Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Потенциалы возбуждения у высших растений 14
1.1. Общая характеристика электрогенеза у высших растений 14
1.2. Электрические сигналы растений 22
1.2.1. Потенциал действия 24
1.2.2. Вариабельный потенциал 32
1.3. Функциональная роль потенциалов возбуждения у высших растений 40
Глава 2. Объекты и методы исследования 46
2.1. Объекты исследования 46
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Регистрация мембранного потенциала клеток 46
2.2.2. Внеклеточная (поверхностная) регистрация электрической активности 49
2.2.3. Регистрация изменения ионных концентраций потенциометрическим методом 51
2.2.4. Регистрация изменений рН с использованием рН-чувствительного зонда FITC-dextran методом конфокальной микроскопии 51
2.2.5. Оценка изменений размеров листа методом оптической когерентной микроскопии 57
2.2.6. Измерение замедленной флуоресценции 58
2.2.7. Определение выхода АТФ из семядольных листьев 59
2.2.8. Электрофизиологический анализ холодоустойчивости растений 59
2.2.9. Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального ультрацентрифугирования 60
2.2.10.Определение АТФазной активности во фракции изолированных плазматических мембран 63
2.2.11. Определение транспортной активности Н+-АТФазы во фракции изолированных плазматических мембран 64
2.2.12.Раздражение растений 65
2.3. Статистическая обработка результатов 66
Глава 3. Особенности генерации местных электрических реакций в зоне локального раздражения 67
3.1. Индукция потенциалов действия в стебле проростков тыквы электрическими стимулами 67
3.2. Возникновение потенциалов действия под влиянием механического раздражения и охлаждения 70
Глава 4. Механизм генерации потенциала действия в клетках высшего растения 78
4.1. Непосредственное участие электрогенного насоса в генерации потенциала действия 78
4.1.1. Зависимость процесса генерации потенциала действия от величины метаболической компоненты мембранного потенциала 78
4.1.2. Изменение внеклеточного рН при генерации потенциала действия 86
4.1.3. Влияние ионов кальция на активность АТФазьі плазматических мембран 94
4.2. Совокупность процессов, лежащих в основе генерации потенциала действия 100
4.2.1. Формирование фазы деполяризации потенциала действия . 100
4.2.2. Формирование фазы реполяризации потенциала действия 115
4.2.3. Общая схема механизма генерации потенциала действия у высших растений 124
Глава 5. Математическая модель генерации потенциала действия у высших растений 127
5.1. Описание математической модели 128
5.2. Верификация модели и анализ результатов математического моделирования 140
Глава 6. Анализ механизма генерации и распространения вариабельного
потенциала 153
6.1. Электрофизиологическая характеристика ответных реакций, индуцированных повреждающим воздействием 153
6.2. Анализ механизма генерации вариабельного потенциала 164
6.3. Анализ механизма распространения вариабельного потенциала 178
Глава 7. Функциональная роль потенциалов возбуждения у высших растений 193
7.1. Сигнальная роль потенциалов действия 194
7.2. Влияние потенциалов возбуждения на интенсивность замедленной флуоресценции, содержание АТФ в листе и холодоустойчивость
проростков тыквы 197
Заключение 210
Выводы 213
Список литературы
- Электрические сигналы растений
- Регистрация изменения ионных концентраций потенциометрическим методом
- Возникновение потенциалов действия под влиянием механического раздражения и охлаждения
- Изменение внеклеточного рН при генерации потенциала действия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Свойство возбудимости присуще всем живым организмам и необходимо для существования в постоянно изменяющихся условиях окружающей среды. Одним из наиболее важных проявлений возбудимости является способность генерировать распространяющиеся электрические сигналы в ответ на разно-образные внешние факторы. У высших растений выделяют два основных типа распространяющихся электрических сигналов - потенциал действия (ПД), который возникает в ответ на неповреждающее раздражение, и вариабельный потенциал (ВП) -электрическую реакцию, индуцированную повреждающими раздражителями (Опри-тов и др., 1991; Медведев, 1998; Stahlberg, 2006; Davies, 2006; Fromm, Lautner, 2007).
Первые сведения о способности высших растений генерировать электрические импульсы появились в конце XIX века в работах английского исследователя Бэрден-Сандерсона, проводимых на венериной мухоловке (Burdon-Sanderson, 1873 по Stahlberg, 2006), а начало систематического исследования возбудимости у высших расте-ний связано с именем Боса, который впервые экспериментально обосновал, что в проводящих тканях мимозы могут возникать и распространяться ПД (Бос, 1964).
В течение длительного времени предполагалось, что электрические
импульсы, возникающие при действии внешних раздражителей, наблюдаются
только у растений с быстрыми локомоторными функциями, а остальные
(«обычные») растения не обладают таким свойством. Работами
преимущественно отечественных ученых в 60-70 гг. XX века было не только
і показано существование ПД у «обычных» высших растений (Гунар, Синюхин,
1962, 1963; Гунар, Паничкин, 1967, 1970; Карманов и др., 1972; Pickard, 1973; Опритов, 1977, 1978), но и во многом определено направление дальнейших
исследований — изучение механизмов генерации и распространения электрических сигналов, определение их функциональной роли.
Несмотря на значительный период исследований и накопление определенного экспериментального материала, сведения о ПД у высших растений и сегодня носят фрагментарный характер. К настоящему времени наибольшие успехи достигнуты при изучении механизмов генерации ПД в гигантских по размерам клетках ряда водорослей, прежде всего, харовых (Берестовский и др., 1973; Lunevsky et al., 1983; Берестовский и др., 1987; Kourie, 1994). Во многом, представления о механизме генерации ПД у высших растений сформированы на основе этих результатов. Как и у харовых водорослей, формирование ПД у высших растений связывают с возникновением пассивных потоков ионов хлора и калия (Опритов, Ретивин, 1982; Hodick and Sievers, 1988; Sibaoka, 1991; Fromm and Spanswick, 1993; Davies, 2006; Trebacz et al., 2006). В тоже время, имеющихся данных недостаточно для формирования целостной картины механизма генерации ПД в клетках высших растений. В еще меньшей степени исследован другой тип потенциалов возбуждения - ВП, характерный только для высших растений (Davies, 2006; Fromm, 2006; Stahlberg et al., 2006). Практически не расшифрованы механизмы его генерации и распространения.
Между тем, изучение природы распространяющегося возбуждения у высших растений важно не только для выявления особенностей этого процесса у данных объектов, но и для понимания эволюции механизмов генерации ПД в живых организмах в целом. Исследование природы ПД значимо также для раскрытия механизмов преобразования электрических сигналов в функциональный ответ.
В настоящее время накапливается материал об индуцированных ПД и ВП функциональных изменениях у высших растений (Davies, 1987; Опритов, 1998; Fromm, 2006; Fromm, Lautner, 2007), однако четкие представления о механизмах, лежащих в их основе, а также о выполняемой роли отсутствуют.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы является комплексное изучение механизмов генерации и функциональной роли потенциалов возбуждения, представленных потенциалом действия и вариабельным потенциалом, у высших растений.
В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи:
характеристика местных биоэлектрических реакций, вызванных локальными раздражителями различной модальности, и определение их роли в индукции распространяющихся ПД;
анализ непосредственного участия электрогенного насоса - Н+-АТФазы плазматических мембран - в генерации ПД у высшего растения;
построение схемы, обобщающей последовательность процессов, лежащих в основе генерации ПД;
разработка и анализ математической модели генерации ПД у высших растений;
изучение механизмов генерации и распространения ВП;
анализ роли электрических сигналов, представленных ПД и ВП, в качестве факторов, индуцирующих функциональные изменения у высших растений.
Научная новизна. Впервые показано, что в генерации ПД у высших растений принимает непосредственное участие электрогенный насос плазматической мембраны. При генерации ПД имеет место переходное изменение активности электрогенного насоса по типу инактивация-активация. Временное снижение активности электрогенного Н+-насоса происходит
вследствие увеличения концентрации ионов Са в возбудимых клетках.
Установлено, что формирование фазы деполяризации ПД связано с возрастанием потока Н* внутрь, наряду с увеличением потока СГ наружу. Синхронизация двух ионных потоков достигается наличием общего
инициирующего фактора - повышением концентрации ионов Са в клетке в начальный момент возбуждения.
Обнаружено, что фаза реполяризации ПД у высшего растения развивается в два этапа. Первый этап фазы реполяризации формируется выходящим потоком ионов К+. Второй этап фазы реполяризации связан с работой электрогенного насоса плазматических мембран.
Впервые предложена обобщающая схема механизма генерации ПД в клетках высших растений, согласно которой процесс генерации является комплексным и включает как пассивные потоки ионов, так и изменение активности ЬҐ-АТФазьі плазматических мембран. Впервые разработана математическая модель генерации ПД у высших растений, которая основывается на предложенной схеме и включает в себя описание систем пассивного, первичного и вторичного активного транспорта ионов, а также изменения ионных концентраций в клетке, внеклеточной среде, буферные свойства цитоплазмы и апопласта.
Установлено, что генерация ВП, индуцированного ожогом листа проростка тыквы, связана с входом в клетку ионов Са и выходом СГ, наряду со снижением активности электрогенного Н+-насоса.
Скорость распространения ВП не соответствует скорости распространения сигнала, рассчитанной на основании кабельного уравнения, что отрицает электрическую гипотезу передачи ВП.
Показано, что индуцированные электрическими сигналами изменения функциональной активности играют существенную роль в повышении устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов.
Научно-практическое значение. Результаты работы важны для создания
целостной картины развития событий при формировании
электрофизиологического ответа у высших растений на действие различных раздражителей. Предложенная схема генерации ПД у высших растений,
учитывающая участие в этом процессе наряду с пассивными ионными потоками переходное изменение активности электрогенного насоса, способствует развитию представлений об эволюции механизмов возбуждения в живых организмах.
Материалы диссертации могут найти практическое применение в вопросах, связанных с поисками новых методов повышения устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов. Основные выводы и результаты работы используются в учебном процессе на биологическом факультете Нижегородского госуниверситета при чтении спецкурсов «Биофизические механизмы транспортных процессов», «Биофизика и биохимия мембранных процессов».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
В генерации ПД у высшего растения (тыквы) принимает непосредственное участие электрогенный насос - Н+-АТФаза плазматической мембраны. При генерации ПД происходит временное снижение активности насоса на фазе деполяризации и последующее восстановление активности на фазе реполяризации импульса. Фактором, угнетающим активность электрогенного насоса, является увеличение концентрации ионов Са2+ в клетке в начальный момент возбуждения. Ионы Са оказывают влияние на активность Н+-АТФазы при участии протеинкиназ.
Математическая модель ПД у высших растений, разработанная на основании предложенной в работе схемы механизма генерации ПД, позволяет описать изменения мембранного потенциала и ионных концентраций, которые хорошо соответствуют экспериментально зарегистрированным.
Формирование ВП, индуцированного ожогом листа проростков тыквы, связано, наряду со снижением активности электрогенного насоса, с входящим
потоком ионов Са и выходящим потоком ионов СГ.
Механизм распространения ВП у проростков тыквы не может быть объяснен в рамках электротонической гипотезы. Скорость распространения ВП не соответствует скорости распространения, определенной с применением кабельного уравнения.
Распространение ПД и ВП индуцирует временное повышение уровня замедленной флуоресценции и содержания АТФ в листе, которое значимо для повышения устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на П съезде биофизиков России (Москва, 1999), Международной конференции "Ксенобиотики и живые системы" (Минск, 2000), International Symposium "Signaling Systems of Plants Cells" (Moscow, 2001), Международной конференции молодых ученых и студентов "Актуальные проблемы современной науки" (Самара, 2001), Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2001), V съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2003), 3 Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2003), Ш съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международной научной конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004), 6 International Congress on Mathematical Modeling (Nizhny Novgorod, 2004), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2005), VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2005), Международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Пушино, 2005), X Междисциплинарной научной конференции «Нелинейный мир» (Нижний Новгород, 2005), Международной конференции. «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), V Съезде общества фотобиологов России (Пушино,
2008), Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), а также на региональных конференциях.
Электрические сигналы растений
Раздражимость - способность воспринимать изменения в окружающей среде и отвечать на эти изменения - одна из важнейших характеристик живых организмов. Растения, в связи с особенностями существования, не имеют возможности избежать действия неблагоприятных факторов. В связи с этим имеет особое значение развитие адаптивного ответа на действие стрессора. Полная последовательность событий, которая ведет от восприятия стимула к ответу, может быть обозначена как «передача сигнала». Обычно этот термин используется для внутриклеточного каскада. Однако координация активности многоклеточных сложноорганизованных организмов, в том числе и высших растений, требует наряду с внутриклеточной и межклеточной (дальней) передачи сигналов. При локальном раздражении адекватный ответ на внешние воздействия будет включать изменения в органах и тканях, которые непосредственно не подвергались влиянию неблагоприятного фактора (Malone, 1996; Полевой, 2001; Leon et al., 2001; Крутецкая, Лебедев, 2003; Кузнецов, Дмитриева, 2005).
В качестве кандидатов на осуществление связи между зоной локального раздражения и зоной, в которой происходит эффекторный ответ, у растений рассматривают сигналы химической природы, гидравлический сигнал, комбинацию гидравлического и химического сигналов (гидравлическая дисперсия) и электрические сигналы (Malone, 1996; Leon et al., 2001; Davies, Stankovic, 2006; Fromm, Lautner, 2006; Rhodes et al., 2006). К совокупности сигналов, к которым применяют термин «электрический», у растений относят потенциал действия (ПД), вариабельный потенциал (ВП), переходные изменения потенциала (voltage transients (VT)), ритмическую электрическую активность (Davies, 2006). Все перечисленные типы электрической активности представляют собой изменения мембранного потенциала. Ритмическая электрическая активность и переходные изменения потенциала являются локальными электрическими реакциями, не способными к распространению на дальние расстояния (Mitsumo, Sibaoka, 1989; Antkowiak et al., 1991; Pickard, 1984; Krol, Trebacz, 1999). Лишь ПД и ВП рассматривают в качестве «дальних», т.е. обладающих способностью к быстрому распространению на дальние расстояния электрических сигналов и именно по отношению к ним применяют термин «потенциалы возбуждения» (Опритов и др., 1991; Медведев, 1998; Davies, 2006; Trebacz et al., 2006; Пятыгин, 2008).
Первоначально возможность генерации ПД была обнаружена у высших растений, проявляющих быстрые двигательные реакции (локомоторных растений) (Sibaoka, 1962; Бос, 1964; Brenner et al., 2006; Stahlberg, 2006). Однако позднее было показано, что способность к возбуждению характерна и для «обычных» (не обладающих локомоторной активностью) высших растений (Гунар, Синюхин, 1962; Синюхин, Горчаков, 1966; Pickard, 1973; Опритов, 1977). Следует отметить, что к ПД «обычных» растений приложимы основные законы возбуждения: возникновение по принципу «все или ничего» при достижении порога возбуждения; наличие абсолютного и относительного рефрактерного периода; явление аккомодации и т.д. (Paszewski et al., 1977; Опритов и др., 1991; Trebacz et al., 2006; Fromm, Lautner, 2007).
В состоянии возбуждения клеток высших растений Ет претерпевает быстрые импульсообразные изменения, способные к распространению (Pickard, 1973; Опритов, 1977; Paszewski et al., 1977; Опритов и др., 1991; Sibaoka, 1991). На основании того, что ПД у высших растений были зарегистрированы в самых различных тканях и органах (Samejima, Sibaoka, 1982; Iijima, Sibaoka, 1985; Hodick, Sievers, 1988; Sibaoka, 1991; Fromm, Eschrich, 1993), можно полагать, что способность генерировать ПД у высших растений не является «привилегией» ограниченного круга специально предназначенных для этого возбудимых структур растительного организма.
Регистрация изменения ионных концентраций потенциометрическим методом
Изменения ионных концентраций в растворе, омывающем участок стебля в кювете, регистрировали с помощью ионселективных электродов. Использовали рН чувствительный комбинированный электрод ЭСК-10614 и рС1 чувствительный электрод ЭЛИС-131 О. Ионселективные электроды были соединены с трехканальным иономером ИПЛ-113. Раствор в экспериментальной кювете перемешивали магнитной мешалкой в течение всего времени проведения эксперимента (рис. 2.2).
Регистрацию изменений ионных концентраций в растворе проводили с одновременной внеклеточной регистрацией электрической активности растения. Для внеклеточной регистрации электрической активности использовали Ag/AgCl макроэлектроды ЭВЛ-1МЗ. Усилителем служил тот же иономер. Измерительный электрод контактировал с участком стебля через раствор в ячейке, электрод сравнения - с раствором, омывающим корни (рис. 2.2). Распространение ПД по стеблю растения контролировали с помощью дополнительной пары электродов (на схеме не показаны).
Для регистрации изменений рН был использован флуоресцентный зонд флуоресцеи-низотиоцианат (FITC-dextran), соединенный с молекулой декстрана (Hedrich et al., 2001; Hoffman, Cosegarten, 1995). Максимумы возбуждения и флуоресценции FITC-dextran составляют 493 и 520 нм соответственно.
Для изучения зависимости параметров флуоресценции FITC-декстрана от величины рН использовали буферные растворы с различными значениями рН в диа-пазоне от 4,5 до 8 с шагом 0,5 единицы. Раствор содержал 1хЮ"3 М КС1, 5x10" М СаС12, 5х10"4 NaCl и 5хЮ 8 М FITC, Tris-MES (5хЮ 3 М). Регистрацию спектров возбуждения и флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301 PC в стандартной кварцевой кювете, в которую помещали 2 мл буферного раствора.
На рисунке 2.3 приведены спектры флуоресценции FITC-dextran (длина волны возбуждающего света 493 нм) и возбуждения (регистрация флуоресценции при 520 нм) для водных растворов с различными значениями рН. Как видно из рисунка, увеличение рН раствора в диапазоне от 4,5 до 8 единиц ведет к увеличению интенсивности флуоресценции зонда. При этом не происходит сдвига максимумов флуоресценции или возбуждения. Следовательно, изменение интенсивности , флуоресценции FITC-dextran можно использовать в качестве критерия при оценке изменений рН в данном диапазоне.
Для регистрации изменений рН растение предварительно загружалось рН зондом FITC-dextran. Стебель растения погружали в раствор, содержащий 1хЮ"3 М КС1, 5хЮ-4 М СаС12, 5х10"4 NaCl и 5хЮ-8 М FITC-dextran на 12-18 часов. Перед проведением измерений стебель растения промывали проточной водой для удаления зонда с поверхности.
Исследования проводили на установке лазерной сканирующей микроскопии Carl Zeiss LSM 510 МЕТА (инвертированный микроскоп Axiovert 200М, лазерный сканирующий модуль Carl Zeiss LSM 510, спектральный модуль Carl Zeiss 23 МЕТА) в Институте прикладной физики РАН, Нижний Новгород.
Установка позволяет получать изображения при регистрации отраженного флуоресцентного сигнала от слоев биоткани в ходе пошагового сканирования образца сфокусированным лучом лазера. Последовательное получение изображений с различной глубины и последующая 3-D реконструкция дают возможность получения информации о глубокой пространственной структуре образца. Конфокальная схема регистрации сигнала обеспечивает оптическое разрешение в пределах 0,3-0,5 мкм по поперечной и около 1 мкм по продольной координате. В зависимости от оптических свойств образца глубина получения информативного сигнала составляет до 100 мкм. Спектральный блок МЕТА позволяет анализировать спектр регистрируемой флуоресценции в диапазоне 400-700 нм с разрешением 10 нм.
Программное обеспечение позволяет автоматически получать изображения с заданного участка образца с заданным интервалом времени, а также количественно оценивать интенсивность сигнала от выбранной области интереса и её изменения во времени.
При проведении эксперимента проросток размещали на предметном столике микроскопа, закрепляя участок стебля на покровном стекле (рис. 2.4). Предварительно растение было загружено флуоресцентным рН-чувствительным зондом. Возбуждение осуществляли с помощью аргонового лазера с длиной волны 477 нм, флуоресценцию регистрировали по двум каналам в диапазоне 500-550 и 650-710 нм. Диапазон первого канала соответствует области флуоресценции FITC, второго - автофлуоресценции хлоропластов.
Для установления локализации зонда в растении получали трехмерное изображение верхних слоев клеток стебля, при этом автофлуоресценция хлоропластов служила естественным маркером внутриклеточного пространства. О наличии зонда в тех или иных структурах судили по характерной флуоресценции.
При исследовании локальных изменений рН в зафиксированном на столике микроскопа растении индуцировали генерацию ПД локальным охлаждением -нанесение капли ледяной воды на расстоянии от зоны регистрации. Регистрацию флуоресцентного сигнала осуществляли на уровне 2-3-го слоя клеток от поверхности стебля.
Возникновение потенциалов действия под влиянием механического раздражения и охлаждения
В электрофизиологии животных хорошо изучена зависимость «сила-длительность» и определены параметры стимулов, необходимых для индукции ПД для целого ряда возбудимых структур (Ходоров, 1975). Наличие типичной зависимости «сила-длительность» характерно и для проростков тыквы (рис. 3.2). Интенсивность порогового стимула, способного инициировать ПД, увеличивается с уменьшением длительности стимулирующего импульса. Количественно кривые «сила-длительность» характеризуют по величине значений хронаксии и реобазы. Реобаза - минимальная сила тока, способная вызвать генерацию ПД при бесконечной длительности стимула. Хронаксия - длительность стимула, способного вызвать генерацию ПД при силе раздражителя, равного двум реобазам (Иост, 1975; Ходоров, 1975; Эккерт и др., 1992). При изучении зависимости «сила -длительность» значения реобазы могут быть оценены как через величину тока (Paszewski et al., 1977; Fromm, Spanswick, 1993), так и через величину напряжения стимулирующих импульсов (Zawadzki, 1979; Zawadzki et al., 1991; Fromm, Spanswick, 1993). В наших экспериментах значение реобазы составило 2,8 В, а хронаксии - 0,7 сек (рис. 3.2). Сопоставление полученных нами данных с известными данными о величинах реобазы и хронаксии у подсолнечника (2 В, 2,3 сек) (Zawadzki et al., 1991), люпина (2 В, 0,1 сек) (Zawadzki, 1979), ивы (2 В, 2 сек) (Fromm, Spanswick, 1993) позволило заключить, что их величины у проростков тыквы типичны для высших растений.
Электростимуляция адекватна природе ПД, поскольку непосредственно ведет к достижению порогового уровня деполяризации. Но для растений этот раздражитель не является естественным. В связи с этим, целесообразно рассмотреть инициацию ПД внешними факторами, действующими в естественных условиях обитания. Одними из наиболее часто действующих в природе раздражителей являются механическое воздействие и охлаждение.
У животных за восприятие внешнего стимула определенной природы ответственны специализированные рецепторы. Особенно важное значение имеют два свойства рецепторных клеток. Во-первых, рецепторные клетки отличаются высокой избирательностью по отношению к стимулам определенной модальности и, как правило, не реагируют на стимулы других модальностей. То есть рецепторные клетки определенного типа реагируют только на адекватные стимулы. Второе важное свойство рецепторных клеток - их способность генерировать электрический сигнал, энергия которого намного больше энергии внешнего стимула (Эккерт и др., 1992).
Внешний стимул, действуя на рецептор, вызывает, как правило, деполяризацию его поверхностной мембраны, которую называют рецепторным потенциалом; Рецепторный потенциал не подчиняется закону «все или ничего», является градуальным, то есть зависит от силы раздражителя, способен суммироваться при применении быстро следующих друг за другом раздражителей и не распространяется вдоль нервного волокна (Эккерт и др., 1992).
По аналогии с животными объектами, в электрофизиологии растений применяется термин рецепторный потенциал (Benolken, Jacobson, 1970; Williams, Pickard, 1972; Bentrup, 1979; Shimmen, 2001). Однако у «обычных» высших растений, по-видимому, отсутствуют специализированные рецепторные образования, отвечающие за восприятие внешних стимулов определенной модальности. О наличии специализированных рецепторов с определенной уверенностью можно говорить лишь в отношении растений с быстрыми локомоторными функциями. Данная группа растений имеет клетки или группы клеток, которые могут быть обозначены как механорецепторы (Iijima, Sibaoka, 1981; Sibaoka, 1991; Shimmen, 2006).
Каким же образом происходит восприятие внешних стимулов у растений и можно ли говорить о наличии этапа рецепции при развитии ответной электрофизиологической реакции на действие внешних раздражителей? Мы попытались ответить на этот вопрос, рассматривая восприятие механического и холодового стимулов (Воденеев и др., 2005; Воденеев и др., 2006а; Опритов и др., 2007).
На рис. 3.3 показана зависимость амплитуды электрической реакции от интенсивности приложенного механического стимула. Как видно из рисунка, четко проявляется свойственная РП градуальность - чем сильнее воздействие, тем больше амплитуда ответа. Зависимость амплитуды биоэлектрического ответа от интенсивности стимула проявляется лишь до определенной его величины. По достижению раздражителем некоторой критической интенсивности, происходит резкое возрастание амплитуды ответа, на величине которой дальнейшее усиление раздражителя не сказывается. Происходит генерация ПД в соответствии с законом «все или ничего». Т.о., можно вполне обоснованно говорить о том, что местные биоэлектрические реакции растений обладают свойствами, характерными для рецепторных потенциалов. Локальным биоэлектрическим реакциям присуща градуальность и способность инициировать ПД по достижению порогового уровня.
Наличие градуальности и способности вызывать генерацию ПД по достижению порогового уровня свойственно также и ответным электрическим реакциям, индуцированным локальным охлаждением (рис. 3.4). В отличие от механического раздражения, зависимость амплитуды реакции от глубины охлаждения носит не логарифмический, а экспоненциальный характер (рис. 3.3, 3.4).
Изменение внеклеточного рН при генерации потенциала действия
Электрогенный насос плазматических мембран в клетках высших растений представлен ЬҐ"-АТФазой. Если БҐ-АТФаза действительно участвует в генерации ПД, то возникновение импульса должно сопровождаться изменением активности Н+ в среде, окружающей возбудимые клетки. На возможность регистрации предполагаемых изменений указывает феномен временного нарушения установившегося распределения рН по поверхности клеток при генерации ПД у водоросли Chara corallina (Булычев и др., 2004). В то же время попытка зарегистрировать сдвиги внеклеточного рН в связи с генерацией ПД в талломе печеночного мха Conocephalum conicum успеха не имела (Trebacz, 1992).
Для регистрации возможных изменений рН при генерации ПД нами был использован рН-чувствительный флуоресцентный зонд FITC-dextran, которым загружали проростки тыквы (Воденеев и др., 2008). Регистрацию флуоресценции осуществляли с помощью конфокальной микроскопии. Несомненным преимуществом метода является возможность получать ЗБ-изображения внутренней структуры ткани прижизненно при работе на целых объектах. Также необходимо отметить, что метод позволяет точно определять локализацию флуоресцентного зонда в исследуемом объекте и дифференциально регистрировать флуоресценцию во времени на выбранных участков получаемого изображения (Feijo, Moreno, 2004; Феофанов, 2007).
С целью определения локализации зонда получали 3D изображения участка стебля растений в диапазоне длин волн флуоресценции зонда. На рис. 4.5 приведены типичные примеры изображений проростка тыквы, загруженного зондом FITC-dextran (рис. 4.56), и контрольного (рис. 4.5а). У контрольных растений сигнал регистрируется только за счет рассеяния возбуждающего света на поверхности стебля. Наличие зонда в растении позволяет получать четкие трехмерные изображения глубиной в несколько слоев клеток.
Одной из проблем применения конфокальной микроскопии в исследованиях, проводимых на растительных объектах, является их автофлуоресценция в широком диапазоне длин волн. В связи с этим для корректной оценки полученных изображений необходимо проведение их спектрального анализа. Регистрация спектров излучения (рис. 4.6) показала, что только растения с зондом имеют четкий максимум флуоресценции в области 520 нм (рис. 4.66), соответствующий максимуму флуоресценции зонда в растворе (рис. 4.6а). У контрольных растений такой максимум отсутствовал (рис. 4.6в).
На полученных изображениях отчетливо видно, что зонд избирательно накапливается в апопласте. Области, в которых имеет место флуоресценция FITC-dextran (апопласт), не перекрываются с областями, в которых имеет место автофлуоресценция хлоропластов (цитоплазма). Следовательно, по изменению интенсивности флуоресценции зонда можно дифференциально оценивать изменения рН апопласта.
Следующим этапом исследования явилось изучение динамики внеклеточного рН при генерации ПД. С этой целью на исходно полученном 3D изображении выбирали отдельный оптический срез, соответствующий второму или третьему от поверхности слою клеток (рис. 4.7), и проводили мониторинг интенсивности флуоресценции при генерации электрической реакции. (рис. 4.7а) и электрической активности (рис. 4.76). Как видно из рисунка, нанесение раздражения вызывает распространение ПД, генерация которого сопровождается временным усилением интенсивности флуоресценции. Обнаруженные изменения интенсивности флуоресценции свидетельствуют о том, что при генерации потенциала действия происходит временное защелачивание апопласта. Защелачивание происходит на фазе деполяризации ПД, а на фазе реполяризации происходит восстановление рН.
Изменения рН при генерации ПД были зарегистрированы нами также и с применением потенциметрического метода, при измерении активности Н4" в растворе, омывающем участок стебля (Воденеев и др., 20066; Vodeneev et al., 2007). На рис. 4.8 представлена одновременная запись изменения AU участка стебля проростка тыквы и рН окружающего клетки раствора во время генерации ПД, индуцированного постепенным охлаждением. Видно, что генерация» ПД сопровождается смещением рН в щелочную область. Как и изменение потенциала, изменение рН имеет переходный характер, и по времени они хорошо соответствуют друг другу.
Полученные результаты позволяют предположить следующую последовательность событий: - на фазе деполяризации протоны входят в клетку из апопласта, что вызывает его защелачивание; - на фазе реполяризации происходит их перенос из клетки в апопласт, что ведет к возвращению рН к значениям, близким к исходным. Такое развитие событий может иметь место, если происходит временное угнетение активности протонной АТФазы - инактивация на фазе деполяризации импульса и реактивация на фазе реполяризации.
В недавних работах Felle Н. и Zimmermann М., посвященных изучению механизмов генерации потенциалов возбуждения у высших растений, также отмечено временное увеличение внеклеточного рН при генерации электрических реакций. Однако, авторы связывают наблюдаемые изменения рН, не с переходным изменением активности КҐ-насоса, а с выходом из клетки анионов (Felle, Zimmermann, 2007; Zimmermann, Felle, 2009). Обсуждение этого вопроса будет представлено ниже.
Связь регистрируемых нами изменений рН с функционированием ЕҐ-АТФазьі была исследована с помощью ингибитора данного фермента ДЦКД (Tu et al., 1992). Как показала одновременная регистрация электрической активности и изменений рН потенциометрическим методом, при действии ДЦКД, наряду с описанными ранее (п. 4.1.1) редуцированными изменениями потенциала, наблюдается обратимое защелачивание омывающего раствора. Причем, поскольку Н+-АТФаза в определенной степени заблокирована ДЦКД, обратимой инактивации в ходе ПД (если она имеет место) может подвергаться меньшая в сравнении с контролем доля молекул фермента. В результате, защелачивание выражено слабее в сравнении с контролем (рис. 4.9). При этом значительно уменьшается и амплитуда ПД. Как видно из рис. 4.9, использование ДЦКД в значительной мере уменьшает величину отношения , что может свидетельствовать об уменьшении вклада потока Н+ в формирование фазы деполяризации ПД.
Если снижение активности ГГ-АТФазы во время ПД имеет место, то встает вопрос о факторе, который его обуславливает. Анализ литературных данных (Kinoshita et al., 1995; Lino et al., 1998; Qiu, Su, 1998; De Nisi et al., 1999) приводит к заключению, что в качестве такого фактора может выступать увеличение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме возбудимых клеток во время генерации ПД. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на выяснение возможной роли ионов Са2+ в инактивации протонной АТФазы при генерации ПД.
