Содержание к диссертации
Введение
Гл а в а 1. Обзор литературы 11
Гл ава 2. Материал и методы, использованные в исследовании 31
3.1. Характеристика исследованного патологоанатомического материала 31
3.2. Моделирование ишемического повреждения миокарда 32
3.3. Морфологиче ские и морфометрические исследования 33
3.4. Иммуногистохимические исследования 33
3.5. Иммунофлюоресцентные исследования 35
3.6. Методы статистического анализа 37
Гл а в а 3. Результаты собственных исследований 38
3.1. Анализ экспрессии маркеров дифференцировки фибробластов при инфаркте миокарда 38
3.2. Морфометрический анализ влияния факторов роста на фибробластическую фазу воспаления при экспериментальном инфаркте миокарда 52
3.3. Неоангиогенез в условиях измененной концентрации факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда 55
3.4. Влияние факторов роста на состояние процессов окислительного фо с форилирования при эксперимент а льном инфаркте мио карда 63
3.5. Влияние факторов роста на репарацию и ремоделирование миокарда в зоне ишемического повреждения 67
3.6. Влияние изменения уровня факторов роста на апоптоз в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза 74
Заключение 76
Выводы 87
Список использованных источников
- Моделирование ишемического повреждения миокарда
- Иммунофлюоресцентные исследования
- Неоангиогенез в условиях измененной концентрации факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда
- Влияние изменения уровня факторов роста на апоптоз в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза
Моделирование ишемического повреждения миокарда
В последние десятилетия исследованиям возможностей регенерации тканей и органов уделяется чрезвычайное внимание. Даже произошло формирование целого раздела отрасли медицинской науки – регенеративной медицины. В рамках этого направления активно изучаются возможности добиться полноценной репаративной регенерации с восстановлением (или минимизацией потери) структуры и функции органов, повреждённых в результате заболевания, механической травмы или других неблагоприятных воздействий [Gersh B.J. et al., 2009; Nakagawa T., 2014]. При этом диапазон методов, применяемых для достижения конечной цели, чрезвычайно широк – от использования клеточных технологий до биоинженерных решений с попытками воссоздания структуры сложных тканей из набора единичных клеток аналогами метода 3D печати [Kanashiroakeuchi R.M. et al., 2011; Templin C. et al., 2011; Ye K.Y., Black L.D., 2011; Schulman I.H., Hare J.M., 2012; Kawaguchi N. et al., 2013; Di Stefano B., Graf T., 2014].
Одним из наиболее активно изучаемых разделов репаративной регенерации является репарация миокарда, особенно после его ишемического повреждения. Такое внимание к исследованиям восстановительных процессов при инфарктах миокарда отчасти обусловлено высоким уровнем заболеваемости, быстрым развитием и прогрессированием сердечной недостаточности у лиц, перенёсших инфаркт миокарда в анамнезе, а также крайне плохой способностью миокарда к регенерации в постнатальный период [Rozenberg V.D., Nepomnyashchikh L.M., 2003; Roger V.L. et al, 2011; Лушникова Е.Л. и др., 2013; Шальнова С.А. и др., 2012; Rui L. et al., 2014].
К настоящему времени достигнуты значительные успехи в разработке методов восстановления повреждённой мышцы сердца.
Направлений в данных исследованиях несколько – это попытки минимизации ишемического повреждения, как профилактического характера (т. н. «прекондиционириование миокарда») [Fryer R.M. et al., 2002; Salloum F. et al., 2003; Liem D.A. et al., 2005. Downey J.M., Cohen M.V., 2009], так и воздействия после эпизода ишемического повреждения («посткондиционирование») [Zhao Z.Q. et al., 2003; Vinten-Johansen J. et al., 2005; McFalls E.O. et al., 2007; Zang W.J. et al., 2007; Argaud L. et al., 2008; Murphy E., Steenbergen C., 2008]. Активно используется введение локально в миокард или удалённо в другие ткани культур клеток, как дифференцированных зрелых, так и стволовых клеток с разной степенью потенций к дифференцировке [Непомнящих Л.М. и др., 2005; Ларионов П.М. и др., 2009; Larionov P.M. et al., 2009; Сергеевичев Д.С. и др., 2010; Abdelwahid E. et al., 2011; Laflamme M.A., Murry C.E., 2011; Karantalis V. et al., 2012; Pawani H., Bhartiya D., 2013; Hastings C.L. et al., 2014; Matar A.A., Chong J.J., 2014].
In vitro удалось добиться формирования культур клеток с кардиомиоци-тарным вектором дифференцировки из первичных стволовых клеток [Min J.Y. et al., 2002; Laflamme M.A. et al., 2007; Fernandes S. et al., 2010; Pearl J.I. et al., 2011] или плюрипотентных клеток, полученных из зрелых фибробластов [Budniatzky I. et al., 2014]. Даже проведены успешные попытки ex vivo заселения соединительнотканного каркаса сердца грызуна клетками миоцитарно-го ряда и эндотелиоцитами, что привело к формированию стенок полостей, обладающих способностью к сокращению и по строению очень близких к естественно сформированному сердцу [Thavandiran N. et al., 2013; Soler-Botija C. et al., 2014].
Однако вследствие низкого пролиферативного потенциала кардиомио-цитов естественная репарация повреждённого миокарда происходит за счёт быстрого развития соединительнотканного рубца, который после своего формирования крайне медленно подвергается трансформации и служит серьёзным препятствием для восстановления контрактильной части миокарда [Ро-зенберг В.Д., Непомнящих Л.М., 2003; Непомнящих Л.М., 2007; Chin M.T., Murry C.E., 2012].
Поэтому остаётся актуальным вопрос регуляции пролиферативной активности клеток в очаге ишемического повреждения, целью которого должно являться разумное снижение пролиферативной и синтетической активности фибробластов и одновременное усиление регенераторной способности кар-диомиоцитов или клеток-предшественников с кардиомиоцитарным направлением дифференцировки.
Большинство изменений, развивающихся как вследствие ишемического повреждения, так и в качестве адаптивного ответа на него, замыкаются на достаточно узкий спектр внутриклеточных путей реализации ответа.
Показано, что адаптация ткани к ишемии сопровождается активацией ряда тирозинкиназ [Maslov L.N. et al., 2009; Zhang J. et al., 2009; Cheng Y. et al., 2013]. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в редокс-сигнализации путем аутофосфорилирования их собственных тирозинов внутри клеток. Фосфорилирование тирозинкиназ связано с активацией фосфоли-паз C (PLC) и D (PLD), приводящих к активации множества киназ, включая фосфокиназу С (РКС) и митоген-активирующую протеинкиназу (МАРК).
Механические напряжения, например, в периинфарктной зоне, действуют через потенциальные механорецепторы (интегрины, цитоскелетные и сарколеммаотные протеины) и являются триггером для многих внутриклеточных путей передачи сигнала – MAP-киназ, JAK-, активатора транскрипции STAT, кальцийневрин-зависимого пути. Активация по этим путям приводит к активации сходных последующих факторов транскрипции, таких как NF-kB и AP-1, что требуется для индукции основных генов, ответственных за синтез цитокинов, включая TNF- и IL-6 [Beg A.A., Baltimore D., 1996].
В процессе функционирования внутриклеточных сигнальных механизмов необходимы один или несколько участков MAP-киназного каскада. Среди трех различных семейств MAP-киназ известны два, регулируемые внеклеточным стрессом: активируемая стрессом протеинкиназа (SAPK), известная также как c-Jun-концевая киназа (JNK), и p38 MAP-киназа [Шурыгина И.А. и др., 2009; Lochner A. et al., 2009; Sucher R. et al., 2009]. Каждая из киназ выполняет в клетке различные функции, так как они имеют разные клеточные мишени и участвуют в различных механизмах передачи сигнала. По-видимому, активация индуцируемых стрессом протеинкиназ необходима для адаптации тканей к ишемии [Flacke J.P. et al., 2009].
Раздельные исследования миогенного и ангиогенного эффектов ишемии in vitro на миобластах и эндотелиальных клетках выявили, что миобла-сты экспрессируют рецепторы HMGB1 RAGE и TLR4 и в процессе диффе-ренцировки эта экспрессия уменьшается. HMGB1 экскретируется дифференцированными миобластами и усиливает хемотаксическую активность мио 14 генных клеток. Этот эффект частично связан с RAGE и ингибируется при введении BoxA. HMGB1 стимулирует образование тубулярных структур эн-дотелиоцитами посредством активации путей трансдукции, связанных с extracellular signal-regulated kinase (ERK) и JNK [De Mori R. et al., 2007].
С киназными механизмами очень тесно связаны регуляторы клеточного роста, относящиеся к различным группам ростовых факторов. При этом многие из них являются индукторами нуклеарных сигналов, изменяющих геном-кодируемое состояние клетки.
Наибольшее значение в сигнальных системах при ишемическом повреждении среди ростовых факторов отводится 2 группам – фактору роста эндотелия сосудов (Vasoendothelial Growth Factor, VEGF) и фактору роста фиб-робластов (Fibroblast Growth Factor, FGF) [Isner J.M., Asahara T., 1999].
Проведёнными ранее исследованиями показано, что уровень VEGF и FGF меняется при развитии инфаркта миокарда [Шурыгин М.Г. и др., 2007]. VEGF и FGF существенно влияют на постинфарктное ремоделирование, в частности улучшают реперфузию за счёт неоваскуляризации [Шурыгин М.Г. и др., 2005; Дремина Н.Н. и др., 2009; Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., 2010], действуют как факторы выживания эндотелия [Дремина Н.Н. и др., 2008], влияют на динамику фаз воспаления [Шурыгин М.Г. и др., 2006, 2007; Дре-мина Н.Н., Шурыгин М.Г., 2007; Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., 2010], изменяют плотность коллагеновых волокон в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза [Шурыгин М.Г. и др., 2006, 2008].
Кроме того, установлено, что вазоэндотелиальный фактор роста стимулирует митотическую активность кардиомиоцитов [Дремина Н.Н. и др., 2009; Непомнящих Л.М. и др., 2010]. Отмечено, что FGF2 ограничивает цитолиз при инфаркте миокарда [Шурыгин М.Г. и др., 2008], в то время как VEGF таким эффектом не обладает [Шурыгин М.Г. и др., 2008].
Иммунофлюоресцентные исследования
Причем при летальных исходах, случившихся в течение нескольких часов после развития инфаркта, регистрировались ярко окрашенные нейтрофи-лы в сосудах периинфарктной зоны, а также ярко окрашенные нейтрофилы в зоне инфаркта (рис. 13).
В срок давности инфаркта от 1 до 2-х суток фиксировали дегрануляцию нейтрофилов, потерю окраски цитоплазмы нейтрофилов. Параллельно с этим было зафиксировано появление яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта, что отражает диффузию ММР9 из выделенных нейтрофилами гранул в ткани (рис. 14). В случае летальных исходов в более поздние сроки (3 – 30 суток) появлялась специфическая окраска клеток фибробластического ряда в пограничной зоне. Наличие MMP9 в фибробластах связывают с необходимостью перестройки внеклеточного матрикса при образовании и созревании соединительной ткани. При этом максимальная выраженность окраски отмечена на 7 – 14 сутки (рис. 15). После 30 суток специфическая окраска в зоне постинфарктного кардиосклероза не регистрировалась.
Таким образом, окрашивание на ММP9 на гистологических препаратах в разные сроки после развития инфаркта миокарда отражает как динамику цитолитического процесса и выход ММP9 в зону повреждения в ранние сроки патологического процесса, так и функциональную активность ряда клеток по ремоделированию фибриллярных белков в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза в поздние сроки.
При этом в ранние сроки основным источником ММP9 в зоне повреждения являются нейтрофилы, мигрирующие в очаг ишемического повреждения во время нейтрофильной фазы воспаления.
В поздние сроки окраска на ММР9 клеток фибробластического ряда с максимумом окраски на 7 - 4 сутки отражает появление в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза клеток с фиброкластической активностью, одной из основных функций которых является перестройка внеклеточного матрикса. Известно, что ремоделирование миокарда, происходящее после эпизода ишемического повреждения, имеет очень важный аспект — перестройку соединительнотканного каркаса. При этом развивается ферментативное расщепление существовавших ранее соединительнотканных волокон (преимущественно коллагена) и синтез нового межуточного вещества, орга 48 низующегося согласно новым условиям механических нагрузок органа. Наибольшую роль в этом процессе отводят ферментам группы металлопро-теиназ.
Интенсивность окраски фиброкластов в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза отражает активность перестройки внеклеточного матрикса в сроки 7 – 14 суток после перенесенного инфаркта миокарда. Снижение активности данного процесса сопровождается снижением интенсивности и последующим исчезновением специфической окраски. В связи с четко выраженной стадийностью применение окраски на ММP9 при инфаркте миокарда удобно использовать для определения давности возникновения инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании.
Для исследования активности клеток по синтезу новых соединительнотканных волокон была исследована экспрессия проколлагена в зоне репарации некротизированных при инфаркте миокарда тканей и прилегающих зонах.
Единичные клетки, экспрессирующие проколлаген I А1, в зоне инфаркта миокарда впервые обнаружены на 3-и сутки патологического процесса, находки оставались немногочисленными и на 4-6 сутки. Их количество нарастало к 7 – 13-м суткам (рис. 16), с 14 до 30 суток сохранялось большое количество таких клеток в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, однако интенсивность окраски этих клеток несколько снижалась (рис. 17). Однако слабо выраженную положительную окраску удалось выявить в зоне постинфарктного кардиосклероза при сроке давности инфаркта миокарда более 1 месяца (рис. 18). Это свидетельствует о сохраняющейся – пусть и незначительной – синтетической активности фибробластов в области постинфарктного кардиосклероза и о продолжающемся ремоделировании постинфарктной зоны.
Нами также изучена экспрессия эндотелина в тканях сердца при инфаркте миокарда. Как известно, эндотелиальные клетки увеличивают продукцию эндотелина в ответ на гипоксию, оксидированные формы липопроте-идов низкой плотности, провоспалительные цитокины.
При инфаркте миокарда в первые сутки зарегистрирована подчеркну-тость сосудов в зоне некроза миокарда. В остальные сроки сохранялась окраска эдотелиоцитов, в основном в периинфарктной зоне. При этом макси 49 мальная интенсивнсть окраски отмечена на 7-13 сутки (рис. 19 – 21).
Ярко окрашенные фибробласты в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, 8 суток после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ColIA1, докрашивание гематоксилином).
Фибробласты в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, 21 сутки после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ColIA1, докрашивание гематоксилином). Рис. 18. Фибробласты, экспрессирующие ColIA1 в зоне постинфарктного кардиосклероза. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ColIA1, докрашивание гематоксилином).
Окраска эндотелиоцитов на ЕТ-1/2/3 в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. 7 суток. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). Рис. 20. Окраска эндотелиоцитов на ЕТ-1/2/3 в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. 15 суток. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином).
Окраска эндотелиоцитов на ЕТ-1/2/3 в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. 28 суток. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). В отсутствии в сосудах гладкомышечных клеток, имеющих доминирующие ETA рецепторы (при активации которых развивается вазоспазм), выделяемый эндотелин связывается с ETB рецепторами на эндотелиоцитах, что приводит к активации синтеза и экскреции NO и, как следствие, - вазодилата-ции посткапиллярного русла. Также для миокарда описано связывание эндо-телина с Gq-протеином, приводящее к ускорению реполяризации (развитие положительного хронотропного эффекта) и активация пути передачи сигнала IP3. Усиление стимуляции IP3 вызывает высвобождение в кардиомиоцитах Ca2+ саркоплазматическим ретикулумом, что дает положительный инотроп-ный эффект.
Морфометрический анализ влияния факторов роста на фибробластическую фазу воспаления при экспериментальном инфаркте миокарда Для изучения влияния факторов роста на процессы ремоделирования миокарда при экспериментальном инфаркте у крыс проводили количественную оценку клеточных элементов в динамике процесса формирования постинфарктного рубца в зоне инфаркта.
При изучении морфологической картины выявлено, что у животных фибробластическая фаза начиналась с 3 суток, когда в зоне некроза формировалась грануляционная ткань. На 7 сутки в зоне некроза происходило замещение некротизированных тканей молодой соединительной тканью. На 14-30 сутки наблюдали созревание соединительной ткани. При этом интенсивность пролиферации фибробластов и сроки максимальной выраженности фиб-робластической фазы, а также трансформация активных фибробластов в фиброциты в группах различались.
Неоангиогенез в условиях измененной концентрации факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда
Неравномерность распределения выявляемого комплеска OxPhos, вероятно, связана с изменением условий функционирования и перестройкой структуры клеток. Таким образом, при введении экзогенных факторов роста внутрисер-дечно в инфарктной зоне активность комплексов окислительного фосфори-лирования восстанавливалась быстрее в сравнении с контрольной группой животных и со снижением уровня факторов роста.
Для оценки динамики клеточных популяций в зоне ишемического повреждения при экспериментальном инфаркте миокарда и влиянии на этот процесс вазоэндотелиального и фибробластического факторов роста нами оценена экспрессия CD34, CD45, ММР9, проколлагена (Col1A1).
Как известно, фенотип CD34+ характерен для клеток со слабой диффе-ренцировкой, плюрипотентных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, CD45+ - для клеток, имеющих костномозговое происхождение, в то же время фенотип CD34+CD45+ отмечается у прогениторных клеток фибробла-стического ряда и предшественников кроветворных клеток. Так как предшественники мегакарио-, лейко-, лимфо- и эритроцитарных ростков локализуются в костном мозге и не попадают в периферический кровоток, то выявление клеток с таким фенотипом в очаге повреждения означает приход проге-ниторных клеток, служащих в дальнейшем одним из источников роста фиб-робластов в зоне повреждения.
У животных контрольной группы CD34+ и CD45+ клетки в зоне ише-мического повреждения впервые обнаружены через 1 сутки после моделирования инфаркта миокарда. Причем если на 1 и 3 сутки процесса CD34+ клетки были немногочисленными, то CD45+ - выявлялись только единичные клетки. Сочетание CD34+CD45+ обнаружить не удалось. На 7, 14 и 30 сутки регистрировалось небольшое число CD34+ клеток, единичные CD45+ выявлялись на 7 и 14 сутки.
При искусственном повышении уровня VEGF в периинфарктной зоне с 1-х по 14-е сутки выявлялось большое число клеток, несущих маркеры CD34+ и CD45+. Причем клетки, одновременно экспрессирующие оба маркера, выявлялись с 1-х по 14-е сутки с максимумом на 14-е сутки (рис. 36).
При искусственном подавлении активности вазоэндотелиального фактора роста CD34+ клетки в зоне ишемического повреждения регистрировались с 1-х по 7-е сутки с максимумом на 3-и сутки, CD45+ были немногочисленны и выявлялись только на 3-и и 7-е сутки (рис. 37). Одновременного наличия обоих кластеров дифференцировки на клетках в очаге ишемического повреждения при его репарации у этой группы животных не выявлено.
Выявленные особенности типирования источников и дифференциро-ванности клеток в участке репаративной регенерации после ишемического повреждения миокарда свидетельствуют о том, что в обычных условиях практически все клетки имеют локальный генез, а при активации пролифера-тивной активности происходит их частичная дедифференцировка. В условиях значительного повышения уровня ростовых факторов в участке репарации появляются клетки с фенотипом CD34+CD45+, описанные в литературе как прогениторы клеток фибробластического ряда с достаточно низким уровнем дифференцировки (в зависимости от направления дифференцировки могут выступать в качестве предшественников тканей мезенхимального происхождения).
Ремоделирование миокарда, происходящее после эпизода ишемическо-го повреждения, имеет и еще один очень важный аспект — перестройку соединительнотканного каркаса. При этом развивается ферментативное расщепление существовавших ранее соединительнотканных волокон (преимущественно коллагена) и синтез нового межуточного вещества, организующегося согласно новым условиям механических нагрузок органа. Наибольшую роль в этом процессе отводят ферментам группы металлопротеаз. Рис. 36. Группа VEGF, 3 суток, зона инфаркта миокарда. Большое количество CD34+ клеток и CD45+ клеток, наличие клеток CD34+CD45+ (виделены). Иммунофлюоресценция (CD34 мечены AlexaFluor 488, CD45 мечены AlexaFluor 568, докраска ядер DAPI).
Группа антиVEGF, 3 суток, зона инфаркта миокарда. Большое количество CD34+ клеток, единичная CD45+ клетка. Иммунофлюоресценция (CD34 мечены AlexaFluor 488, CD45 мечены AlexaFluor 568, докраска ядер DAPI). Как известно, металлопротеаза 9 в высоких концентрациях присутствует в нейтрофилах. Невысокие концентрации этого фермента характерны для определенных клеток фибробластического ряда – фиброкластов. В нашем исследовании в ранние сроки (до 3 суток) в зоне ишемического повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. В более поздние сроки отмечалась окраска клеток фиб-робластического ряда. Так, в контрольной группе с 3-х по 30-е сутки наблюдалась окраска единичных клеток фибробластического ряда (рис. 38).
При искусственном повышении уровня факторов роста положительные на ММР9 клетки фибробластического ряда также регистрировались с 3 по 30 сутки, однако их количество было значительно выше, чем в контрольной группе (рис. 39).
При искусственном подавлении активности факторов роста удавалось зафиксировать лишь единичные положительно окрашенные на ММР9 клетки фибробластического ряда в зоне ишемического повреждения (рис. 40).
Синтетическую активность фибробластов, обеспечивающую образование внеклеточного матрикса вновь образуемой соединительной ткани, оценивали по экспрессии Col1A1. У контрольной группы животных наблюдали положительную окраску клеток фибробластического ряда на 3-и и 7-е сутки (рис. 41). Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски на Col1A1 (рис. 42, 43).
Все это свидетельствует о том, что при высокой активности факторов роста в начальные периоды после эпизода ишемического повреждения формируется программа репарации, при которой за счет длительного существования клеток соединительной ткани с достаточно высоким уровнем экспрессии MMP9 и Col1A1 длительно сохраняется высокая скорость ремоделирова-ния формирующегося рубца.
Влияние изменения уровня факторов роста на апоптоз в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза
В настоящее время воздействия, направленные на ограничение объёма некроза ишемизированных тканей, носят в большей степени профилактический характер. Профилактические воздействия эффективны в случае их применения до возникновения длительной ишемии, заканчивающейся развитием некроза.
Однако в практической деятельности чаще встречаются ситуации, при которых нет возможности провести профилактическую подготовку к предполагаемому ишемическому воздействию, и необходимой становится защита тканей от уже развившегося ишемического повреждения.
Как можно видеть из предшествующего анализа, адаптация ткани к ишемии сопровождается активацией ряда тирозинкиназ [Zhang J., et al., 2009; Maslov L.N. et al., 2009]. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в редокс-сигнализации путем аутофосфорилирования их собственных тирози-нов внутри клеток.
С киназными механизмами очень тесно связаны регуляторы клеточного роста, относящиеся к различным группам ростовых факторов. При этом многие из них являются индукторами нуклеарных сигналов, изменяющих геном-кодируемое состояние клетки.
Наибольшее значение в сигнальных системах при ишемическом повреждении среди ростовых факторов отводится 2 группам – фактору роста эндотелия сосудов и фактору роста фибробластов [Isner J.M., Asahara T., 1999].
VEGF – один из важнейших факторов существования и роста эндотелия [Marti H.H., Risau W. , 1999; Yl-Herttuala S. et al., 2007; Kajdaniuk D. et al., 2011; Katoh M., 2013]. Он индуцирует ангиогенез и пролиферацию эндо-телиоцитов. Это гликопротеин, который секретируется различными клетками в виде димера с молекулярной массой 34-45 кДа. К числу клеток-продуцентов VEGF относятся макрофаги, эпителиальные клетки лёгких и почек, мышечные клетки и др., однако, как правило, этот фактор не секретируется клетками эндотелия [Mac Gabhann F., Popel A.S., 2008].
Экспрессию VEGF регулируют многие факторы. Например, тканевая гипоксия, которая наблюдается при ишемии, стимулирует аутокринную и па 77 ракринную экспрессию VEGF. Зафиксировано увеличение экспрессии VEGF в миокарде при ишемии, причём, так как в эксперименте не наблюдалось значимого некроза кардиомиоцитов, исследователи склонны считать данное увеличение следствием стимуляции именно секреции фактора роста [Chad H.G. et al., 2004].
Другим ведущим внеклеточным стимулятором внутриклеточных ки-назных путей является фактор роста фибробластов FGF [House S.L. et al., 2011; Itoh N., Ohta H., 2013].
Основной фактор роста фибробластов – один из наиболее консервативных белков. У разных видов животных отмечается высокая гомология этого фактора. Например, у быка и человека в пределах 146 аминокислотных остатков он отличается только на два остатка. Принято считать, что такая высокая консервативность свидетельствует о фундаментальных функциях белка.
В целом ростовые факторы семейства FGF обладают широким спектром мишеней и биологических активностей для реализации адаптогенного ответа при ишемическом повреждении. Они являются мощными модуляторами клеточной дифференцировки, пролиферации, подвижности и выживаемости. Ни один из известных к настоящему времени факторов не обладает таким широким спектром эффектов на такое большое количество клеточных типов, как основной и кислотный факторы роста фибробластов. Кроме активации фибробластов в плане пролиферативного эффекта клетками-мишенями FGF являются эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки сосудов и др. [Senger D.R., Van De Water L., 2000; Poole T.J. et al., 2001; Monti M. et al., 2013].
Безусловно, открытие ростовых факторов и изучение их роли в процессах репарации привело к попыткам использования их как перспективного средства при состояниях, сопровождающихся недостатком кровоснабжения. В качестве лекарственных средств использовались выделенные ростовые факторы или кодирующие их плазмиды – в виде нативных субстанций или трансфекцией посредством аденовирусного вектора [Khurana R. et al., 2001; Tmr J. et al., 2001; Bashir R. et al., 2002; Dulak J. et al., 2006; Lavu M. et al., 2011; Williams P.D., Kingston P.A., 2011; Giacca M., Zacchigna S., 2012]. Рассуждая о перспективах данного направления воздействия на состояния, связанные с ишемическим повреждением миокарда, необходимо отметить нерешённость ряда вопросов по использованию изменения уровней ростовых факторов для минимизации последствий инфаркта миокарда и быстрейшего восстановления структуры и функции после такого события.
Прежде всего это то, что при инфаркте миокарда репарация происходит преимущественно за счёт быстрого развития соединительнотканного рубца. Сформированная соединительная ткань исключает восстановление контрак-тильной способности поврежденного миокарда [Chin M.T., Murry C.E., 2012] и, более того, создают дополнительную нагрузку на сохранившийся миокард [Лебединский В.Ю. и др., 1991].
Ранее было продемонстрировано, что путём изменения уровня таких факторов роста, как VEGF и FGF2 можно повлиять на развитие рубцовой ткани в очаге постинфарктного кардиосклероза, а также пролиферативный потенциал кардиомиоцитов и эндотелиоцитов – в том числе осуществляя индукцию регенераторных реакций миокарда в постинфарктный период (Шу-рыгин М.Г. и др., 2007; Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г., 2008; Дремина Н.Н. и др., 2009).
Нами изучено влияние изменённых концентраций факторов роста VEGF и FGF2 на дифференцировку фибробластов и процессы репаративной регенерации миокарда в постинфарктный период.
Исследование проведено на патологоанатомическом материале от 30 человек с различными сроками инфаркта миокарда, а также на экспериментальной модели инфаркта миокарда у 250 самок крыс линии Wistar.
В модельном эксперименте исследования проведены в 5 группах по 50 жифотных каждая – группа контроля, группы с повышенным уровнем факторов роста – VEGFA и FGF2, а также с пониженным уровнем факторов роста – антиVEGF и антиFGF2. В рамках эксперимента обеспечено наблюдение за животными в течение 30 суток, с 8 временными точками – 2, 6, 12, 24 часа, 3, 7, 14 и 30 суток. Использован комплекс современных морфологических исследований (световая микроскопия; морфометрия; иммуногистохимическое окрашивание на MMP9, Col1A1, эндотелин; иммунофлюоресцентное окра 79 шивание на CD34, CD45, anti-OxPhos Complex IV, pro-Caspase 3).
В результате проведённых исследований патологоанатомического материала выявлено, что во всех наблюдаемых в рамках работы случаев инфаркта миокарда наблюдалась классическая картина, зависевшая от срока, прошедшего с момента инфаркта.
Динамику различных дифферонов фибробластов в зоне инфаркта миокарда оценивали по экспрессии CD34, CD45, ММР9 и проколлагена (Col1A1).
Фенотип CD34+ характерен для клеток со слабой дифференцировкой, плюрипотентных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, CD45+ – для клеток, имеющих костномозговое происхождение, а фенотип CD34+CD45+ свидетельствует о принадлежности к прогениторным клеткам костномозгового происхождения – предшественникам фибробластов.
При мечении маркеров CD34 и CD45 установлено, что в зоне инфаркта миокарда у людей СD45+-клетки появлялись с первых суток патологического процесса и регистрировались до 10 – 14 сут. В более поздние сроки (до 21 сут) выявлялись единичные положительно окрашенные клетки. CD34+-клетки в зоне инфаркта не выявлялись, соответственно, не регистрировались и клетки, несущие одновременно маркеры CD34+ и CD45+. Это свидетельствует о том, что фибробласты в зоне формирования рубца имеют своим источником резидентные фибробласты, активируемые при некрозе миокарда.
ММP9, выявляемая в клетках фибробластного ряда, свидетельствует о принадлежности этой клетки к дифферону фиброкластов. При исследовании патологоанатомического материала в ранние сроки (до 3 сут) в зоне ишеми-ческого повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. Причем при летальных исходах, развившихся в течение нескольких часов после инфаркта миокарда, регистрировались нейтрофилы с ярко окрашенными гранулами в сосудах пери-инфарктной зоны, а также в зоне инфаркта.
Похожие диссертации на Роль факторов роста в дифференцировке фибробластов при постинфарктной репаративной регенерации миокарда
