Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Электрофизиолофические характеристики сердечных фибробластов 9
2. Роль механосенситивных каналов в формировании электрического ответа клетки.
19
3. Роль цитоскелета в регуляции воротного механизма механосенситивных ионных каналов у электроневозбудимых клеток 23
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 29
1. Объект исследований 29
2. Метод получения препарата правого предсердия 30
3. Перфузионная среда 31
4. Факторы воздействия на клетки 32
4.1. Электрические стимулы 32
4.2. Механические раздражители 32
4.3. Химические соединения 32
5. Микроэлектроды 35
6. Экспериментальная установка для микроэлектродных исследований клеток возбудимых тканей 36
6.1. Электронно-измерительная система 36
6.2. Система жизнеобеспечения изолированного препарата правого предсердия 37
6.3. Электронно-измерительная аппаратура для регистрации сократительной активности фрагментов предсердий и их механической стимуляции 37
7. Характеристика регистрируемых параметров фибробластов 39
8. Методы обработки результатов экспериментов 40
ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 41
1. Электрофизиологическое исследование фибробластов в правом предсердии крыс
1.1. Электрофизиологическая идентификация фибробластов 41
1.2. Изменения МІР, вызванные спонтанными сокращениями ткани, в условиях длительной перфузии ткани физиологическим раствором 42
2. Влияние внутриклкточной диффузии соединений, деполимеризующих и стабилизирующих цитоскелет на механоиндуцированные потенциалы фибробластов в правом предсердии крыс 44
2.1. Влияние Cytochalasin D на биоэлектрическую активность фибробластов 46
2.2. Влияние Colchicine на биоэлектрическую активность фибробластов. 50
2.3. Влияние совместного введения Cytochalasin D и Colchicine на биоэлектрическую активность фибробластов 55
2.4. Влияние АТР на биоэлектрическую активность фибробластов 59
2.5. Влияние совместного введения Cytochalasin D и АТР на биоэлектрическую активность фибробластов 62
2.6. Влияние GTP на биоэлектрическую активность фибробластов 65
2.7. Влияние Тахої на биоэлектрическую активность фибробластов 68
2.8. Влияние совместного введения Colchicine и GTP на биоэлектрическую активность фибробластов 70
2.9. Влияние совместного введения Colchicine и Такої на биоэлектрическую активность фибробластов 73
3.Обсуждение результатов 75
ВЫВОДЫ 84
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 87
- Электрофизиолофические характеристики сердечных фибробластов
- Химические соединения
- Электрофизиологическая идентификация фибробластов
Введение к работе
В последние годы большое внимание уделяется изучению биоэлектрических свойств сердечных фибробластов и их роли в регуляции работы сердца с позиций механоэлектрической обратной связи в миокарде. Известно, что миокард содержит две группы клеток. Первая группа - кардиомиоциты, представляющие собой электровозбудимые сократительные клетки и вторая группа - не мышечные клетки, которые электроневозбудимы. Эта последняя группа состоит из различных клеточных типов, где доминируют фибробласты. Фибробласты достаточно широко представлены в сердце [122,126,134]. В целом сердце млекопитающих количество фибробластов составляет приблизительно 5% - 10% от общего количества клеток [25]. Их количество особенно велико в зоне синусного узла, где по данным разных авторов оно составляет от 45% [159] до 75% [39] общего количества клеток. Хотя в сердце представлены различные немышечные клетки, фибробласты среди них доминируют. Показано, что среди всех немышчных клеток сердца их более 90% [44]. Несмотря на то, что наличие фибробластов в сердце известно давно, их роль в работе сердца и механизмы их функционирования начали изучать относительно недавно. До последнего времени значение фибробластов оценивалось исключительно с позиций создания ими опорных структур сердца. Однако, было предположено, что фибробласты играют роль не только структурного скелета, но выполняют и другие функции. В первую очередь, было показано, что фибробласты сердца синтезируют и выделяют различные биологически-активные вещества [24,28,30,31,32,45,46,53,119, 131,155,164,172,173,174,176,177,179], и, следовательно, принимают участие в регуляции работы сердца [28,45,64,95,103,110,114,155,174,176,177,178,179]. Однако, как показано в последние годы, эти клетки могут играть роль и в процессах электрогенеза сердца.
Впервые электрофизиологические характеристики фибробластов целого бьющегося сердца и их межклеточное взаимодействие были описаны A. Kamkin и I. Kiseleva в 1986 году [75,77] как исследование "атипичных" не мышечных клеток сердца. В дальнейших исследованиях с одновременным применением микроэлектродной техники и гистологических методов этой рабочей группой было показано, что изучаемые "атипичные" клетки сердца являются фибробластами [76,106].
Показано, что фибробласты сердца являются электроневозбудимыми [6,92] но механосенситивными [6,98,100,101] клетками, то есть как фибробласты других типов, имеют ионные каналы, реагирующие на сжатие или растяжение [6] и являющиеся потенциалочувствительными [6]. Их рецепторами являются впервые описанные F.Sachs механорецепторы [54,154], связанные с ионными каналами, названными механосенситивными каналами. В зависимости от того активируются или инактивируются эти каналы при растяжении, они были названы stretch-activated (inactivated) channels [38]. Мембраны подавляющего большинства возбудимых клеток содержат, как обнаружено в последние годы, не только потенциалзависимые и хемочувствительные, но и ионные каналы, функционирующие при механическом воздействии. Например, показано, что все три типа ионных каналов имеют мембраны клеток некоторых гладких и поперечно-полосатых мышц [54,85,86,87,130,186] и мышцы сердца [36,135,163]. Механо-сенситивные каналы обнаружены у клеток подавляющего большинства тканей организма [133,162,161,188].
Ответ клетки на прямое механическое воздействие возникает как следствие взаимосвязанного функционирования ее структурных элементов и вторичных мессенжеров. Белки клеточной поверхности и экстрацеллюлярный матрикс, связанные посредством трансмембранных белков с цитоскелетом, активируют ионные каналы при механической деформации клетки. Преобразование механического сигнала на уровне клетки может выражаться как в ее электрофизиологических, так и в
биохимических ответах. Изменение концентрации биологически активных лигандов на поверхности клетки также может быть непрямым механизмом преобразования механического сигнала [38]. Для ряда электроневозбудимых клеток показано, что механизм преобразования механического сигнала представляет собой комбинацию между передачей силы растяжения или сжатия через цитоскелетные элементы на механосенситивные ионные каналы и преобразование силы растяжения или сжатия в биохимические сигналы на механо-преобразующем участке клетки. Большинство авторов рассматривают в качестве принципиальной преобразующей системы F-актин микрофиламентов, поскольку показано, что стимуляция аденилатциклазы и механосенситивный ответ клетки на деформацию ингибируется специфическим деполимеризующим актин микрофиламентов агентом [175]. Микрофиламентная сетка поддерживает натяжение в клетке, которое совместно с микротубулярной жесткостью определяет клеточную форму [70].
Поскольку фибробласты сердца являются механосенситивными клетками, было предположено, что они являются механоэлектрическим преобразователем в сердце и служат базовыми элементами для реализации механизма обратной связи между возбуждением и сокращением [6,94,97,99,102], который пытаются найти на уровне кардиомиоцитов [107,111]. Хотя гистологически фибробласты сердца изучены достаточно хорошо [52,105,126,134,157], их электрофизиологическое исследование проведено только в условиях культуры ткани неонатального сердца крыс [148,149] и на целом сердце холоднокровных животных [6,7,8,11,12,15,74,75,77,78,79,89,90,91,92, 94,98,99,100,101,102,104].
Эти исследования позволяют предположить, что сжатие или растяжение
фибробласта в моменты сокращения или расслабления миокарда через цитоскелет
вызывают изменение функционирования (активацию или инактивацию) stretch-activated
channels и, как следствие, возникновение потенциалов, названных mechano-induced
potentials (МІР). Проверке этой гипотезы посвящена настоящая работа.
Исходя из этих предпосылок мы сформулировали цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение роли цитоскелета сердечных фиброблас-тов в механизме генерации механоиндуцированных потенциалов.
Исследование включало решение следующих задач:
1) Идентификация механо-сенситивных фибробластов правого председия
крысы и изучение их электрофизиологических характеристик;
Изучение роли деполимеризации F-актина и тубулина в механизме возникновения МІР.
Изучение роли полимеризации F-актина и тубулина в механизме возникновения МІР.
4) Изучение эффекта стабилизаторов F-актина в условиях его
деполимеризации.
5) Изучение эффекта стабилизаторов тубулина в условиях его деполимериза
ции.
Диссертация состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов с их обсуждением, выводов и списка цитированной литературы.
В литературном обзоре, в соответствии с намеченной целью исследования, даются представления об электрофизиологических свойствах электроневозбудимых, но механосенситивных фибробластов сердца лягушки и крысы [6,99]. Представлены данные о роли stretch-activated channels в формировании биопотенциалов у некоторых клеток. Рассматривается возможная роль цитоскелета в регуляции воротного механизма stretch-activated channels у электроневозбудимых клеток. В качестве используемых веществ охарактеризованы соединения, деполимеризующие цитоскелет Cytochalasin D (деполимеризующий F-актин
микрофиламентов) и Colchicine (деполимеризующий тубулин микротубул) и соединения стабилизирующие цитоскелет АТР (стабилизирующая F-актин микрофиламентов) и GTP и Taxol (стабилизирующие тубулин микротубул).
В главе, посвященной материалам и методам исследований, охарактеризован
объект исследований - сердце крысы. Описана методика выделения изолированного
синусного узла. Описаны использованные в работе микроэлектроды. Описана
экспериментальная установка, состоящая из системы жизнеобеспечения исследуемых
тканей и электронно-измерительной системы. Последняя позволяет одним
микроэлектродом регистрировать внутриклеточную электрическую активность и
одновременно осуществлять искусственную поляризацию мембраны. Представлены
характеристики регистрируемых параметров. Завершает главу описание
математического аппарата для обработки результатов.
Электрофизиолофические характеристики сердечных фибробластов
В нормальных физиологических условиях сокращения сердечной мышцы выступают в качестве того механического фактора, который обуславливает возникновение механоиндуцированных потенциалов у фибробластов. Их амплитуда обычно невелика, поскольку у большинства клеток мембранный потенциал имеет небольшую величину и находится вблизи реверсного потенциала. Под влиянием сокращения мышцы сердца, в период систолы, фаза нарастания МІР связана с активацией механочувствительных скорее неселективных ионных каналов, через которые в клетку могут поступать различные ионы, в том числе и ионы кальция что приводит к увеличению его внутриклеточной концентрации. Входящий ток приводит к сдвигу мембранного потенциала и амплитуда МІР увеличивается. При расслаблении миокарда возможна инактивация этих каналов, что прекращает дальнейшее увеличение амплитуды МІР, не давая ему достичь уровня реверсного потенциала. Повышение концентрации свободного внутриклеточного кальция, за счет поступления его внутрь клетки при каждом сокращении, и освобождение кальция из внутриклеточных хранилищ [32,45,72] возможно, активирует кальций зависимые калиевые каналы и возникающий выходящий ток обуславливает нисходящую фазу амплитуды МІР и стремится вернуть мембранный потенциал к уровню потенциала покоя. В экспериментах с веществами, изменяющими концентрацию свободного внутриклеточного кальция (ВАРТА, BHQ, СРА, тапсигаргин, кофеин и рианодин) показано, что изменение концентрации внутриклеточного кальция принимает участие в генерации МІР [49,55]. Возможно, что в формировании МІР фибробластов принимают участие и другие ионные токи. Возможно,что Na/K насос и изменение проводимости для ионов хлора также принимают участие в формировании МІР [121].
Проницаемость мембраны фибробластов для хлора была обнаружена у несердечных фибробластов [113]. В условиях steady-state хлор входит в фибробласты, и его бифазнй характер свидетельствует о существовании в клетке двух субклеточных компартментов содержащих хлор. Каждый компартмент содержит примерно половину клеточного хлора [113]. Выход хлора из фибробластов осуществляется через хлорные каналы. Повышение внутриклеточного кальция также стимулирует хлорный выход через кальций-чувствительные хлорные каналы [82]. У линии Swiss ЗТЗ фибробластов с помощью метода patch-clamp была показана активация хлорных каналов через механизм, включающий увеличение внутриклеточного свободного кальция [51]. Увеличение концентрации свободного внутриклеточного кальция активирует кальций-зависимую хлорную проводимость, что может привести к сдвигу мембранного потенциала в сторону деполяризации [120]. Тем не менее, для сердечных фибробластов нет данных относительно хлорной проницаемости.
Как уже упоминалось ранее, механическое воздействие может приводить к увеличению концентрации внутриклеточного кальция вследствие его поступления в клетку из внеклеточного постранства. Под влиянием механического воздействия в клетке возможно освобождение кальция из внутренних хранилищ [47]. Таким образом, возможно, что сдвиги мембранного потенциала фибробластов сторону гиперполяризации, связаны, преимущественно с активацией кальций-зависимых калиевых каналов. В сдвигах мембранного потенциала в сторону деполяризации может играть определенную роль и активация кальций-зависимых хлорных каналов. Причины связи кальция либо с калиевыми каналами либо с хлорными каналами в настоящее время неясны.
Химические соединения
Для изучения возможности вовлечения цитоскелета и, в частности, микрофиламентов в rundown stretch-activated channels был использован Cytichalasin D [73,150], который гидролизует А ТР актина и, тем самым, уменьшая стабильность полимера, приводит stretch-activated channels в состояние rundown. Cytochalasin D вводили в клетку посредством пассивной диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 100 цМ или 200 иМ.
В качестве стабилизатора F-актина использовали АТР, вводимый внутриклеточно посредством пассивной диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 200 цМ или 2 тМ [73,150].
Для изучения протективного эффекта АТР на цитохалазиновую деполимеризацию F-актина [73,150], это соединение вводили внутриклеточно через микроэлектрод где оно было в концентрации 2 тМ или 200 _рМ совместно с Cytochalasin D в концентрации 200 jiM.
Для изучения роли микротубул в регуляции воротного механизма stretch-activated channels был использован Colchicine [73,150], специфически деполимеризующий тубулин. Colchicine вводили в клетку также посредством пассивной диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 100 цМ или 200 цМ.
В качестве стабилизатора тубулина использовали GTP и Taxol, вводимые внутриклеточно посредством пассивной диффузии из микроэлектрода. В микроэлектроде GTP был в концентрации 200 JJM или 2 тМ [73,150], a Taxol в концентрации 200 дМ [73,150]. Все соединения находились в микроэлектродах совместно с электролитом.
Для изучения протективного эффекта GTP и Taxol на колхициновую деполимеризацию тубулина [73,150], соединения вводили посредством пассивной диффузии совместно с Colchicine в концентрации 200 jaM в микроэлектроде. Концентрация GTP в микроэлектроде была 2 тМ или 200 уМ, а концентрация Taxol 200 jiM.
Кроме того, осуществляли совместное введение Cytochalasin D и Colchicine, которые находились в микроэлектроде в концентрации по 100 иМ.
Все данные о внутриклеточном введении используемых соединений и их комбинациях сведены в таблицу 1. В процессе работы было выполнено 16 экспериментальных серий.
Для внутриклеточного введения соединений использовали микроэлекртоды, сопротивление которых было 8-9 MQ.
В предварительных экспериментах нами было показано, что если сопротивление микроэлектрода было равно 10 MQ или больше эффект не наступал. Мы также не получили эффекта при применении микроэлектродов, заполненных меньшей концентрацией соединений.
Все используемые соединения были получены от фирмы Sigma.
Для предотвращения возможного rundown и неспецифического влияния (влияния не только на полимеризацию F-актина и тубулина) со стороны АТР и GTP регистрацию проводили в течение 5 мин для каждой серии.
Электрофизиологическая идентификация фибробластов
В изолированном правом предсердии крысы мы регистрировали фибробласты (п=16), величина мембранного потенциала которых лежала в диапазоне от - 5 mV до - 70 mV (-22±2 mV). Наиболее часто встречались клетки с мембранным потенциалом в диапазоне от - 10 mV до - 25 mV. Величина входного сопротивления исследуемых клеток, по нашим данным, лежала в пределах от 510±10 MQ. В ритме спонтанных сокращений препарата у клеток регистрировали осцилляции мембранного потенциала, форма и электрофизиологические характеристики которых были аналогичны с ранее описанными mechanically induced potentials (МІР) у фибробластов, расположенных в предсердиях лягушки [8] и крысы [12].
Форма МІР принципиально отличается от формы потенциалов действия клеток сердца. Амплитуда зарегистрированных МІР была либо соизмерима с величиной мембранного потенциала, либо значительно меньше его. Характерной особенностью, отличающей МІР от потенциалов действия, было и отсутствие овершута. Он начинается позднее на 10 мсек. Длительность этого потенциала соответствует длительности механограммы препарата предсердия. Однако, если фаза сокращения препарата и фаза нарастания МІР относительно синхронны, то в фазу расслабления препарата падение МІР может быть короче или длиннее ее.
Основным тестом, при помощи которого мы идентифицировали фибробласты в предсердиях крыс, служила их специфическая реакция на искусственную внутриклеточную поляризацию и специфическая реакция на растяжение ткани [9,10,93].
У фибробластов спонтанно сокращающегося фрагмента правого предсердия искусственная гиперполяризация мембраны приводила к увеличению амплитуды МІР тем большему, чем на большую величину смещался потенциал. Искусственная деполяризация мембраны приводила к уменьшению амплитуды МІР тем большему, чем большая поляризация имела место, вплоть до полного прекращения возникновения МІР при достижении потенциала реверсии.
Искусственное растяжение ткани спонтанно сокращающегося фрагмента правого предсердия приводило к гиперполяризации мембраны фибробласта и соответственно к увеличению амплитуды МІР тем большему, чем большую величину имело механосенситивная гиперполяризация ткани.
Хотя исследуемые клетки выявляли достаточно часто в обоих предсердиях, наибольшее количество клеток, генерирующих МІР, регистрировали вдоль относительно крупной артерии, проходящей через толщу синусного узла и являющейся его маркером, что соответствует литературным данным [17].
