Введение к работе
Актуальность проблемы
При опухолевой прогрессии нарушаются не только механизмы нормальной пролиферации клеток, но и их локомоторная активность, что приводит к таким проявлениям «асоциального» поведения опухолевых клеток, как инвазивный рост и метастазирование.
На клеточном уровне основой возникновения этих свойств являются генетические изменения, приводящие к нарушению регуляции адгезии и подвижности клеток (Yamazaki et al., 2005). Установлено, что в этих процессах определяющую роль играют перестройки цитоскелетных структур. Трансформированные клетки зачастую отличаются от нормальных по своей морфологии и организации цитоскелета (Bershadsky and Vasiliev, 1988). Реорганизации цитоскелета, особенно изменения клеточной сократимости, регулируемой актин-миозиновым комплексом, имеют центральное значение для развития фенотипа морфологически трансформированных клеток с инвазивным поведением. Редукция стресс-фибрилл, характерная для многих типов трансформированных клеток, сопряжена с нарушением созревания контактных структур (Ровенский и Васильев, 2004) и часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994; Sahai and Marshall, 2003).
Таким образом, изучение механизмов нормальной подвижности клетки и нарушений этих механизмов является одной из важнейших задач современной клеточной биологии.
Согласно современным данным, главную роль в определении локомоторного фенотипа играет динамическое взаимодействие двух основных систем цитоскелета – микротрубочек (МТ) и актин-миозиновой системы, создающей внутри клетки и в окружающем ее матриксе механическое натяжение, регулируемое молекулярной системой малых ГТФ-аз семейства Rho. Предыдущие работы нашей лаборатории дают основание предположить, что одним из ключевых событий в приобретении способности к инвазии является Rho-зависимое снижение актин-миозиновой контрактильности при сохранении структуры и активности системы МТ. Заслуживает внимания дальнейшее исследование механизмов Rhо-зависимой регуляции реорганизаций цитоскелета, а также формы, адгезии и движения в одном из основных морфологических типов клеток – в фибробластах.
Цель и задачи исследования
Целью работы является изучение роли актин-миозиновой системы в определении морфологии и подвижности фибробластов в норме и при RAS-трансформации. Мы использовали клетки линии REF52tetRas с тетрациклин-регулируемой экспрессией онкогена RAS, в которых отмывка тетрациклина приводит к синтезу конститутивно активного белка и к морфологической трансформации клеток (Kopnin et al., 2003; Alexandrova et al., 2006).
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать изменения морфологии, подвижности и направленности движения нетрансформированных фибробластов при подавлении актин-миозиновой сократимости (с помощью ингибиторов Y27632 и блеббистатина) по следующим пунктам:
- исследование строения цитоскелетных структур и фокальных контактов иммунофлуоресцентными методами;
- видеонаблюдение с целью изучения поведения индивидуальных клеток;
- оценка скорости и степени распластывания клеток с помощью компьютерного морфометрического анализа;
- оценка эффективности направленной миграции клеток в экспериментальную рану;
- ультраструктурное исследование цитоскелета методом платиновых реплик;
- исследование динамики восстановления актин-миозиновых структур после отмывки ингибиторов сократимости.
2. Охарактеризовать изменения в морфологии и подвижности фибробластов при RAS-трансформации.
3. Сравнить изменения в морфологии и локомоторном поведении трансформированных и нетрансформированных клеток в присутствии агентов, изменяющих организацию актин-миозинового цитоскелета (Y27632, блеббистатин, латрункулин А, цитохалазин D).
Научная новизна и практическая значимость работы
Необходимость дальнейших исследований молекулярных и клеточных механизмов морфологической трансформации и инвазивных миграций опухолевых клеток не подлежит сомнению. Взаимодействие различных компонентов цитоскелета и регуляторные пути при развитии инвазивного фенотипа еще не достаточно изучены.
В настоящей работе впервые проведен детальный анализ динамики актин-миозинового цитоскелета и локомоторного поведения трансформированных фибробластов в сравнении с нетрансформированными, а также проанализирована роль двух основных процессов – полимеризации актина и актин-миозинового сокращения – в клеточной подвижности.
В последние годы получены новые соединения, избирательно меняющие активность белков, регулирующих динамику цитоскелета, это Y27632, ингибитор активирующей миозин Rho-киназы (Ishizaki et al., 2000), и блеббистатин, ингибитор немышечного миозина II (Straight et al., 2003). В нашей работе впервые проведено сравнение локомоторных реакций нормальных и трансформированных фибробластов на эти агенты, а также на ингибиторы полимериации актина (латрункулин А и цитохалазин D).
Мы показали, что трансформированные клетки имеют сходство с клетками, обработанными ингибиторами сократимости: это усиление локомоторной активности на фоне ослабления/разрушения системы актин-миозиновых пучков. Однако, в отличие от трансформированных клеток, нормальные фибробласты сохраняют способность к направленному движению и под действием ингибиторов сократимости, которое поддерживается системой МТ.
Показано, что трансформированные клетки иначе реагируют на низкие концентрации ингибиторов полимеризации актина, а именно утрачивают актин-миозиновые пучки, но не псевдоподиальную активность. Напротив, нормальные клетки утрачивают активность края, но сохраняют пучки.
Впервые показано, что минимальная активность немышечного миозина II играет ключевую роль в первичном прикреплении и эффективной протрузии клеточного края. Также показано, что организация миозина в «рабочие единицы» – биполярные филаменты – зависит от степени и характера развития стресс-фибрилл в клетке.
Таким образом, ослабление актин-миозиновой системы в значительной мере обуславливает усиление подвижности RAS-трансформированных клеток, хотя, вероятно, ненаправленность движения обусловлена активацией других сигнальных путей, ведущих от онкобелка Ras к цитоскелету.
Изучение механизмов регуляции перестроек цитоскелета и подвижности клеток, возможно, в дальнейшем откроет подходы к направленному исправлению молекулярных и клеточных нарушений, приводящих к инвазии, например, через нормализацию функций регуляторных белков, в частности, Rho-системы.
Апробация работы
Диссертация апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, иммунохимии, генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и отдела математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 30 сентября 2009 г.
Материалы диссертационной работы были представлены на XII и XIII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005 и 2006); на конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006); на конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); на ХII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2008); а также на международных конференциях The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting (San Francisco, 2008) и The American Society for Cell Biology 49th Annual Meeting (San Diego, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы
