Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
Белки семейства Ras: структурная организация и биологические функции 9
Строение и внутриклеточная локализация белков Ras 9
Регуляция активности белков Ras 10
Эффекторы белков Ras 14
Биологические последствия конститутивной активации белков Ras 17
Влияние на пролиферацию клеток 17
Подавление апоптоза 18
Модификация микроокружения 19
Воздействие на подвижность клеток; связь с инвазией и метастазированием 20
Влияние на метаболизм 22
Транскрипционный фактор HSF1 23
Строение и активация HSF1 24
Строение HSF1 24
Активация HSF1 25
Позитивные и негативные регуляторы HSF1 31
Позитивные регуляторы активности HSF1 33
Негативные регуляторы активности HSF1 37
Биологические функции HSF1 и его роль в процессах канцерогенеза 41
Глава 2. Материалы и методы 51
Глава 3. Результаты исследования 60
Влияние активных форм белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов 60
Влияние экспрессии Ras на активность транскрипционного фактора HSF1 63
Влияние модификаций активности HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов
Влияние изменений активности HSF1 на размножение клеток in vitro 72
Влияние изменений активности HSF1 на рост клеток in vivo 75
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 78
Глава 5. Выводы 84
Список литературы 85
- Регуляция активности белков Ras
- Влияние на пролиферацию клеток
- Негативные регуляторы активности HSF1
- Влияние модификаций активности HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов
Введение к работе
Актуальность темы
Злокачественные новообразования возникают в результате накопления в
какой-либо из клеток организма мутаций в генах, продукты которых
контролируют важнейшие аспекты ее жизнедеятельности – размножение,
дифференцировку, метаболизм и др. В настоящее время известны сотни генов,
так или иначе принимающих участие в процессах канцерогенеза. Однако
многие детали молекулярных событий, ответственных за неопластическую
трансформацию клеток при тех или иных первичных нарушениях генома и
закономерности дальнейшей опухолевой прогрессии мутантных клонов с
различным генетическим ландшафтом изучены недостаточно. Между тем их
выяснение должно привести к более глубокому пониманию молекулярных
механизмов канцерогенеза, идентификации новых перспективных мишеней для
таргетной терапии новообразований, разработки новых способов
ингибирования опухолевой прогрессии и, как результат, улучшению результатов лечения онкологических заболеваний.
Онкогены семейства RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS) являются генами, мутации в которых наиболее часто встречаются в различных новообразованиях человека. Кодируемые этими генами белки Ras регулируют размножение, миграцию, жизнеспособность, метаболизм и дифференцировку клеток. При этом в зависимости от клеточного контекста, условий микроокружения и внутриклеточного уровня белков Ras, их влияние на судьбу клетки может сильно варьировать, и, в частности, либо способствовать неопластической трансформации, либо вызывать необратимую остановку клеточного цикла, старение и смерть клеток. В настоящее время, несмотря на многочисленные попытки, эффективных методов ингибирования действия онкогенного Ras в клинической практике не существует. Поэтому пополнение фундаментальных знаний о регуляции и функционировании онкобелков Ras имеет большое значение для поиска эффективных путей подавления вызываемой ими опухолевой прогрессии.
Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН было обнаружено, что экспрессия мутантных онкобелков Ras приводит к уменьшению экспрессии генов сестринов, контролирующих антиоксидантную активность пероксиредоксинов, и, как следствие, к увеличению внутриклеточного содержания активных форм кислорода (АФК), воздействующих на многие аспекты жизнедеятельности клеток. Кроме того, с помощью биоинформатического анализа, было установлено, что промоторы генов сестринов содержат потенциальные HSF1-респонсивные элементы. HSF1 – транскрипционный фактор, регулирующий синтез белков теплового шока, – в настоящее время рассматривается некоторыми исследователями в качестве новой перспективной мишени противоопухолевой таргетной терапии. Однако имеющиеся в литературе данные о роли HSF1 в процессах канцерогенеза весьма противоречивы. Выяснение закономерностей функционирования HSF1 в клетках, трансформированных онкобелками Ras, и изучение влияния на
опухолевый рост различных модификаций функции HSF1, может внести существенный вклад в поиск новых эффективных способов ингибирования опухолевой прогрессии.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение влияния экспрессии онкогенов RAS на активность транскрипционного фактора HSF1 и оценка биологических последствий различных изменений активности HSF1 в нормальных, иммортализованных и опухолевых клетках человека.
Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
-
Изучить влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на активность транскрипционного фактора HSF1 в нормальных фибробластах человека (ФЧ) и иммортализованных кератиноцитах (HaCaT).
-
Исследовать влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на внутриклеточное содержание активных форм кислорода (АФК) и экспрессию генов сестринов в ФЧ и HaCaT; изучить связь изменений уровня АФК и экспрессии генов сестринов с изменениями транскрипционной функции HSF1.
-
Создать лентивирусные векторы, экспрессирующие различные мутантные формы HSF1 (конститутивно-активную, доминантно-негативную); с помощью трансдукции созданных векторов изучить влияние разных модификаций функции HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в различных типах клеток (ФЧ, HaCaT, рак ободочной кишки HCT116, фибросаркома HT1080).
-
Изучить влияние различных модификаций функции HSF1 на скорость роста клеток разных типов в культурах in vitro.
-
Изучить влияние различных модификаций функции HSF1 на кинетику роста и васкуляризацию ксенографтов опухолевых клеток человека в бестимусных мышах.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Выполненные исследования позволили получить ряд приоритетных результатов.
Впервые установлено, что экспрессия активных форм онкобелка Ras
повышает внутриклеточное содержание АФК, репрессируя ген SESN3 счет
изменения активности регулирующего его транскрипционного фактора HSF1.
Выявлено противоположное действие онкобелка Ras на транскрипционную
активность HSF1 в различных клеточных контекстах, в частности в нормальных
фибробластах и иммортализованных кератиноцитах человека. Обнаружено, что
противоположные изменения активности HSF1 - увеличение активности в
кератиноцитах и понижение активности в фибробластах - ведут в данных
клеточных контекстах к сходным последствиям: репрессии гена SESN3,
повышению внутриклеточного уровня АФК, активации ингибитора
циклинзависимых киназ p21Cip1/Waf1 и замедлению скорости роста клеток in vitro.
Продемонстрировано ингибирующее влияние избирательного подавления экспрессии гена SESN3 на скорость роста культивируемых клеток.
При изучении влияния различных модификаций функции HSF1 на
кинетику роста ксенографтов рака ободочной кишки человека HCT116 в
бестимусных мышах показано, что ингибирование транскрипционной
активности HSF1 увеличивает скорость опухолевого роста, а активация
функции HSF1 приводит к противоположному эффекту. Эти эффекты, по
крайней мере, частично, связаны с изменениями активности ключевых
регуляторов клеточного цикла и ангиогенеза – белков Erk1/2 и HIF-1. Таким
образом, предлагаемое в качестве нового терапевтического подхода
ингибирование функции HSF1 приводит в исследованной модели не к
замедлению, а к ускорению опухолевого роста, тогда как активация функции
HSF1, наоборот, замедляет опухолевую прогрессию. Противоположные
эффекты ингибирования активности HSF1 на скорость роста опухолевых
клеток, полученные на разных моделях/клеточных линиях в условиях in vitro и
in vivo, указывают на необходимость проведения более углубленных
исследований для оценки возможности и путей использования
транскрипционного фактора HSF1 в качестве терапевтической мишени.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 5 июня 2013 года на совместной научной конференции лабораторий цитогенетики, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, механизмов химического канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объем диссертации
Регуляция активности белков Ras
Белки Ras локализованы на внутренней стороне плазматической мембраны, где они могут эффективно взаимодействовать как со своими активаторами, так и с эффекторами. Для ассоциации белков Ras с мембраной необходима посттрансляционная модификация их С-конца. В этом процессе критическую роль играет мотив СААХ. На первом этапе с помощью фермента фарнезилтрансферазы происходит образование ковалентной связи между изопреноидом фарнезилом (С15) и цистеиновым остатком в мотиве СААХ. Пренилирование цистеина является сигналом для локализации белка на цитозольной стороне эндоплазматического ретикулума и двух последующих модификаций: (1) эндопротеолитического удаления последовательности ААХ, катализируемого Ras-конвертирующим ферментом-1 (Rce1) и (2) карбоксиметилирования теперь ставшего терминальным изопренилированного цистеинового остатка с помощью фермента изопренилцистеин карбоксиметилтрансферазы-1 (Icmt1) [12]. Модификации мотива СААХ являются необходимым, но недостаточным условием для связывания белков Ras с внутренней стороной плазматической мембраны. Для функционирования белков Ras и их стабильного взаимодействия с мембраной также необходимы сигналы, поступающие из гипервариабельного района, расположенного перед мотивом СААХ. Для белков H-Ras, N-Ras и K-Ras4A этими вторичным сигналом служит образование дополнительной ковалентной связи между пальмитиновой жирной кислотой и остатком цистеина в мотиве СААХ. K-Ras4В содержит домен, состоящий из многоосновных аминокислот, в основном это остатки лизина, который и является вторичным сигналом для его связывания с мембраной [12, 14].
Различные формы белков Ras взаимодействуют с разными участками плазматической мембраны, что обуславливается не только наличием у них уникального «якорного» мотива, но и различием в механизмах доставки белков к мембране. Например, белок H-Ras взаимодействует преимущественно с холестерол-богатыми микродоменами плазматической мембраны. Белки H-Ras и N-Ras транспортируются к мембране через аппарат Гольджи, где они подвергаются пальмитилированию, тогда как K-RasВ, вследствие наличия у него участка, состоящего из многоосновных аминокислот, из эндоплазматического ретикулума напрямую направляется к мембране, минуя аппарат Гольджи [14].
Регуляция активности белков Ras
Как было отмечено выше, суперсемейство Ras представляет собой малые ГТФазные белки, которые активны в ГТФ-связанном и неактивны в ГДФ-связанном состоянии. Активное/неактивное состояние регулируется двумя типами регуляторных белков: GEF, обменивающих ГДФ на ГТФ, и GAP, осуществляющих гидролиз ГТФ до ГДФ. Таким образом, белки GEF являются положительными регуляторами активности белков Ras, а белки GAP, соответственно, отрицательными. При этом для каждого члена суперсемейства Ras существует свой набор регуляторных белков, которые могут связываться с ним с разной степенью аффинности. GAPs и GEFs являются многодоменными белками. Многие из этих доменов представляют собой участки для связывания белков или липидов, что указывает на то, что они служат в качестве сигналов локализации и/или предоставляют «площадку» для формирования белковых комплексов [22].
Для эффективного гидролиза ГТФ, осуществляемого белками GAP, критическое значение имеют следующие моменты: правильная ориентация атакующей молекулы воды и ее поляризация; «захват» этой молекулы из активного сайта, а также стабилизация переходного состояния. Так, например, результатом мутации глутамина-61 в белке Ras, участвующего в координации молекулы воды, является невозможность осуществления GAP-индуцируемого гидролиза [22]. В семейство белков RasGAP, являющихся негативными регуляторами активности Ras, входят следующие белки: р120, NF1, RASAL, CAPRI, а также AIP1. р120 является наиболее изученным представителем RasGAP. Он имеет комплексную модулярную структуру и состоит из С-концевого каталитического GAP домена, участвующего во взаимодействии с ГТФазами; двух аминоконцевых SH2 доменов, фланкирующих SH3 домен, а также РН домена и кальций-зависимого фосфолипид связывающего домена, необходимого для связывания с внутренней стороной плазматической мембраны. На N-конце он также содержит последовательность, богатую пролином и участвующую во взаимодействии с представителями семейства Src киназ [72]. Наличие домена GAP необходимо и достаточно для гидролиза RasГТФ. Однако для приобретения полной каталитической активности и эффективной стимуляции гидролиза на внутренней стороне плазматической мембраны важно взаимодействие р120GAP с другими факторами. Например, одним из таких факторов является PDGF. Он связывается со своим рецептором, что приводит к аутофосфорилированию его (рецептора) цитоплазматического домена и взаимодействию со вторым доменом SH2 белка р120GAP. Подобным образом р120GAP может связываться и с активированным рецептором эпидермального фактора роста (EGF). Взаимодействие р120GAP с рецепторами является общим механизмом, стимулирующим последующий гидролиз ГТФ, осуществляемый GAP доменом [72].
Нейрофибромин (NF1) является продуктом гена опухолевого супрессора NF1. Инактивация NF1 приводит к гиперактивности белков Ras в опухолевых клетках. В клетках нейрофибросаркомы, а также клетках, полученных от больных лейкемией, наблюдается снижение GAP активности белка NF1 и повышение уровня RasГТФ. что приводит к последующей активации его эффекторов. GAP домен нейрофибромина гомологичен таковому у белка р120GAP, однако их совместная экспрессия во многих типах тканей говорит об их функциональных различиях. Так, нейрофибромин имеет более низкие Км и Ккат для связывания RasГТФ и для гидролиза ГТФ, соответственно, что указывает на его высокую эффективность при низких концентрациях RasГТФ, тогда как р120GAP функционирует при более высоком содержании RasГТФ, а также активируется в ответ на сигналы, поступающие от факторов роста [72].
GAP белки RASAL и CAPRI являются Са2+-зависимыми; их транслокация на плазматическую мембрану индуцируется повышением содержания Са2+. Однако механизмы ответа несколько различаются: RASAL, следуя колебаниям в уровне кальция, постоянно перемещается между мембраной и цитозолем, тогда как CAPRI остается связанным с мембраной после кальций-зависимой стимуляции [22].
Влияние на пролиферацию клеток
Один из путей, ведущий к активации HSF1, связан с активацией сигнального пути, регулируемого RalГТФ. Дело в том, что было обнаружено взаимодействие между HSF1 и эффектором белка Ral – RalBP1 как in vitro, так и in vivo. Под действием теплового шока происходит переход неактивной формы RalГДФ в активную форму RalГТФ. Вследствие того, что RalГТФ имеет высокое сродство к RalBP1, происходит диссоциация комплекса RalBP1-HSF1-HSP90--тубулин и высвобождение HSF1. Кроме того, в данный гетерокомплекс могут входить некоторые протеинкиназы, которые также могут активироваться в ответ на активацию Ral. Они, в свою очередь, могут фосфорилировать и активировать HSF1. Так как активация Ral может быть кальций-зависимой, то на роль данных протеинкиназ претендуют кальций-зависимые протеинкиназы, такие как протеинкиназа С, протеинкиназа G, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа [110, 228].
Одними из регуляторов активности HSF1 являются киназы, осуществляющие фосфорилирование фактора по различным аминокислотным остаткам, что приводит либо к активации HSF1, либо к его дезактивации в зависимости от фосфорилируемого остатка.
Одной из таких киназ является 3 -5 -циклический аденозинмонофосфат зависимая протеинкиназа А (PKA), которая связывается с транскрипционным фактором HSF1 in vivo и in vitro и фосфорилирует его по серину-320, что способствует накоплению HSF1 в ядре [158]. PKA, участвующая в регуляции клеточного метаболизма и транскрипции генов, состоит из двух субъединиц: регуляторной (PKAr) и каталитической (PKAc). HSF1 связывается с PKAc ( форма), но не с регуляторным доменом. При этом происходит фосфорилирование фактора киназой по Сер-320, который находится в центре регуляторного домена HSF1, что приводит к накоплению фактора в ядре и в ядерных стрессовых телах, его связывание с промотором гена HSP70.1 и последующей активации транскрипции. Результатом снижения уровня PKAc является транслокация HSF1 из ядра и уменьшение уровня транскрипции HSP70.1. Предполагается, что протеинкиназа А, фосфорилируя HSF1 по Сер-320, меняет направление ядерного экспорта [158], однако точных данных пока нет. Необходимо отметить, что в отсутствие стресса в некоторых клетках (HeLa, MCF-7) небольшое количество HSF1 связано с PKAc и фосфорилировано по Сер-320, что согласуется с тем фактом, что HSF1 во многих злокачественных клетках человека обладает базовой транскрипционной активностью, необходимой для выживания этих клеток [58, 206].
Еще одной киназой, регулирующей активацию HSF1, является PLK1, которая фосфорилирует HSF1 по серину-419, что также способствует его накоплению в ядре [126]. PLK1 является важным регулятором прогрессии клеточного цикла. Кроме того, PLK1, наряду с другим членом семейства, PLK3 способствуют развитию и прогрессии многих типов опухолей [194, 204]. Подобно PKAc PLK1 слабо взаимодействует с HSF1 при нормальных условиях, однако действие теплового шока в значительной степени усиливает это взаимодействие. Кроме того, в комплексе PLK1-HSF1 был также идентифицирован еще один известный партнер HSF1 – HSP90 [126].
Как сказано выше, под действием теплового шока PLK1 фосфорилирует HSF1 по Сер-419, однако совершенно другая ситуация наблюдается в процессе митоза [130]. PLK1, являющаяся одной из основных киназ, регулирующих процесс митоза, может временно связываться с различными митотическими структурами: полюсами веретена деления, кинетохорами, центральным веретеном. В прометафазе PLK1 напрямую фосфорилирует HSF1 по серину-216, что приводит к ассоциации фосфо-HSF1 с полюсами веретена деления, что необходимо для правильного расположения хромосом в метафазе. Для выхода клетки из митоза требуется разрушение фосфо-HSF1. Ингибирование процесса деструкции фосфо-HSF1 приводит к продлению стадии митоза. Разрушение фосфо-HSF1 происходит за счет его связывания с убиквитинлигазой SCFrCP (rCP). В результате нокдауна rCP или трансфекции rCP, не обладающей функцией убиквитинирования, происходит ингибирование деградации фосфо-HSF1, стабилизация циклина В1 и продление митоза. Сразу после фосфорилирования HSF1 по Сер-216 PLK1 происходит связывание фосфо-HSF1 с Cdc20, и это взаимодействие приводит к ингибированию активности АРС [130]. Гиперэкспрессия Cdc20 ингибирует rCP-зависимую деградацию фосфо-HSF1. После разрушения фосфо-HSF1 происходит взаимодействие Cdc20 с АРС и переход клетки из метафазы в анафазу. Кроме того, HSF1 способствует связыванию Cdc20 с Mad2, что необходимо для прохождения чекпоинта [130].
Протеинкиназа CK2 (казеин киназа 2) также является положительным регулятором активности HSF1. Под действием теплового шока CK2 может активироваться и транслоцироваться в ядро. Ее активность возрастает в несколько раз, одновременно усиливается транскрипция генов теплового шока. При совместной инкубации CK2 и HSF1 уровень фосфорилирования последнего увеличивается. CK2 фосфорилирует HSF1 по треонину-142, расположенному в первом мотиве «лейциновая молния», который участвует в процессах тримеризации и связывания HSF1 с HSE. Фосфорилирование киназой CK2 HSF1 по Тре-142 играет важную роль в трансактивации последнего. Считается, что фосфорилирование Тре-142 является необходимым, но недостаточным условием для полной трансактивации промотора HSP70В [197]. САМКII (кальций/кальмодулин зависимая киназа II) также участвует в положительной регуляции трансактивации HSF1. Результатом активации CAMKII является фосфорилирование определенных белков, участвующих во многих важнейших физиологических и патологических процессах, таких как, захват Ca2+, сокращение мускулатуры [106, 168]. CAMKII фосфорилирует HSF1 по серину-230, который находится в консенсусной последовательности, узнаваемой данной протеинкиназой. Сер-230 расположен в регуляторной области транскрипционного фактора HSF1.
Фосфорилирование Сер-230 необходимо для транскрипционной активации HSF1 и не влияет на его связывание с ДНК. Наличие фосфосерина-230 обнаружено в комплексе HSF1 с ДНК, а также в ядерных стрессовых телах. Сер-230 фосфорилируется и в нормальных условиях, но количество фосфосерина существенно увеличивается под действием теплового шока. Результатом гиперэкспрессии активной формы САМКII является увеличение уровня эндогенного фосфосерина-230 и трансактивация HSF1. Ингибирование САМКII приводит к снижению транскрипционной активности HSF1 [106]. В работе, проведенной на кардиомиоцитах крысы, показали, что В изоформа САМКII локализуется в ядре, и именно она осуществляет индуцированное стрессом фосфорилирование HSF1 по Сер-230, увеличение его транскрипционной активности и повышение уровня экспрессии iHSP70 (также известен, как HSP72) [168].
Недавно было обнаружено, что убиквитарный высококонсервативный белок eEF1A (фактор элонгации трансляции) является ко-активатором транскрипционного фактора HSF1 [192]. Небольшое количество комплекса HSF1-eEF1A присутствует в клетках в нормальных условиях. Действие теплового шока приводит к значительному увеличению количества этого комплекса с достижением максимума на 30 минуте воздействия и возвращением к исходному уровню через час после его снятия. Однако действие одного фактора eEF1A не приводит к активации HSF1. Третьим компонентом комплекса HSF1-eEF1A, необходимым для активации HSF1, является не кодирующая РНК – HSR1 (РНК-1 теплового шока). С помощью антисмысловых ДНК олигонуклеотидов было идентифицировано 2 домена в HSR1, участвующих в активации HSF1: 84 нуклеотида на 5 -конце и нуклеотиды со 157 по 240.
Негативные регуляторы активности HSF1
Анализ люциферазной активности Проводили, используя Steady-Glo Luciferase Assay System (E2510, Promega), согласно протоколу производителя; полученные значения нормализовали по концентрации белка. Определение скорости роста клеточных культур. Клетки рассевали в 6-луночные плашки по 20 тысяч. Каждые два дня клетки трипсинизировали и считали, используя гемацитометр. Эксперимент повторяли три раза.
Измерение уровня активных форм кислорода
Для измерения уровня АФК в клетках использовали способность к флюоресценции 2 -7 дихлородигидрофлуоресцин диацетата (DCF-DA) при его окислении. Клетки инкубировали в среде DMEM в присутствии 5мкМ DCF-DA (Sigma) в течение 30 мин, промывали холодным раствором PBS, обрабатывали 0,25% раствором трипсина и переносили в полипропиленовые пробирки. Анализ флюоресценции DCF проводили при помощи проточного цитофлюориметра фирмы Becton Dickinson и программного обеспечения Cell Quest 3.2.
Иммунофлуоресцентная микроскопия
Клетки рассеивали на стекла (SlideFlask, NUNCLON); на 10-12 день после введения RasV12 проводили фиксацию с помощью метанола/формальдегида, отмывали несколько раз в растворе PBS, инкубировали с первичными антителами к HSF1 (#2923, abcam) в течение 1 часа при комнатной температуре. Детекцию проводили с использованием Alexa488-конъюгированных вторичных антител (Invitrogen) в течение 30 мин при комнатной температуре. Визуализацию проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Goettingen, Germany).
Анализ роста опухолевых ксенографтов.
В работе использовались самки бестимусных мышей линии D2J в возрасте 6-8 недель. Каждому животному подкожно прививалось по 2 опухоли (106 клеток, суспендированных в 100 мкл физиологического раствора). Размер опухолей измерялся каждые 3 дня, их объем высчитывался по формуле: (ширина)(длина)0.5. Продолжительность эксперимента составляла 3 недели для роста ксенографтов НСТ116. Образовавшиеся опухоли эксплантировали и проводили иммуногистохимический анализ. Эксперименты повторяли как минимум 2 раза. Протокол работы с животными был утвержден Комитетом Этики по Экспериментам над Животными; эксперименты проводили в соответствие с правилами проведения экспериментов над животными, принятыми в Институте Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина.
Иммуногистохимический анализ.
Ткани опухолей фиксировались в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов и заключались в парафин. Срезы толщиной 5мкм окрашивались моноклональными антителами к CD34 (553731, BD Biosciences Pharmingen) и HIF-1 (Ab8366, Abcam). Связывание первичных антител детектировалось с помощью меченных биотином антикрысиных вторичных антител (559286, BD Biosciences Pharmingen) с последующей обработкой препарата стрептавидином-HRP (K0690, Dako). Связывание первичных антител к HIF-1 детектировали с помощью анти-мышиной Labelled Polymer-HPR (K4006; Dako). Активность пероксидазы выявляли с помощью 3 ,3 -диаминобензидина (DAB; K3468, Dako) согласно протоколу производителя. После этого препараты окрашивали гематоксилином.
Подсчет количества сосудов в опухоли. Подсчет CD34-позитивных кровеносных сосудов и капилляров проводился под микроскопом при увеличении 10. Ангиогенез в опухолях оценивался по среднему суммарному количеству сосудов с просветами, относительно крупных (100 мкм) сосудов, и недоразвитых сосудов. Статистический анализ. Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для определения статистической значимости различий использовался тест Манна-Уитни. Глава 3. Результаты исследования
Влияние активных форм белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов
Задачи диссертационной работы включали: а) изучение влияния экспрессии активных белков Ras на содержание АФК и уровень мРНК генов сестринов; б) выяснение вопроса являются ли эти эффекты HSF1-зависимыми; и, в) оценку биологических последствий данных эффектов. Для решения поставленных задач был создан набор сублиний HaCaT и культур ФЧ, экспрессирующих экзогенные активные мутантные белки H-Ras, с заменами аминокислот в кодонах: 12 (RasV12), 12 и 40 (RasV12C40), 12 и 37 (RasV12G37) и 12 и 35 (RasV12S35). Данные мутанты являются доминантно-активными формами белка Ras; двойные мутанты способны активировать лишь определенный сигнальный путь (Табл. 3).
Влияние модификаций активности HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов
Итак, мы продемонстрировали зависимость Ras-индуцированного снижения экспрессии гена SESN3 и увеличения уровня внутриклеточных АФК от изменений транскрипционной активности белка HSF1. Кроме того, нами было установлено, что в клетках с подавленной за счет введения shHSF1 активностью HSF1 экспрессия белка RasV12 не влияет на уровень мРНК гена SESN3 и содержание АФК. Результаты данной работы показывают, что, в дополнение к ранее описанным механизмам регуляции экспрессии генов сестринов – транскрипционным фактором р53 [28] и белками семейства FoxO [39] – существует еще один путь, опосредованный транскрипционным фактором HSF1. р53 вовлечен в регуляцию экспрессии генов SESN1 и SESN2, тогда как белки FoxO – гена SESN3, поэтому можно предположить участие и HSF1, и белков FoxO в Ras-индуцированном снижении уровня мРНК гена SESN3. Однако наши данные об отмене влияния активного белка Ras на экспрессию гена SESN3 и уровень АФК в клетках с подавленной активностью HSF1 указывают на первичную роль HSF1 в осуществлении этих эффектов по крайне мере в иммортализованных кератиноцитах человека линии HaCaT.
Идентифицированный нами сигнальный путь Ras/HSF1/SESN3 в конечном итоге приводит к увеличению содержания внутриклеточных АФК, которые, как известно, являются вторичными мессенджерами и участвуют в регуляции разнообразных клеточных процессов: пролиферации, метаболизма, апоптоза, старения и др. [83, 145, 174]. Судьба клетки при повышении АФК зависит от того, насколько сильно изменилась их концентрация в клетке – они могут, как способствовать клеточной пролиферации, вызывать генетическую нестабильность и процесс трансформации, так и снижать скорость роста клеток, приводить к развитию преждевременного старения [63]. Влияние АФК на клеточные процессы также зависит от клеточного контекста: одно и то же изменение в содержании АФК в различных типах клеток может приводить к разным, и даже, противоположным эффектам [35]. Изменение скорости пролиферации клеток может являться одним из показателей по какому потенциальному пути – трансформации/опухолевой прогрессии или остановки пролиферации/апоптозу – пойдет клетка после повышения концентрации внутриклеточных АФК. Мы решили оценить скорость роста клеточных культур как одно из возможных последствий увеличения АФК.
Нами было продемонстрировано, что уменьшение уровня экспрессии гена SESN3 как за счет модификаций фактора HSF1, так и при введении shSESN3 в различных типах клеток (нормальные фибробласты, HaCaT, HCT116) приводит к снижению скорости роста клеточных культур, тогда как повышение содержания мРНК гена SESN3 и, как следствие, уменьшение уровня АФК не влияет на время удвоения клеток in vitro. Эти данные указывают на то, что HSF1-индуцированное SESN3-зависимое снижение скорости роста клеток связано скорее с функциями гена SESN3, включающими регуляцию содержания внутриклеточных АФК, чем с какой-либо другой, независимой от процессов окисления-восстановления, его активностью, как например, способностью стресс-индуцированных или эктопически экспрессирующихся генов сестринов, включая SESN3, к уменьшению синтеза белка, клеточного рост и/или стимуляции аутофагию посредством активации аденозин-3 ,5 -монофосфат (АМФ)-зависимой протеин киназы AMPK или за счет ингибирования мишеней рапамицин-чувствительного комплекса TORC1 [27]. Об этом свидетельствует тот факт, что независимое от окислительно-восстановительных процессов антипролиферативное влияние гена SESN3 наблюдали при его повышенной экспрессии, тогда как мы показали редокс-зависимое снижение скорости роста клеточных культур при пониженном уровне мРНК гена SESN3.
Результаты нашей работы также указывают на то, что одним из возможных механизмов замедления скорости роста клеток при уменьшении уровня экспрессии гена SESN3 является р53-опосредованное повышение содержания белка p21Cip1/WAF1, являющегося ингибитором циклин-зависимой киназы 2 (Cdk2). Однако вследствие того, что в одном клеточном контексте (фибробласты) мы наблюдали заметную корреляцию между повышением содержания белка р53 и уровнем p21Cip1/WAF1, а в других типах клеток эта взаимосвязь было либо менее выражена (HaCaT) или практически отсутствовала (HCT116), то мы предполагаем наличие дополнительных р53-независимых механизмов увеличения содержания белка p21Cip1/WAF1, особенно в иммортализованных и опухолевых клетках. Их выявление является темой дальнейших исследований.
В последнее время ингибирование активности транскрипционного фактора HSF1 все чаще рассматривают в качестве мишени для таргетной терапии опухолей [196, 231]. Однако как было отмечено в главе «Обзор литературы» данные об участии HSF1 в процессах канцерогенеза противоречивы. Многие работы демонстрируют, что подавление активности HSF1 негативно влияет на развитие опухолей. Однако следует отметить, что в большинстве таких работ использовались опухолевые клеточные культуры, которые дополнительно подвергали либо воздействию онкогенов [123], либо ингибировали в них функции опухолевых супрессоров, в частности гена р53 [58]. Например, в одной из недавних работ [162] было показано противоположное влияние HSF1 на клоногенный рост клеток в зависимости от наличия в них мутантного р53 или р53 дикого типа. Результаты других работ показывают, что, наоборот, повышение активности HSF1 может препятствовать развитию процессов канцерогенеза в определенных условиях. Все эти противоречия могут объясняться условиями проведения экспериментов, различиями в наборе факторов, которыми воздействовали на клеточные культуры, а также типом исследуемых клеток. Данные недавней работы с использованием ChIP-Seq анализа как раз указывают на то, что мишени транскрипционного фактора HSF1 (а, следовательно, и последствия воздействия на них) могут сильно варьировать в зависимости от клеточного контекста [150].
В настоящей работе мы решили оценить влияние экспрессии конститутивно-активного фактора HSF1 на скорость роста клеток HCT116 in vivo, не подвергая их никаким дополнительным воздействиям. Было обнаружено снижение скорости роста опухолей, экспрессирующих активную форму HSF1, что согласуется с нашими данными по анализу скорости пролиферации клеток in vitro. Наряду с пролиферативной мы также наблюдали снижение и ангиогенной активности, на что указывало уменьшение числа сосудов с просветами. Также было продемонстрировано снижение количества белков, являющихся ключевыми регуляторами пролиферативной и ангиогенной активностей – Erk1/2 и HIF1, соответственно. Таким образом, мы показали, что в данном клеточном контексте (рак ободочной кишки человека) при отсутствии дополнительных факторов экспрессия конститутивно-активной формы HSF1 по крайне мере не способствует развитию опухолей.
Похожие диссертации на Изменение активности транскрипционного фактора HSF1 при экспрессии онкогенов RAS: механизмы и роль в канцерогенезе
![Зависимость изменения активности свободнорадикальных процессов от сроков развития острого панкреатита [Электронный ресурс]](/i/i/4282/196469.png "Зависимость изменения активности свободнорадикальных процессов от сроков развития острого панкреатита [Электронный ресурс] Ивченко Глеб Сергеевич")