Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
1.1 Распространенность рака яичников 13
1.2 Факторы риска рака яичников 15
1.3 Юшнико-морфологические варианты рака яичников 19
1.4 Гормональный канцерогенез и рецепторы стероидных гормонов при раке яичников 21
1.4 Вирусная теория канцерогенеза 27
1.5 Иммуногистохимический метод исследования 31
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 37
2.1 Характеристика онкологической заболеваемости женского населения Ульяновской области 38
2.2 Характеристика клинического материала 41
2.3 Морфологическое исследование 54
2.4 Иммунопероксидазныи метод выявления антигенов вируса папилломы человека, простого герпеса, определения рецепторов эстрогенов и прогестерона 55
2.5 Статистическая обработка материала 62
ГЛАВА III. Рецепторы эстрогенов и прогестерона в опухолевых клетках при раке яичников 66
3.1 Рецепторы эстрогенов 66
3.2 Рецепторы прогестерона 69
ГЛАВА IV. Экспрессия антигенов вируса папилломы человека и простого герпеса в опухолевой ткани яичников 75
4.1 Вирус папилломы человека 75
4.2 Вирус простого герпеса 80
ГЛАВА V. Особенности клинического течения заболевания и прогноза у больных вирусзависимым и прогестеронзависимым раком яичников 84
Обсуждение полученных результатов 93
Выводы 102
Список литературы 104
- Гормональный канцерогенез и рецепторы стероидных гормонов при раке яичников
- Характеристика онкологической заболеваемости женского населения Ульяновской области
- Иммунопероксидазныи метод выявления антигенов вируса папилломы человека, простого герпеса, определения рецепторов эстрогенов и прогестерона
- Рецепторы эстрогенов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Рак органов женской репродуктивной системы - яичников, эндометрия, молочной железы - является одной из самых крупных проблем в онкологии (Бохман Я.В., 1989; Двойрин В.В. и соавт., 1996; Максимов С.Я. и соавт., 2001). Заболеваемость этими новообразованиями в среднем по России составляет 78 на 100 тыс. женщин (30% от общей заболеваемости женщин злокачественными опухолями) (Бохман Я. В., Лившиц М. Е. 1993; Двойрин В.В. и соавт., 1996). В настоящее время практически у 50% больных диагноз впервые устанавливается в III-IV стадиях, когда лечение оказывается неэффективным. И, как следствие, от этих опухолей ежегодно умирают 44,2 на 100 тыс. женщин. За последние 10 лет в России заболеваемость раком органов женской репродуктивной системы выросла на 16%, а смертность от них - на 19% (Бохман Я. В., Лившиц М. Е., 1993).
Рак яичников в структуре причин смертности от злокачественных новообразований занимает ведущее место. По данным Международного агентства по изучению рака ежегодно в мире регистрируется более 165 тысяч новых случаев рака яичников, от которого умирает более 100 000 женщин (American Cancer Society Statistics 2000). В экономически развитых странах Европы и Северной Америки заболеваемость раком яичников (10 - 15 на 100 000 женщин) занимает второе ранговое место среди злокачественных опухолей женских половых органов, а смертность - первое, превышая соответствующие показатели для рака шейки и тела матки, вместе взятые (Новикова Е.Г., Ро-нинаЕ.А., 1999).
В России ежегодно выявляют 11 000 больных злокачественными опухолями яичников и 8 500 умирают от этого заболевания (Трапезников Н. Н., Аксель Е. М., 1997). По сводным данным FIGO (1992), показатель 5-летней выживаемости для всех стадий рака яичников не превышает 30-35%.
Совокупность результатов экспериментальных, эпидемиологических, клинических и эндокринологических данных позволяет отнести большую часть случаев рака яичников к группе гормонозависимых опухолей (Грязнова И.М., Макаров О.В., Николаев Н.Н., 1984). Это справедливо не только по отношению к гормонпродуцирующим опухолям, но и к цистаденокарциномам. Существенным звеном патогенеза является синдром нарушений репродуктивной функции: раннее менархе, ранняя (до 45 лет) или поздняя (после 55 лет) менопауза, бесплодие или снижение детородной функции, сочетание рака яичников с миомой матки, с генитальным эндометриозом, гиперпластическими процессами эндометрия (Колосов А.Е., 1996). Характерны повышение гонадотропной функции гипофиза (и связанная с ней гиперстимуляция овуляции), хроническая гиперэстрогения при сниженной секреции прогестерона. В цистаденокарциномах яичников (особенно эндометриоидных), высоко-дифференцированных опухолях с высоким постоянством определяются ци-топлазматические рецепторы эстрадиола и прогестерона, уровень которых отражает чувствительность этих новообразований к гормонотерапии синтетическими прогестагенами и антиэстрогенами (Махова Е.Е., 1985). О гормональной зависимости многих гистотипов РЯ свидетельствует их нередкое синхронное, либо метахронное сочетание с карциномой эндометрия, молочной железы, а также правой половины толстой кишки. Относительный риск первично-множественного рака яичников у больных с солитарными опухолями указанных органов в 12 - 18 раз выше, чем в популяции здоровых женщин соответствующего возраста (Максимов С.Я., 1993).
Возможным фактором риска развития рака яичников может быть естественная или искусственная гиперстимуляция овуляции. Так, М. Fathalla (1971) первым предположил, что непрерывная овуляция может играть важную роль в патогенезе рака яичников. После овуляции покровный эпителий яичника интенсивно пролиферирует, заполняя раневой дефект, образовавшийся вследствие разрыва фолликула. Пролиферирующий эпителий может под вергнуться злокачественной трансформации, а экзогенные агенты (возможно, HPV или HSV-I-II типы) могут служить в качестве инициаторов или промоторов в этой трансформации. Косвенным доказательством правильности таких представлений являются данные о том, что прерывание овуляции беременностью, лактацией или длительным приемом оральных контрацептивов существенно снижает риск развития рака яичников (ВОЗ, 1992; Прилепская Н.Н., 1998; Hankinson S.E. et al., 1992).
Наряду с несомненной ролью эндокринно-обменных нарушений в развитии рака яичников в последнее время получен ряд доказательств гипотезы, согласно которой в возникновении некоторых гистотипов рака яичников (особенно серозной цистаденокарциномы), определенное значение имеет ин-фицированность вирусом папилломы человека (Kaufman R.N., et al., 1987). Встречающееся в ряде наблюдений тотальное поражение брюшины мелкими бородавчатого вида метастазами при небольших первичных опухолях и отсутствие асцита дает основание расценивать рак яичников как общее поражение всей выстланной целомическим эпителием брюшины.
Проблема ранней диагностики рака яичников не решена (Durum A., Krisensen G.B., Abeler V.M. et al., 1996). Выявление ранних стадий рака яичников основано на обследовании "группы риска". В 70-75% случаев рак яичников выявляется в III - IV стадии.
В последние годы большие надежды возлагаются на иммунологические методы диагностики рака яичников. Выявление опухолеассоциированных антигенов является перспективным в плане раннего распознавания злокачественных новообразований яичников и ранней диагностики рецидивов опухолевого процесса (Алексеева М. Л. с соавт., 1995; Frank Т., 2001). С этой целью применяется определение опухолевых маркеров, представляющих собой белковую субстанцию, которая появляется у онкологического больного и коррелирует как с наличием опухоли, степенью ее распространения или per рессией заболевания в результате проводимого лечения, так и с рецидивом опухоли после прекращения ремиссии процесса (Вишневский А.С.,1984).
Задачи ранней диагностики и профилактики рака яичников сегодня приобретают первостепенное значение во всем мире. В настоящее время определены основные стратегические направления научно-исследовательской деятельности, включающие:
• разработку скрининговых программ с использованием наиболее достоверных клинических методов, включая физикальное исследование органов малого таза и молочных желез; определение опухолевых маркеров; компьютерную томографию; ядерно-магнитный резонанс; пози-тронно-эмиссионную томографию; трансабдоминальную и трансвагинальную сонографию с допплерометрией кровотока (Вишневский А.С., 1984; Bandera С.А., et al., 1998);
• разработку показаний к выполнению различных хирургических вмешательств, в том числе профилактической оофорэктомии (Schrag D.,. et al., 1997);
• разработку показаний для профилактического использования лекарственных препаратов, в частности, оральных контрацептивов; агонистов гонадотропных рилизинг-гормонов, антиоксидантов и т.п. (Godard В., et al. 1998; Moore М..М., 1998;, Narod S.A. et al, 1998);
• разработку методов генной терапии (ВОЗ, 1992).
Лечение злокачественных новообразований яичников заключается в индивидуализированном применении хирургических, химиотерапевтических, лучевых, а в последние годы - гормональных и иммунотерапевтических методов.
Несмотря на постоянное усовершенствование методов профилактики, ранней диагностики и лечения рака яичников, показатели 5 -летней выживаемости применительно ко всем стадиям не превышают 30 - 35%. Это глав ный стимул для дальнейшего изучения всех аспектов сложной проблемы опухолей яичников.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучить экспрессию вирусов папилломы человека, простого герпеса, рецепторов эстрогенов и прогестерона в малигнизирован-ных эпителиальных опухолях яичников.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
• Дать клинико-морфологическую характеристику рака яичников.
• Изучить распространенность рецепторов эстрогенов и прогестерона в ткани опухоли при различных вариантах рака яичников.
• Изучить экспрессию вирусов папилломы человека и простого герпеса в опухолевой ткани яичников.
• Проследить взаимосвязь между наличием папилломавирусов, вирусов простого герпеса и рецепторами эстрогенов и прогестерона при раке яичников и их влияние на прогноз заболевания.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведено сопоставление встречаемости рецепторов эстрогенов и прогестерона и вирусов папилломы человека и простого герпеса в клетках ткани злокачественных опухолей яичников. У больных эндометриоидной цистаденокарциномой в 90% случаев в малигни-зированных тканях выявлено наличие рецепторов прогестерона; у больных умереннодифференцированной серозной цистаденокарциномой - в 20%, и в 10% - у больных недифференцированной неклассифицированной цистаденокарциномой.
Установлено сравнительно редкое (в 12% случаев) наличие рецепторов эстрогенов в опухолевых клетках только у больных умереннодифференцированной серозной папиллярной цистаденокарциномой и неклассифицируемой низкодифференцированной цистаденокарциномой.
Впервые выявлены онкогенные типы папилломавируса человека (16 и 18 типы) в клетках цистаденокарциномы яичников, в том числе у всех больных при низкодифференцированных неклассифицированных вариантах опухоли, в 60% - при эндометриоидной опухоли, в 55% - при серозной опухоли (в 90% при высокодифференцированной и в 60% при умереннодифференцированной серозной цистаденокарциноме).
Показано, что экспрессия вируса простого герпеса 1 — 2 серотипов имеет место у 28% больных. Вирус в основном (71,5%) обнаруживался у больных высокодифференцированной и умереннодифференцированной серозной папиллярной цистаденокарциномой.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ
1. Учитывая прогностическую значимость выявления рецепторов прогестерона в клетках злокачественных опухолей яичников, можно рекомендовать в практику использовать определение иммуногистохимическим методом рецепторов прогестерона в опухолевой ткани яичников в целях более достоверного прогнозирования течения заболевания и применения гормонотерапии в плане комплексного лечения рака яичников.
2. Определение экспрессии онкогенных вирусов (вирус папилломы человека 16 и 18 типы и вирус простого герпеса 1-2 типов) в злокачественных опухолях яичников позволит индивидуализировать тактику лечения больных и модифицировать ее, учитывая биологию вируса, путем включения в терапию противовирусных и иммуномодулирующих препаратов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на 10-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (2002), на заседании Ульяновского и Санкт-Петербургского городского обществ инфекционистов (2002), на Поволжской региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии, акушерства, гинекологии и детской хирургии» (Ульяновск, 2002), на VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблемы инфекции в клинической медицине» (СПб, 2002).
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Предложения автора об определении рецепторов прогестерона и экспрессии онкогенных вирусов (вирус папилломы человека 16 и 18 типы и вирус простого герпеса I - II типы) в злокачественных опухолях яичников внедрены в НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова, Ульяновском областном клиническом онкологическом диспансере.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Низкодифференцированные неклассифицируемые опухоли яичников характеризуются экспрессией онкогенных типов вируса папилломы человека (16 и 18 типы) в 100% обследованных случаев. Экспрессия вышеуказанных онкогенных типов вируса папилломы человека имеет место при эндометриоидных цистаденокарциномах - в 60% случаев, при серозных цистаденокарциномах - в 55% случаев.
2. Экспрессия вируса простого герпеса I - II типов выявлена только у 28% больных раком яичников, но была при этом резко положительной и в основном у больных высокодифференцированной (43%) и умереннодифференцированной (28,5%) серозной папиллярной цистаденокарциномой.
3. Рецепторы прогестерона обнаружены у 90% больных эндометриоидной цистаденокарциномой и у каждой пятой больной умереннодифференцированной серозной цистаденокарциномой. При низкодифференцированной неклассифицированной цистаденокарциноме вышеуказанные рецепторы определялись только у каждой десятой больной.
4. Рецепторы эстрогенов в опухолевых клетках рака яичников выявляются у незначительного количества пациенток (12% от всех обследованных), сравнительно молодого возраста (до 50 лет) и только при умереннодифференцированной серозной папиллярной и неклассифицируемой низкодифференцированной цистаденокарциноме.
5. Полученные результаты позволяют выделить среди больных раком яичников четко очерченные группы вирусзависимых (55%) и гормонозависимых новообразований (40%), различающихся по клиническому течению и прогнозу заболевания. СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ:
Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы, содержащего 67 отечественных и 83 зарубежных источника. Текст содержит 32 таблицы и 25 рисунков.
Гормональный канцерогенез и рецепторы стероидных гормонов при раке яичников
Для развития карциномы яичников характерны качественные нарушения в гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системе, что подтверждает дисгор-мональный характер опухолей яичников (Вартанян Л.Г.,1981; Дильман В.М., 1983).
Развитие опухолей определяется специфическими изменениями на уровне клетки и гормонально-метаболическим фоном организма, который может оказывать влияние как на процесс злокачественной трансформации клетки, так и на последующие этапы роста и развития (Key Т.J., 1991; Moore К.Н. et al., 1996). Пока нет бесспорных доказательств прямого генотоксического действия природных эстрогенов, но возникающее при их воздействии усиление пролиферативной активности в тканях-мишенях может ускорить рост трансформированных клеток (Cornelisse М.М. et al., 1994; Eden J.A. et al., 1995). Помимо того, в процессе интенсивного клеточного деления могут быть скопированы ошибки в структуре ДНК, что приводит к генетическим и эпигеномных изменениям (Сергеев П.В., Карева Е.Н.,1994; Рыбин Е.П. с со-авт., 1996).
Существует представление о наличии двух основных типов гормонального канцерогенеза - физиологического (промоторного) и генотоксического. Если в случае промоторного варианта гормоны прежде всего способствуют увеличению числа уже инициированных клеток, то для генотоксического гормонального канцерогенеза характерны усиление образования в процессе метаболизма гормонов (в частности, эстрогенов), свободных радикалов, связанное с этим окислительное повреждение клеточных мембран, формирование ковалентных аддуктов ДНК с гормонами или гормонозависимая индукция ДНК - аддуктов с последующей активацией и, вероятно, ослабление репарации этих повреждений (Gaister J.P. et al., 1995). Эстрадиол индуцирует деление покоящихся клеток мишеней. При этом одна клетка-мишень, получившая гормональную информацию, способна передавать ее уже в переработанном виде близлежащим клеткам. Один из механизмов действия эстрогенов на клетки-мишени проявляется в повышении синтетической активности генома (Сергеев П.В., Карева Е.Н., 1994).
Для всех опухолей репродуктивной системы доказано, что достоверным критерием прогноза является уровень в опухоли рецепторов прогестерона (РП) (Vergote I. et al., 1998). Рецепторный белок, связывающий прогестерон, синтезируется в клетке под влиянием эстрогенов, то есть является маркером присутствия в клетке биологически активных рецепторов эстрогенов (РЭ) и определенного эстрогенного воздействия (Kieback D.G. et al.,1993).
Исследования уровня РСГ у больных раком яичников показали, что к ре-цепторположительным могут быть отнесены опухоли у 50% больных. В отличие от опухолей молочной железы и рака тела матки, уровень РЭ у больных раком яичников не повышается с возрастом и даже несколько снижается (Рыбин Е.П. с соавт.,1996). По данным других авторов, содержание рецепторов эстрогенов в опухолях зависит от возраста следующим образом: у больных старше 60 лет они выявляются в два раза чаще, чем у больных 50-59 лет (Бохман Я.В.,1989; Geister J.P. et al.,1995). Уровень РП был низким у больных как репродуктивного возраста, так и в менопаузе. Однако при сопоставлении уровня рецепторов стероидных гормонов с длительностью ремиссии у больных раком яичников оказалось, что имеется выраженная положительная корреляция между уровнем РП и длительностью ремиссии. Таким образом, и в отношении рака яичников уровень РП в ткани может рассматриваться как критерий прогноза заболевания (Kieback D.G. et al.,1993; Geister J.P. et al., 1995).
Dabrow MB. и Caradonna S. (1994) изучая влияние гормональной регуляции на рост нормальных клеток поверхностного эпителия яичников, пришли к выводу, что рецепторный статус неизмененной ткани яичников имеет значение в их канцерогенезе, так как поверхностный эпителий яичников состав 24 ляет 1% от их массы, но по современным представлениям дает начало 90% злокачественных опухолей яичников.
В этой связи интересно распределение стероидных рецепторов в нормальной ткани яичников (Hulka J., Phillips J., 1993). Синтез рецепторов прогестерона индуцируется эстрадиолом через его рецепторы, однако наличие рецепторов прогестерона в неизмененных яичниках более высоко, чем рецепторов эстрадиола (Hammond G.L., Bocchinfuso W.P., 1996). Это показал Leake Р.Е. (1990), установив гистохимически, что 84% эпителия нормальных яичников содержат значительное количество цитоплазматических рецепторов прогестерона и только 35% - цитоплазматических рецепторов эстрогенов (они также содержали рецепторы прогестерона). Концентрация рецепторов эстрогенов была относительно низкой (5-15 фмоль/мг цитозоля белка), в то время, как концентрация рецепторов прогестерона составила 50-950 фмоль/мг цитозоля белка.
Содержание рецепторов эстрогенов и рецепторов прогестерона в клетках рака яичников варьирует в зависимости от метода исследования и точки отсчета, принимаемой за минимальную величину для определения присутствия рецепторов в клетке. Grenman S.E. et al.,1994, на основании биохимического и иммуногистохимического исследования рецепторов эстрогенов и прогестерона в 5 пограничных и 35 злокачественных опухолях яичников сделали следующее заключение: при биохимическом анализе 67% оказались эстроген-положительными (рецепторов эстрогенов более 5 фмоль/мг белка цитозоля) и 56% - прогестеронположительные (рецепторов прогестерона более 10 фмоль/ мг белка цитозоля); при иммуногистохимическом исследовании 22% опухолей положительны по рецепторам эстрогенов и 27% положительны по рецепторам прогестерона. В целом, по данным различных авторов (Карташов СМ., 2000; Creasman W.T. et al.,1981) количество рецепторов прогестерона в опухолевой ткани яичников намного ниже по сравнению с неизмененной, в то время как количество рецепторов эстрогенов в опухолевой ткани выше.
Характеристика онкологической заболеваемости женского населения Ульяновской области
Настоящая работа выполнена на базе Ульяновского областного клинического онкологического диспансера. Объем проведенных исследований демонстрирует табл. 1. Под нашим наблюдением находилось 106 больных эпителиальным раком яичников, получавших лечение на базе Ульяновского областного клинического онкологического диспансера в период 2000-2003 гг. Занимая второе место в мире (после болезней сердечно-сосудистой системы) по причинам смерти человека, злокачественные новообразования стали проблемой высокой социальной значимости. В Ульяновской области (как и в целом по России) в последние 20 лет наблюдается рост онкологической заболеваемости и смертности населения. Так заболеваемость в 1985 году составила 206,8 на 100 тыс населения, в 2000 - 273,3 на 100 тыс населения; показатели смертности соответственно составили в 1980 г. 133,1, а в 2000 г. 178,3 на 100 тыс населения.
При том, что имеется общая тенденция к росту заболеваемости раком, в целом она складывается из разнонаправленных процессов. По ряду локализаций рака отмечается рост, как-то: рак толстой кишки, рак молочной железы, рак тела матки и яичников, рак простаты, мочевого пузыря, рак щитовидной железы, меланома кожи. Заболеваемость другими локализациями остается стабильной многие годы, в частности, раком кожи, гортани, пищевода, системными опухолями, злокачественными опухолями костей и мягких тканей. Отмечается тенденция к снижению заболеваемости раком губы и желудка.
В 2000 году женщины составили 49,1% среди заболевших, мужчины 50,9%. При исследовании возрастной характеристики онкологических больных, взятых на учет в 2000 году, выявлено, что большинство, как мужчин, так и женщин были в возрасте старше 50 лет (рис.1). Вместе с тем следует отметить, что среди женщин и мужчин преобладает группа в возрасте 60-69 и более лет. Рост доли лиц пожилого возраста (75 и старше) более выражен в женской популяции.
Структура онкологической заболеваемости претерпевает изменения. На первое место в 2000 году вышла заболеваемость раком легкого (16,2%), тогда как в 1980г. эта локализация находилась на третьем месте; снизилась заболеваемость раком желудка и шейки матки (с первого на третье и с пятого на одиннадцатое место соответственно); на пятом, шестом, седьмом и восьмом местах мы видим рак ободочной и прямой кишок, тела матки и яичников, заболеваемость которыми неуклонно возрастает (рис.2).
В структуре половой онкологической заболеваемости у женщин безусловным лидером являются опухоли репродуктивной системы: рак молочной железы (18,3%), тела матки (6,5%), шейки матки и яичников (5,5% и 5,1% соответственно); затем опухоли пищеварительного аппарата и кожи, рак легкого находится почти на последнем месте (рис.3).
В динамике половой структуры онкологической заболеваемости в Ульяновской области за последние 20 лет следует отметить рост количества случаев меланомы кожи у женщин; перемещение таких локализаций, как рак ободочной кишки, тела матки, яичников и щитовидной железы из разряда «прочих» в 1980 году в разряд «лидирующих» в 2000году.
Одним из основных параметров, определяющих прогноз онкологического заболевания, является степень распространенности опухолевого процесса на момент диагностики и начала лечения. В 2000 году 37,6% злокачественных новообразований были диагностированы в I - II стадиях, 32,2% в III стадии. Рак in situ выявлен лишь у 0,22% заболевших. У 26,6% больных в 2000 году заболевание было диагностировано при наличии отдаленных метастазов (т.е. в IV стадии). Треть этих больных (33,3%) - были женщины, больные раком яичников.
Смертность от злокачественных новообразований в 2000 году составила 178,2 на 100 тыс. населения.
В структуре смертности от злокачественных новообразований наибольший удельный вес имели опухоли дыхательной системы (21,3%), желудка (16,1%), молочной железы (7%), прямой и ободочной кишки (5,9%), гемо-бластозы (4,4%), рак яичников (3%).
Проводя анализ онкозаболеваемости женского населения Ульяновской области, мы не выявили кардинальных отличий в структуре онкологической заболеваемости и смертности в сравнении с общероссийскими показателями.
Иммунопероксидазныи метод выявления антигенов вируса папилломы человека, простого герпеса, определения рецепторов эстрогенов и прогестерона
С помощью разработанного ранее иммуноцитохимического метода выявления антигенов вирусов простого герпеса и папилломы человека, а также рецепторов эстрогенов и прогестерона (Насыров Р.А., 1995), нами было проведено изучение опухолевой ткани больных раком яичников в возрасте от 20 до 75 лет.
Данный метод относится к иммуногистохимическим и основан на специфической реакции антиген-антитело. В отличие от иммунофлюоресцентного, он обладает большей чувствительностью, он обладает большей чувствительностью, позволяет иметь постоянные препараты. Поскольку интенсивность окраски не падает, препараты можно просматривать в обычном микроскопе и фотографировать.
Для иммуногистохимического метода использовали авидин-биотиновую систему детекции. Авидин - это гликопротеин с молекулярной массой 68 кД, имеющий очень высокое сродство к биотину - витамину с малой молекулярной массой. Так как это сродство более чем в миллион раз сильнее, чем связь антитела с антигеном, связывание авидина с биотином (в отличие от взаимодействия антигена с антителом) практически необратимо. В дополнение к высокой аффинности, Авидин/биотиновая система детекции отличается высокой чувствительностью, поскольку авидин имеет четыре участка для связи с биотином, и большинство белков, исключая антитела и ферменты, могут связываться с несколькими молекулами биотина. Эти аспекты обеспечивают возможность образования макромолекулярных комплексов между авидином и биотинилированными ферментами.
Иммунопероксидазный метод на основе взаимодействия авидина и биотина, был создан для определения локализации разнообразных гистологически значимых антигенов и других маркеров. На первом этапе на препарат наносят немеченые первичные антитела, далее следуют биотинилированные вторичные антитела и затем инкубируют с Авидин Биотиновым макро-молекулярным комплексом с пероксидазой хрена - методика называется ABC метод.
Наборы авидин/биотиновой системы детекции содержат реагенты: Авидин DH и биотинилированная пероксидаза хрена Н, которые специально подготовлены для формирования пероксидазного комплекса при иммуноперок-сидазном окрашивании. Хотя структура комплекса Авидин DH /биотинилированная пероксидаза хрена еще не совсем известна, предполагается, что она состоит из множества молекул биотинилированной пероксида-зы хрена, перекрестно-соединенных авидином и располагается в трех плоскостях. Комплекс имеет мало свободных биотиновых остатков, но всегда сохраняет по крайней мере один биотиновый участок для связывания. Формирование комплекса достигается смешиванием Авидина DH и биотинилиро-ванной преоксидазы хрена Н в растворе в определенных количествах перед использованием. После первоначальной инкубации происходят небольшие изменения в комплексе, рассматриваемые как резервное повышение чувствительности иммунопероксидазной окраски. Комплекс остается стабильным несколько часов после формирования, и, в некоторых случаях, может быть использован в течение нескольких дней после приготовления. Состав набора и приготовление рабочих растворов. В состав набора авидин-биотиновой системы детекции для иммуногисто-химического метода исследования входят: - блокирующая нормальная сыворотка; - биотинилированные аффинно-очищенные антитела к иммуноглобулинам; - реагент А (Авидин DH); - реагент В (Биотинилированный фермент); - флаконы для смешивания. В наборе можно использовать различные буферы. Наиболее распространенными являются ЮтМ натриево-фосфатный буфер, рН 7,5, 0,9% раствор (PBS), цитратный буфер рН 6,0. Рабочие растворы готовят следующим образом: 1. Блокирующая (нормальная) сыворотка: в промаркированный флакон добавляется 3 капли (150 мкл) нормальной сыворотки к 10 мл буфера. 2. Биотинилированные антитела: в промаркированный флакон добавляется 3 капли (150 мкл) нормальной блокирующей сыворотки к 10 мл буфера и далее добавляли 1 каплю (50 мкл) расвора биотинилированных антител. 3. ABC реагент: в большой флакон для смешивания добавляется 2 капли реагента А, 5 мл буфера и 2 капли реагента В, все перемешивается и оставляется на 30 минут до использования. Для фиксации полученной опухолевой ткани использовали 10% нейтральный формалин. Было проведено исследование удаленных злокачественных эпителиальных опухолей яичников у 106 больных. 1. Опухоль яичника погружали в 10% нейтральный формалин на 30 часов. После чего вырезанные кусочки опухоли дофиксировались в 10% нейтральном формалине в течение 5 суток. 2. Заливали в парафин. 3. Срезы освобождали от парафина в 3-х порциях ксилола при температуре 56 -60 градусов по Цельсию в течение 10 мин. 4. Отмывали в дистиллированной воде 3 раза. 5. Обрабатывали срезы в 15% растворе сахарозы на фосфатно-со левом буфере (ночь). 6. После промывки в буфере обрабатывали 0,3% перекисью водорода на дистиллированной воде (30 мин). 7. Промывали в буфере 10 мин. 8. Инкубировали срезы 20 мин в блокирующей сыворотке. 9. Промакивали излишнюю сыворотку по краю среза. 10.Инкубировали срезы 60 мин при температуре 37 градусов по Цельсию с первичными антителами к вирусу простого герпеса и вирусу папилломы человека (производство Novocastra) в разведении 1:100 и с моноклональными антителами фирмы Novocastra к рецепторам эстрогенов и прогестерона. Определение рецепторов эстрогенов и прогестерона проводили с предварительной демаскировкой в цитратном буфере в скороварке в течение 15 минут (в кипящий цитратный буфер в скороварке помещались депарафинизированные среды). 11.Промывали 10 мин в буфере 12. Инкубировал и срезы 30 мин с разведенными биотинилированными вторичными антителами. 13.Промывали 10 мин в буфере. 14.Инкубировали срезы в растворе ABC Реагента. 15.Промывали в буфере 10 мин. 16. Инкубировал и срезы в растворе хромогена до появления интенсивной окраски. 17.Промывали предметные стекла 5 мин в проточной воде, докрашивали, очищали и покрывали заключающим раствором. Продукт реакции выявлялся по наличию светло- и темнокоричневых гранул в опухолевых клетках яичника при микроскопическом исследовании в обычном световом микроскопе. Для контроля качества реактивов и специфичности антител в качестве первых антител наносили на срезы неиммунную сыворотку - результаты были отрицательные. Для уменьшения и устранения фонового окрашивания уменьшали концентрацию первичных антител.
Рецепторы эстрогенов
Как установлено, развитие опухолей определяется специфическими изменениями на уровне клетки и гормонально-метаболическим фоном организма, который может оказывать влияние как на процесс злокачественной трансформации клетки, так и на последующие этапы роста и развития. Пока нет бесспорных доказательств прямого генотоксического действия природных эстрогенов, но возникающее при их воздействии усиление пролиферативной активности в тканях-мишенях может ускорить рост трансформированных клеток. Помимо того, в процессе интенсивного клеточного деления могут быть скопированы ошибки в структуре ДНК, что приводит к генетическим и эпигеномных изменениям (Сергеев П.В., Кареева Е.Н.,1994; Рыбин Е.П. с соавт., 1996).
Для ряда опухолей репродуктивной системы доказано, что достоверным критерием прогноза является уровень в опухоли рецепторов прогестерона. Рецепторный белок, связывающий прогестерон, синтезируется в клетке под влиянием эстрогенов, то есть является маркером присутствия в клетке биологически активных рецепторов эстрогенов и определенного эстрогенного воздействия (Kieback D.G. et al.,1993).
По данным литературы, у больных раком яичников уровень рецепторов прогестерона низкий как у больных репродуктивного возраста, так и в менопаузе. Однако при сопоставлении уровня рецепторов стероидных гормонов с длительностью ремиссии у больных раком яичников оказалось, что имеется выраженная положительная корреляция между уровнем рецепторов прогестерона и длительностью ремиссии. Таким образом, и в отношении рака яичников уровень рецепторов прогестерона в ткани может рассматриваться как критерий прогноза заболевания (Kieback D.G. et al.,1993; Geister J. et al., 1995).
Проведенные нами исследования показали, что рецепторы эстрогенов обнаруживаются в опухолевых клетках лишь в 12% случаев и только у больных умереннодифференцированной серозной папиллярной цистаденокарциномой и низкодифференцированной серозной папиллярной цистаденокарциномой. УДСЦ - умереннодифференцированная серозная папилярная цистаденокарцинома ВДЭЦ- высокодифференцированная эндометриоидная цистаденокарцинома УДЭЦ - умереннодифференцированная эндометриоидная цистаденокарцинома НДЭЦ - низкодифференцированная эндометриоидная цистаденокарцинома ННЦ-недифференцированная неклассифицируемая цистаденокарцинома Актуальность заболеваний, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией определяется высокой контагиозностью вируса, его широкой распространенностью, четко прослеживаемой тенденцией к росту заболеваемости, доказанной онкогенностью (De Villiers Е.-М., 1994). Папилломавирусная инфекция гениталий относится к инфекциям, передаваемым половым путем. За последнее десятилетие количество инфицированных больных в мире увеличилось более чем в 10 раз. Наиболее известным клиническим проявлением папилломавирусной инфекции являются остроконечные кондиломы аногенитальной области, частота которых, по данным Минздрава России, в 1994 г. составила 20,3 на 100 000 населения (Киселев Ф.Л., 1997). Передача вируса сексуальному партнеру происходит у 46 - 67% больных. Онкогенный потенциал папилломавирусов существенно варьирует; по способности инициировать диспластические (предраковые) изменения и рак папилломавирусы условно разделены на группы "высокого" и " низкого" риска возникновения опухолевой трансформации инфицированного эпителия. Типы HPV 6, 11, 42, 43, 44 были классифицированы как типы низкого риска развития рака, типы 16, 18, 48, 56 - высокого риска.
В литературе мы не нашли работ, посвященных изучению частоты выявления вируса папилломы человека в опухолевой ткани больных раком яичников. Если будет доказана этиологическая роли вируса в этом виде патологии, то это позволит пересмотреть тактику профилактики и лечения рака яичников.
Развитие дисплазии и рака при папилломавирусной инфекции является сложным процессом, зависящим от множества случайных биологических событий. У 90 % зараженных папилломавирусом вирус исчезает из организма в течение 3-х лет, однако в последующем часто происходит повторное инфицирование. Характерно, что за пятилетний период только у приблизительно 30 % зараженных папилломавирусом наблюдаются признаки патологических изменений клеток шейки матки, причем риск возникновения изменений в клетках высок в течение первого года после заражения вирусом и снижается в последующие четыре года (Wright Т. Jr., 2001).
В отдельных случаях может появиться "злокачественный" клон клеток, способный сохраниться и привести к раку. К факторам, усиливающим неопластическую роль вируса папилломы, относят множество инфекций, генетические особенности и состояние иммунного статуса. Одной из таких инфекций является герпетическая инфекция. Считают, что в этом случае HSV-2 может выступать кофактором канцерогенеза, инициируя развитие дисплазии и поддерживая ее в состоянии стабилизации.
![Повторные лапароскопические операции у больных злокачественными опухолями яичников [Электронный ресурс]](/i/i/4486/199130.png "Повторные лапароскопические операции у больных злокачественными опухолями яичников [Электронный ресурс] Шевчук Алексей Сергеевич")
