспрессией FABP5 и большими значениями отношения FABP5/PPAR/ активируется путь, опосредованный PPAR/, при этом происходит подавление апоптоза и преодоление рост-ингибирующей активности белков RAR (Рис. 3) [101]. Кроме того, через рецептор PPAR/ РК регулирует экспрессию генов, участвующих в метаболизме липидов и глюкозы, она стимулирует липолиз и снижает уровень триглицеридов. Так введение РК мышам приводит к повышению экспрессии PPAR и соответствующих респонсивных генов, что приводит к снижению массы тела [102]. Помимо этого, в литературе описано, что РК in vitro может связываться с рецептором ROR (retinoid related orphan receptor), однако физиологическое значение такого связывания еще предстоит установить [103].
Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
Для выделения ДНК из агарозных гелей использовали 1% смесь агароз [0.75% легкоплавкой агарозы (Nu Sieve GTG) и 0.25% обычной агарозы (GibcoBRL)]. После электрофоретического разделения ДНК полоску геля из легкоплавкой агарозы, содержащую нужный фрагмент (объемом около 100 мкл), переносили в микропробирку, плавили при +70 С в течение 3-4 мин и затем быстро замораживали в жидком азоте. После этого содержимое пробирки размораживали при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 15000 g для удаления из раствора агарозы.
Процентное содержание агарозы (GibcoBRL) в буфере ТАЕ (см. список использовавшихся растворов и сред), оптимальное для разделения фрагментов ДНК в геле, определяли в соответствии с длинами анализируемой ДНК: 0,6% - 1 – 20 т.п.н., 0,9% - 0,5 – 7 т.п.н., 1,2% - 0,4 – 6 т.п.н., 1,5% - 0,2 – 3 т.п.н., 2,0% - 0,1 – 2 т.п.н. Гель содержал 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Перед нанесением на гель к образцу ДНК добавляли буфер для нанесения (1/6 объема образца) (см. список растворов и сред). Разделение фрагментов ДНК проводили с учетом расстояния между электродами при максимальном напряжении 5 В/см. ДНК в геле регистрировали по флюоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны от 240 до 360 нм. Для анализа размера ДНК использовали маркеры молекулярного веса фирм Fermentas, Invitrogen.
В работе использовали штамм бактерий Е. coli DH5a. Замороженный бактериальный сток разводился в 100, 1000 и 10000 раз. Разведения сеяли на чашки с LB-агаром без ампициллина в асептических условиях. Чашки инкубировали в течение ночи при +37 С. На следующий день выбирали чашку с примерно 10000 отдельных колоний. Бактерии смывали 2,5-3 мл среды LB без ампициллина. Далее суспензию клеток переносили в 300 мл среды SOB, содержащей ЮмМ MgS04, до оптической плотности OD600=0,05. Суспензию клеток инкубировали при +37 С в шейкере (200-250 об/мин) примерно в течение 50-60 мин до достижения оптической плотности OD6oo=0,15, после чего немедленно помещали в ледяную баню на 10 мин. Клетки собирали центрифугированием при 4000 g, 10 мин при +4 С, образовавшийся осадок клеток ресуспендировали в 150 мл ледяного раствора RF1. Клетки осаждали повторным центрифугированием в тех же условиях. После повторного центрифугирования осадок ресуспендировали в 15-30 мл ледяного раствора RF2. Затем клеточную суспензию делили на аликвоты по 100 мкл, которые помещали в охлажденные стерильные микропробирки и замораживали в жидком азоте.
Для оценки степени компетентности полученных клеток проводили трансформацию разными количествами плазмиды pBS2SKM. Компетентность клеток составляла 10 6 - 10 8 мкг/мкл плазмиды. К 100 мкл компетентных клеток на льду добавляли аликвоту лигазной смеси или плазмидной ДНК (до 10 мкл) и инкубировали 30 мин на льду. После этого клетки подвергали тепловому шоку (+42 С, 90 с) и снова инкубировали на льду 5 мин. Затем к клеткам добавляли 1 мл среды LB без ампициллина и проводили инкубацию при +37 С в течение 60 мин. Суспензию клеток центрифугировали при 3000 g 10 мин. Осадок клеток в остаточном объеме 100 мкл высевали на чашки Петри с LB-агаром и 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в течение 16-24 часов при +37 С. Плазмидную ДНК клонов анализировали с помощью рестрицирующих эндонуклеаз, ПЦР, а также секвенированием.
Гидролиз ДНК рестрицирующими эндонуклеазами проводили с использованием ферментов разных фирм в условиях, рекомендуемых производителями. Обычно реакционная смесь содержала рестрикционный буфер (1/10 от общего объема), необходимое количество ДНК и рестриктаз, бычий сывороточный альбумин (до концентрации 1 мг/мл) и деионизированную воду до конечного объема 20-40 мкл. Рестрикцию проводили при оптимальной для фермента температуре (обычно +37 С) в течение 1-2 часов. Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Реакцию лигирования «липких» концов плазмидной ДНК и клонируемого фрагмента ДНК проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем (1-2 единицы на 20 мкл лигазной смеси). Выделенные из геля векторную ДНК и клонируемый фрагмент лигировали в молярном соотношении 1:2-1:3. Реакцию проводили при +16 С в течение часа, либо при +4 С в течение ночи. Полученную лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E. coli. Перед трансформацией лигазу инактивировали инкубацией в течение 10 мин при +65 С.
Для клонирования кодирующей последовательности гена CRABP1 человека использовали праймеры, подобранные на последовательности, фланкирующие кодирующую область мРНК (рестриктные сайты выделены курсивом, части отжигающиеся на мРНК подчеркнуты). В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК, синтезированную с мРНК из образца ткани рака легкого человека. Амплификацию проводили в присутствии высокоточной полимеразы PFX (Invitrogen) согласно протоколу производителя. После ПЦР реакции полученный продукт очищали в геле и проводили рестрикцию фрагмента эндонуклеазами XhoI и BamHI. Полученный рестрикт лигировали по «липким» концам (см. раздел 2.6.4.) в вектор pLXSN (карта вектора представлена на рисунке 6), обработанный соответствующими эндонуклеазами и выделенный из геля. Проверку клонирования осуществляли с помощью рестрикции полученных конструктов эндонуклеазами XhoI и BamHI, а также методом ПЦР с помощью праймеров pLXSN F и pLXSN R, подобранных к участкам вектора, фланкирующие вставку. В обоих случаях наличие вставки нужной длины определяли с помощью агарозного гель-электрофореза. Секвенирование плазмидной ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems. Для секвенирования использовали праймер pLXSN F.
Исследование профиля экспрессии генов с помощью MicroArray анализа
Для оценки изменения профиля экспрессии генов в зависимости от статуса экспрессия CRABP1 использовали микрочип Nimblegen Roche HG18_12x135k (Roche NimbleGen, Inc.). Каждая клеточная линия была проанализирована в четырех повторах. РНК из клеток выделяли с помощью Trizol-reagent (Invitrogen). кДНК получали с использованием набора SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) и затем метили красителем Cy5. После гибридизации микрочип фотографировали с помощью сканера Axon GenePix 4400A High Resolution Microarray Scanner (Molecular Devices). Относительную экспрессию рассчитывали с использованием программ Subio Platform ver.1.16 by Subio Inc. и Nexus Expression 3 by Biodiscovery. Изменение экспрессии гена учитывали, когда абсолютная экспрессия в клеточных линиях отличалась в 1,3 раза и при р 0,05. Гены из полученного списка CRABP1 -регулируемых генов были соотнесены с функциональными классами генов (Gene Ontology terms) и проанализированы с помощью сервиса Gorilla (http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [186], позволяющей выявлять обогащение списка генами определенных функциональных классов. Исходные данные MicroArray анализа доступны в NCBI s Gene Expression Omnibus, GEO Series accession number GSE48673.
Для определения туморогенности изучаемые клетки разводили в среде DMEM до концентрации 1х106, 3х105 и 5х104 клеток на 100 мкл и в виде одноклеточной суспензии вводили бестимусным мышам линии D2xJ подкожно в область сочленения лапок с туловищем в очередности по часовой стрелке, начиная с передней левой лапы. Количество образовавшихся опухолей оценивали спустя 3 недели.
Для ИГХ-исследования использовали послеоперационный материал от 10 пациентов с диагнозом «бифазная синовиальная саркома» из архива Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. ИГХ-исследование выполнено на серийных парафиновых срезах ткани опухолей и окружающей ткани. Депарафинизированные срезы обрабатывали в цитратном буфере (рН 6,0) в водяной бане при 95С в течение 40 мин. Затем срезы инкубировали при комнатной температуре с первичными антителами к белку CRABP1 (НРА017203 Sigma-Aldrich). Для детекции использовали систему Super Sensitive Polymer-HRP ("BioGenex"). Оценка реакции проводилась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Интенсивность ИГХ реакции оценивали по 4-бальной системе: «0» - реакция отсутствует; «1» -слабопозитивная реакция; «2» - умереннопозитивная реакция и «3» -сильнопозитивная реакция.
Все эксперименты производили в трех независимых повторах. Для статистического анализа полученных данных использовалась программа GraphPad Prizm 5.02 (GraphPad Software Inc). Для сравнения миграционной активности, способности к колониеобразованию, транскрипционной активности белков RAR использовали одномерный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим использованием критерия Даннета для сравнения с контрольной выборкой. Для сравнения туморогенности применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Для выявления ассоциации экспрессии CRABP1 и CRABP2 с клинико-морфологическими характеристиками использовали точный критерий Фишера. Для анализа корреляции между экспрессией CRABP1 и CRABP2 использовали непараметрический критерий Спирмена.
Из литературных данных известно, что экспрессия CRABP1 изменяется в ряде опухолей человека, причем эти изменения зачастую коррелируют с клинико-морфологическими характеристиками опухоли, а также с прогнозом течения заболевания. Однако практически отсутствуют работы, направленные на изучение механизмов участия CRABP1 в опухолевой прогрессии на моделях опухолевых клеточных линий. Ранее в нашей лаборатории было показано, что гиперэкспрессия CRABP1 в линии трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка HET-SR приводит к повышению туморогенности в тестах in vivo, а подавление его экспрессии в близкородственной линии HET-SR1, обладающей высоким метастатическим потенциалом, приводит к снижению туморогенности и метастатического потенциала.
Данная работа направлена на изучение роли CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа опухолевых клеток человека. В качестве модели для исследования была выбрана клеточная линия фибросаркомы человека HT-1080, поскольку влияние CRABP1 на опухолевую прогрессию in vivo впервые было выявлено на клетках мезенхимального происхождения. На первом этапе работы была проведена оценка влияния гиперэкспрессии CRABP1 в клетках линии HT-1080 на туморогенность в тестах in vivo, а также анализ характеристик полученных клеток в экспериментах in vitro. Далее для изучения потенциальных механизмов влияния CRABP1 на агрессивность опухолевых клеток, в полученных линиях был проанализирован профиль экспрессии генов. На заключительном этапе работы проведен анализ экспрессии CRABP1 в образцах бифазных синовиальных саркомах человека и образцах немелкоклеточного рака легкого.
Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность)
Другой важной характеристикой трансформированных клеток в культуре in vitro является их способность образовывать колонии из отдельных клеток. В условиях разреженной популяции возникает дефицит факторов роста, секретируемых клетками в среду, и некоторые культуры в таких условиях останавливаются в росте или погибают. Такой тест позволяет моделировать условия образование опухоли из одной клетки.
Для исследования клоногенности клетки в небольшом количестве (200 клеток) сажали на 6-см чашки и через 10 дней оценивали размер и количество образовавшихся колоний. Тест проводили в трех повторах. На рисунке 14 представлены примеры чашек с образовавшимися колониями.
Результаты статистической обработки полученных в эксперименте данных приведены на рисунке 15. Все изучаемые клеточные линии были способны образовывать колонии в условиях разреженной популяции. При этом линии HT-1080 CRABP1 и HT-1080 CRABP1 R131A образовали сходное с контрольной линией HT-1080 pLXSN количество колоний, которые не отличались по среднему размеру. Результаты теста показали, что гиперэкспрессия CRABP1 и его мутантной формы CRABP1 R131A не приводила к статистически достоверному изменению клоногенности линии HT-1080.
Анализ клоногенности полученных клеточных линий. А – сравнение количества колоний; Б – сравнение среднего размера колонии.
Клеточная подвижность также является одним из важных показателей агрессивности опухолевой клеточной линии. В нашей работе мы исследовали миграционную способность клеток в камерах Бойдена, в котором анализировали способность клеток к направленному движению по градиенту концентрации сыворотки. Для этого клетки сажали в камеру, дном которой служила пористая мембрана, проницаемая для клеток. Камеру заполняли бессывороточной средой и помещали в лунку со средой с 10% содержанием сыворотки. Таким образом, создавались условия, в которых клетки двигались через мембрану по градиенту хемоаттрактантов. Результаты теста оценивали через сутки. Ядра клеток, мигрировавших через мембрану, окрашивали с помощью раствора Hoechst 33342, фотографировали и подсчитывали. Для каждой линии эксперимент повторялся трижды. Пример фотографий с окрашенными мигрировавшими клетками приведен на рисунке 16. Результаты статистического анализа полученных в тесте данных представлены на рисунке 17.
. Анализ миграционной активности изучаемых клеточных линий (указано среднее количество клеток в 5 полях зрения). - Р 0,05. Как видно из рисунка, линии HT-1080 CRABP1 и HT-1080 CRABP1 R131A мигрировали активнее контрольной линии. Гиперэкспрессия как CRABP1 дикого типа, так и мутантной формы CRABP1 R131A достоверно усиливала миграционную активность клеток линии HT-1080. Повышение подвижности клеток косвенно свидетельствует о формировании более агрессивного фенотипа у клеток линии HT-1080 при экспрессии CRABP1.
В нашей работе было обнаружено, что гиперэкспрессия CRABP1 повышает туморогенность линии HT-1080 в экспериментах in vivo, при этом данный эффект не связан со способностью CRABP1 взаимодействовать с РК. Анализ литературных данных не позволяет предположить потенциальные механизмы такого влияния CRABP1 на клетки линии HT-1080, поскольку связывание РК – единственная известная функция данного белка. Проведенное нами исследование характеристик полученных клеточных линий in vitro (динамика роста, клоногенность, миграционная активность), к сожалению, также не помогло объяснить наблюдаемый феномен (изменение миграционной способности, как правило, не связано с повышением туморогенности). В связи с этим для поиска возможных механизмов влияния CRABP1 на свойства опухолевых клеток линии HT-1080, был проанализирован профиль экспрессии генов в линиях HT-1080 pLXSN и HT-1080 CRABP1 с помощью MicroArray анализа. Для этого использовали микрочип Nimblegen Roche HG18_12x135k. Профиль экспрессии генов в каждой клеточной линии анализировали в четырех повторах. Изменение экспрессии гена учитывали, когда абсолютная экспрессия в клеточных линиях отличалась в 1,3 раз и при p 0,05.
В результате эксперимента обнаружено, что в линии HT-1080 CRABP1 по сравнению с линией HT-1080 pLXSN статистически достоверно изменилась экспрессия более 100 генов. Полный перечень этих генов представлен в Приложении 1. Из этого перечня мы выделили гены, изменение экспрессии которых по литературным данным может давать преимущество при выживании опухолевых клеток и росте опухоли в тканях, а также способствовать приобретению клетками более агрессивного фенотипа. Список таких генов представлен в таблице 7.
Как видно из таблицы 7 гиперэкспрессия CRABP1 в клетках линии HT-1080 приводила к изменению экспрессии ряда генов, регулирующих дифференцировку и задействованных в поддержании стволовости, таких как SATB1, RFX1, WNT10B [189; 190; 191; 192; 193].
Также хотелось бы отметить повышение экспрессии HAS2 и ADORA2B. HAS2 задействована в синтезе гиалуроновой кислоты, по данным многочисленных исследований, она может стимулировать опухолевую прогрессию и влияет на туморогенность опухолевых клеточных линий [194; 195; 196; 197; 198]. Повышение экспрессии ADORA2B в условиях гипоксии стимулирует пролиферацию опухолевых клеток, ангиогенез, а также инвазивную активность [199; 200; 201; 202].
Помимо этого, на основании полученного списка CRABP1-регулируемых генов (Приложение 1) мы провели анализ представленности генов различных функциональных классов (Gene Ontology terms) с помощью сервиса Gorilla (http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [186]. Результаты анализа выявили, что в списке CRABP1-регулируемых генов отмечается обогащение генами, задействованными в следующих биологических процессах: «регуляция транскрипции», «внутриклеточная локализация белков», «сумоилирование белков» и «активность тРНК-метилтрансфераз» (таблица 8).
