Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 12
1.1 Предпосылки возникновения и краткая история становления методов непрямой ревакуляризации 12
1.2 Биофизические аспекты взаимодействия хирургических лазеров с биологическими тканями 17
1.3 Экспериментальные исследования лазерной реваскуляризации миокарда 22
1.4 Ангиогенез в норме и патологии 26
1.5 Ангиопоэтины и эфрины 34
1.6 Ангиогенные ингибиторы 36
1.7 Неоваскуляризация поврежденного миокарда 38
1.8 Перицит 39
1.9 Функция перицитов в ангиогенезе и развитии сосудов 40
1.10 Имплантация клеток костномозгового происхождения — биологический «шунт» при лечении ИБС 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 Характеристика материала 44
2.2 Общая схема эксперимента 44
2.3 Методика выполнения моделирования острого инфаркта миокарда (который спустя 3 месяца расценивался в качестве модели хронической ишемической болезни сердца) 44
2.4 Особенности оперативного вмешательства при выполнении воздействия транмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией аутологичных клеток 45
2.5 Получение и диагностика мононуклеарной фракции клеток костного мозга 47
2.6 Оценка перфузии миокарда с использованием 99тТс 48
2.7 Морфологические методы 48
2.8 Морфологическая оценка плотности артериол и капилляров 49
2.9 Флюоресцентная кариометрия миокарда в зонах комбинированной реваскуляризации и у животных с моделью ХИБС 50
2.10. Иммуногистохимическая реакция на определение PCNA при комбинированной реваскуляризации и у животных с моделью ХИБС 52
2.11 Статистические методы исследования 52
Глава 3. Результаты собственных исследований 53
3.1 Макроскопический анализ сердец 53
3.2 Гистологическая характеристика миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС 54
3.3 Гистологическая характеристика миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС при комбинированной реваскуляризации 60
3.4 Анализ микроциркуляции миокарда по данным сцинтиграфии при моделировании ХИБС и комбинированной реваскуляризации 68
3.5 Результаты оценки микроциркуляции преирубцовой зоны при моделировании ХИБС и комбинированной реваскуляризации по выявлению в эндотелии сосудов (артериол) щелочной фосфатазы 70
3.6 Результаты морфометрии микроциркуляции модели ХИБС и при комбинированной реваскуляризации с окрашиванием изолектином В4 71
3.7 Результаты кариометрии уровня PCNA кардиомиоцитов модели ХИБС и при комбинированной реваскуляризации 73
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 78
Выводы 106
Практические рекомендации 107
Список литературы 108
- Биофизические аспекты взаимодействия хирургических лазеров с биологическими тканями
- Методика выполнения моделирования острого инфаркта миокарда (который спустя 3 месяца расценивался в качестве модели хронической ишемической болезни сердца)
- Флюоресцентная кариометрия миокарда в зонах комбинированной реваскуляризации и у животных с моделью ХИБС
- Гистологическая характеристика миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС при комбинированной реваскуляризации
Введение к работе
Актуальность исследования
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из ведущих мест среди заболеваний, определяющих уровень смертности среди населения стран с постиндустриальным и индустриальным уровнем общественного развития.
Более того, последние достижения в области хирургии коронарных артерий сердца - это расширяющиеся возможности стснтирования, увеличение числа повторных и множественных аорто-коронарных шунтирований.
В то же время именно эти факторы являются значимыми для формирования отряда пациентов, нуждающихся в непрямой реваскуляризации миокарда вследствие прогрессирования основного заболевания и невозможности выполнения прямых оперативных вмешательствах на коронарных артериях (Бокерия Л.А., 1998; Salomon N. W. etal., 1990).
Другой важный фактор, ограничивающий возможности прямых методов реваскуляризации - это пациенты с первичным поражением дистального коронарного русла. Для таких пациентов методом выбора остаются варианты непрямой реваскуляризации миокарда, которые включают лазерную реваскуляризацию, имплантацию клеток с ангиогенным потенциалом, а в последние годы приобретает все большее число сторонников метод комбинированной реваскуляризации - лазерной и интрамиокардиальной имплантации клеток (Klein Н.М. et al., 2004; Ларионов П.М. и др., 2004; Gowdak L. et al, 2005; Чернявский A.M. и др., 2007; Караськов A.M. и др., 2007; Gowdak L.H. et al., 2008).
Эта группа авторов гипотетизирует, что синергизм ангиогенного потенциала клеток костномозгового происхождения и термического воздействия лазерного излучения на миокард может являться могучим инструментом непрямой реваскуляризации миокарда пациентов в конечной стадии ишемической болезни сердца.
Другая группа исследователей полагает, что синергизм воздействия на миокард комбинации «лазер плюс клетки» может реализовываться в плоскости лазерной стимуляции ангиогенеза с одной стороны и восполнении клеточным материалом дефектного миокарда за счет имплантации в лазерные каналы аутологичных миобластных элементов (Esha I. et al., 2007).
В то же время на сегодняшний день остается неясной возможность регенерации миокарда «взрослого сердца» вообще н в условиях улучшения микроциркуляторного русла. Сейчас считается, что кардиомиоциты (КМЦ) сердца человека после года от момента рождения не способны к ги перил астической регенерации, возможна только внутриклеточная регенерация. Более того, рядом авторов было показано, что число кардиомиоцитов в течение жизни не меняется (Chien K.R., Olson E.N., 2002; MacLellan W.R., Schneider M.D., 2000).
Однако ряд экспериментальных исследований последних лет и клинических наблюдений в области трансплантологии позволили выдвинуть несколько гипотез клеточного обновления миокарда: - регенерация миокарда может происходить за счет пролиферации резидентных (эндогенных) стволовых клеток миокарда при его повреждении; - возможно «fusion» или слияние ядер клеток костного мозга (ККМ) с кардиомиоцитами; - возможна транедифференцировка клеток костномозгового происхождения в кардиомиоциты (Urbanek К. et al., 2005; Varma J. et al., 2005; Beltrami A.P., et al. 2001; Muller Patrick et al., 2002).
Вместе с тем в настоящее время сложилась ситуация, когда энтузиазм клинического применения клеточных технологий для непрямой реваскуляризации миокарда обогнал экспериментальное обоснование использования этих методов, что стало предметом бурных дискуссий в мировом научном сообществе и послужило поводом к обсуждению моратория на проведение новых клинических испытаний (Nadal-Ginard В., V. Fuster, 2007).
Цель экспериментальной работы. Дать комплексную морфологическую характеристику регенерации перирубцовой зоны миокарда в условиях комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга на модели хронической ишемической болезни сердца.
Задачи работы:
Дать макроскопическую и гистологическую характеристику миокарда перирубцовой зоны модели хронической ишемической болезни сердца у животных (собак);
Дать гистологическую характеристику изменений миокарда перирубцовой зоны модели хронической ишемической болезни сердца после лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга;
Оценить микроциркуляторное русло перирубцовой зоны миокарда на модели хронической ишемии без воздействия, а так же после лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга;
Оценить регенераторные возможности кардиомиоцитов перирубцовой зоны на модели хронической ишемии без воздействия, а так же после лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Модель ХИБС с формированием постинфарктного рубца 3-х и более месяцев у собаки является адекватным объектом для последующего изучения эффектов реваскуляризации и регенерации миокарда перирубцовой зоны.
Лазерная реваскуляризация миокарда в комбинации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга оказывает акцентированное аугмептационное влияние на перестройку сосудистого русла в целом, а в большей степени на микроциркуляторное звено.
Наблюдаемое усиление плотности сосудов микроциркуляторного русла в местах проведения комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации миокарда в сочетании с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга - приводит к активации регенераторных процессов в кардиомиоцитах перирубцовой зоны.
Научная новизна.
Впервые представлена развернутая морфологическая картина изменений сосудистого русла миокарда перирубцовой зоны постинфарктной модели хронической ишемии, включающая особенности перестройки сосудистого русла: облитерацию интрамуральных артерий, перекалибровку венозного русла с уменьшением просветов или формированием многоствольных сосудов, появление в артериолах «подушечек Конти» за счет эксцентричной пролиферации интимального и медиального слоев.
Так же впервые показаны особенности формирования сосудов синусоидного тина перирубцовой зоны миокарда модели ХИБС после комбинированной лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга, которые уменьшались в направлении от эпикарда к эндокарду с максимальным диаметром от 1200мкм до 40мкм.
Впервые были выявлены своеобразные очаговые инфильтраты из крупных клеток с гиперхомными ядрами неправильной формы, конденсированным хроматином, пенистой или оксифильной цитоплазмой, которые формировали структуры в виде цепочек в местах комбинированной реваскуляризации.
Впервые продемонстрировано, что в местах комбинированной реваскуляризации вместе с увеличением перфузии, плотности артериол и капилляров наблюдается достоверное усиление процессов регенерации кардиомиоцитов. Это подтверждалось увеличением численной плотности ядер, показателей суммарной площади ядер, процента площади ядер по отношению к миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра, а так же увеличением PCNA позитивных кардиомиоцитов.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о принципиальной возможности регенерации кардиомиоцитов миокарда крупных млекопитающих. Создание и комплексный морфологический анализ модели ХИБС с длительной экспланацией ишемии может послужить фундаментом последующего изучения механизмов регенерации кардиоцитов крупных млекопитающих с переносом полученных знаний на проявления репарации человеческого сердца в условиях хронической ишемии. В этом смысле нами выявлен важнейший фактор, устраняющий блокаду регенерации кардиоцитов - устранение циркуляторной пшоксемии за счет комбинированной реваскуляризации миокарда - сочетанного лазерного воздействия и имплантации собственных клеток костного мозга. Комбинированный метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием полупроводникового лазера и аутологичных клеток костного мозга выполняется в рамках ограниченного клинического испытания в хирургической практике Новосибирского НИИ патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина (г.Новосибирск).
Апробация работы. Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены: на XIII Международной конференции по аэрофизическим методам исследования (Новосибирск,2007), на Международной научно-практическая конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности Национального центра биотехнологий Министерства образования и науки Республики Казахстан (Алматы, 2008), на открытом заседании Учёного совета Новосибирского ННИ патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина (Новосибирск, 2008), на объединенном заседании кафедр анатомии человека, гистологии и эмбриологии, топографической анатомии, патологической анатомии Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2009).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описаний методик исследования и полученных результатов, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 251 источник ( 31 отечественных и 220 зарубежных авторов). Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.
Биофизические аспекты взаимодействия хирургических лазеров с биологическими тканями
В зависимости от активного вещества лазерной системы (Кавецкий Р.Е. и др. 1969; Скобелкин O.K. и др. 1986) квантовые генераторы подразделяются на: 1. Твердотельные - с активным веществом в виде кристалла, устроенные на основе: - неодимового стекла и алюмоиттриевого граната, легированного неодимом (Nd:YAG - лазер), Х- 1,06 мкм; - кристалла рубина, X - 0,693 мкм; 2. Лазеры газовые: - С02, инфракрасный спектр излучения, X - 10,6 мкм; - аргоновый, X - 0,42 - 0,52 мкм; - азотный, ультрафиолетовый, Х- 337 нм; - ксенон-хлорный, ультрафиолетовый, X - 308 нм; - криптон-фторный, ультрафиолетовый, X - 248 нм; - НС12- фтор-гелий ультрафиолетовый, X - 222 нм; - аргон-фтор-гелий ультрафиолетовый, X - 193 нм; 3. Лазеры с активным веществом на парах меди, X - 0,51 - 0,58 мкм; 4. Лазеры на основе полупроводников (диодные), маломощные, с разнообразными спектрами излучения, отличающиеся высоким коэффициентом полезного действия.
Рассматривая особенности взаимодействия биологических тканей с лазерным излучением, была предложена простая классификация используемых хирургических лазеров, которая была ориентирована на физические процессы, возникающие при взаимодействии лазерного излучения с биологическими тканями.
Во-первых, «холодные» лазеры, главным механизмом оптимизированного воздействия лазерного излучения которых является холодная абляция ниже температуры тела за счет фото-химического воздействия на межмолекулярные связи. К этим лазерам относятся эксимерные ультрафиолетовые лазеры с длинами волн 337 нм., 308 нм., 248 нм., 222 нм., 193 нм., с порогом абляции от 200 мДж/см2 до 6 Дж/см2; причем при пороге плотности энергии 5,6Дж/см2 происходит равномерная абляция неравномерно минерализированных биологических тканей (Литасова Е.Е. и др., 95; Литасова Е.Е. и др. 1995; Литасова Е.Е. и др., 1998г; Ларионов П.М. и др., 1999; Литасова Е.Е. и др., 1999).
Во-вторых, это «горячие» лазеры, воздействие которых на биологическую ткань определяется высокой температурой, значительно более высокой, чем температура тела. Более того, в группе горячих лазеров резонно выделить мощные лазеры с параметрами от нескольких сот Вт до 1-2 кВт. Большее увеличение мощности не имеет смысла в применении к биологическим объектам.
Другая группа «горячих» лазеров нами охарактеризована как высокопроизводительные. В этих лазерах мощность излучения не превышает нескольких десятков Вт, но благодаря высокому коэффициенту поглощения лазерного излучения водой, содержащейся в тканях, достигается высокая производительность. В этих лазерах чаще используются длины волн видимого или инфракрасного спектров.
Так же надо заметить, что в предлагаемой схеме, классифицирующей хирургические лазерные системы, мы не рассматриваем такую характеристику, как глубина проникновения лазерного излучения, которая в свою очередь определяется длиной волны лазерного излучения и особенностью оптических свойств ткани.
Такие характеристики лазерного излучения как непрерывность или возможность импульсного режима, с модификацией продолжительности импульса и продолжительностью периода между импульсами во многом являются показателями, определяющими возможность оптимизации лазерного излучении при воздействии на биологические ткани.
К основным механизмам взаимодействия «горячих» лазеров с биологическими тканями относят «вапоризацию» или испарение воды из тканей, которая достигается при температуре от 100С и более, фактически речь идет о переходе флюидов тканей и клеток из жидкого в газообразное состояние (Дерлеменко Л.И., 1978). Следует так же учесть, что процесс «вапоризации» при включении хирургических режимов лазерных систем носит исключительно скоротечный характер, который в последующем сменяется следующей фазой - фазой критического подъема температуры (Кошелев В.Н., Ю.В. Чалык, 1985; Рунков В.П., В.Н. Потапов, 1989; Чирешкин Д.Г. и др., 1990; Eckhauser M.L., 1990).
Методика выполнения моделирования острого инфаркта миокарда (который спустя 3 месяца расценивался в качестве модели хронической ишемической болезни сердца)
Всем животным было проведено моделирование острого инфаркта миокарда, путем перевязки передней межжелудочковой коронарной артерии в средней трети и коллатеральных ветвей первой диагональной артерии в условиях интубационного наркоза. Премедикация осуществлялась внутримышечным введением калипсола Юмг/кг, атропина 0,1% - 0,1мг/кг, димедрола 1% - 2,0мл, дроперидола 0,8мг/кг. Затем после утраты болевой чувствительности и наступления сна животное фиксировалось на операционном столе в положение на правом боку. Для исключения гипоксических осложнений во всех случаях проводилась интубация трахеи и последующая искусственная вентиляция легких атмосферным воздухом. Управляемое дыхание осуществлялось с помощью аппарата РО-6. Основной наркоз - калипсол 15мг/кг в час, дроперидол - 0,3мг/кг в час - вводился вместе с кристаллоидными расстворами (5% раствор глюкозы, 0,9% раствор хлорида натрия) путем внутривенных капельных инфузий. Перевязка коронарных артерий выполнялась из левостороннего торакотомного доступа.
Формирование инфаркта миокарда подтверждалось электрокардиографически и визуально по изменению цвета ишемизированного участка - верхушки левого желудочка, его передней стенки и частично боковой. После моделирования инфаркта выполнялся гемостаз н послойное ушивание раны с оставлением дренажа для эвакуации воздуха. Воздух удалялся после окончания действия наркоза. По окончании вмешательства животные выводились из наркоза. При адекватном самостоятельном дыхании - экстубировались и помещались в клетку с последующим уходом (кормление, прогулки, уборка помещения). Все собаки получали анальгетики и антибактериальную терапию в течение 3 недель после операции.
При проведении непрямой реваскуляризации выполнялось стандартное анестезиологическое обеспечение. Специальной подготовки в предоперационном периоде не проводилось, за исключением голодной диеты накануне операции. Премедикация осуществлялась внутримышечным введением калипсола 10мг/кг, атропина 0,1% - 0,1мг/кг, димедрола 1% -2,0мл, дроперидола 0,8мг/кг. Затем после утраты болевой чувствительности и наступления сна животное фиксировалось на операционном столе в положение на правом боку. Для исключения гипоксических осложнений во всех случаях проводилась интубация трахеи и последующая искусственная вентиляция легких атмосферным воздухом. Управляемое дыхание осуществлялось с помощью аппарата РО-6. Основной наркоз - калипсол 15мг/кг в час, дроперидол - 0,3мг/кг в час - вводился вместе с кристаллоидными растворами (5% раствор глюкозы, 0,9% раствор хлорида натрия) путем внутривенных капельных инфузий.
Доступ к сердцу осуществлялся путем левосторонней торакотомии в 4-ом межреберье. Производилась перикардиотомия. При помощи полупроводникового лазера «ИРЭ-ПОЛЮС-1,56мкм» перифокально области постинфарктного рубца переднебоковой стенки левого желудочка (ЛЖ) создавались 8-12 слепых (не проникающих в полость ЛЖ) косо-направленных лазерных каналов. Лазерное излучение подводилось через кварцевый световод в непрерывном режиме мощностью 8 Вт. В образованные каналы иглой 22G вводилась суспензия аутологичных клеток костного мозга в объеме 1,5-2 мл (5х10б кл/мл). Эпикардиальное отверстие канала ушивалось предварительно наложенным узловым швом.
Рана грудной клетки ушивалась наглухо с оставлением дренажа для эвакуации воздуха из плевральной полости, который удалялся после окончания операции. Во время операции проводилось постоянное ЭКГ-мониторирование, в случае возникновения фибрилляции желудочков производилась дефибрилляция аппаратом «ДКИ Н-02». Послеоперационный период у всех животных протекал гладко. По окончании вмешательства животные выводились из наркоза. При адекватном самостоятельном дыхании - экстубировались и помещались в клетку с последующим уходом (кормление, прогулки, уборка помещения). Общее состояние собак оценивалось как удовлетворительное. После экстубации сохранялись адекватное самостоятельное дыхание и стабильная гемодинамика. Не наблюдалось расхождений краев или нагноений послеоперационной раны, а также других осложнений. Все собаки получали антибактериальную терапию бициллин-3 600000 ЕД внутримышечно 3 раза в сутки в течение 3 дней после операции.
Флюоресцентная кариометрия миокарда в зонах комбинированной реваскуляризации и у животных с моделью ХИБС
Использовано по 2 тканевых фрагмента миокарда левых желудочков, размерами 0,5х0,5х0,4(см) от каждого из анализируемых сердец, всего 28 фрагментов. Фрагменты миокарда перирубцовой области иссекались не далее 1 Омм от края рубца так же, как готовились пробы из тканей сердец при использовании комбинированной реваскуляризации - «лазер плюс клетки». Из каждого фрагмента изготавливалось от 8 до 12 срезов. Срезы монтировались на подготовленные предметные стекла с нанесенным на них L-polylisin (Sigma). Окрашивались в водном растворе, содержащим 10uG/mL ethidium bromide (флюоресцентного ядерного красителя), продолжительность окрашивания 9 минут при комнатной температуре. Затем следовали 4 отмывки в дистиллированной воде по 4 минуты в каждой порции, монтировались покровные стекла. Для монтирования использовалась водосодержащая среда на основе поливинила.
Карио-денситометрический флюоресцентный анализ выполнен с использованием модуля автоматических измерений. Программа модуля готовилась с активацией маск-фильтров Sigma, Treshold, Size, Sharpening, Segmentation (для исключения или включения объектов при анализе). Использован однофазный режим. Были заданы следующие аналитические параметры: средняя численная плотность ядер на тестовую площадь (М±т), средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь (М±т, мкм2), средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда (М±т, %), средняя площадь ядра (М±т, мкм2), средний «идеальный» диаметр ядра исходя из средней площади миокарда (М±т, мкм2), денситометрический максимум ядер кардиоцитов в DensitometrcUnit, денситометрический минимум ядер кардиоцитов в DensitometrcUnit. Аналитическое увеличение 630 крат, тестовая площадь одного изображения 39437 мкм2.
Для получения изображений и последующего анализа флюоресценции ядер миокарда использовался микроскоп М200 с камерой AxioCam HRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 4.7, его программный модуль полуавтоматических измерений, объектив Neofluar хбЗ с конечным увеличением 640 крат, блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).
Так же проведена иммуногистохимическая реакция на определение ядерного протеина ( PCNA) методом двойного мечения. В соотношении 1:90 готовился окрашивающий раствор антител против PCNA (Rb.pol.Ab, Lot.473985, Ab.2426-1) с инкубацией в течение ночи при температуре +4С, затем после отмывок следовало окрашивание со вторыми антителами (Goat pAb to Rb IgG меченных FITC, Lot.459401, ab.6717-1) в концентрации 1:200 2 часа при комнатной температуре с использованием орбитального шейкера, после отмывок выполнено контрокрашивание ядер водным раствором DAPY (Sigma) 50iG/mL, в течение 30 минут, после отмывки - заключение под покровные стекла.
Готовились 2- канальные изображения с использованием программного модуля Multichenal Zeiss с блоками фильтров (filter set 38 BR470-40, FT495, BR525-50 - для канала FITC; filter set 49 G 365, FT 395, BR 445-50 - для канала DAPY ), объектив Neofluar хбЗ., блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).
Статистический анализ результатов выполнен с помощью программных пакетов Microsoft Excel и OriginPro 7.0 с использованием критериев ANOVA в доверительном интервале Р 0,05. Рис. 1 Экспериментальная модель ХИБС, аневризма передней и боковой стенок ЛЖ с захватом верхушки. Масса сердец в контрольной группе модели ХИБС (п-5) варьировала в пределах от 38 до 50 грамм, в группе с воздействием на перирубцовую область миокарда от 34 до 56 грамм. В 3 из 5 наблюдений контрольной группы и в 6 наблюдениях из 9 группы с воздействием на перирубцовую область выявлялись аневризмы ЛЖ с максимальными размерами 4х4,5(см) и минимальными 2,5х2,5(см) (Рис. 1,2), где первая величина - длинник, ориентированный от верхушки к базальной части сердца и второй размер -поперечник, перпендикулярно ориентированный длиннику. Аневризмы всегда распространялись на переднюю стенку и верхушку с вовлечением боковой стенки ЛЖ. Во всех других наблюдениях, если аневризма не определялась, обнаруживался грубый трансмуральный рубец, сопровождавшийся склерозом эндокарда и эпикарда в его проекции.
Гистологическая характеристика миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС при комбинированной реваскуляризации
При обзорной микроскопии мест проведения комбинированного воздействия «лазер плюс клетки» можно выделить ряд постоянных морфологических черт, к которым относятся: формирование своеобразного участка склеротической ткани с высокой степенью неоваскуляризации (своеобразие заключалось в продольной упорядоченности фиброзированных волокон и поперечной ориентацией просветов мелких от 15 до 40 мкм. в диаметре кровенаполненных сосудов) (Рис.10).
Кроме того, можно утверждать, что другим важнейшим морфологическим признаком было формирование крупных, более ЮООмкм, тонкостенных, синусоидального типа, часто кровенаполненных сосудов, местами сливавщихся между собой и ориентированых на границу рубцовой зоны или располагающиеся непосредственно в зоне рубца (Рис.11, 12).
Кроме того, к постоянным гистологическим «симптомам» можно отнести образование тонкостенных сосудов синусоидного типа, меньших диаметром, от 40 до 500мкм., которые всегда ориентированы на зону воздействия (Рис.13). Нами была выявлена определенная закономерность: синусоидальные сосуды умеынались по направлению от эпикарда к эндокарду. Следующим по значимости и постоянно встречающимся гистологическим симптомом было явление интрамиокардиального ангиоматоза (Рис. 14). Обращено внимание, что в элементах формирующих ангиоматозные структуры сохранялась пролиферативная активность (Рис.15).
Наблюдалось характерное для ангиоматоза формирование ангиальных структур по типу «сосуда в сосуде», которые также выявлялись в зоне воздействия (Рис.16).
Так же в зоне воздействия на миокард наблюдался диффузный рост небольших, мономорфных, очень близких по своим морфологическим свойствам, одинаковых, «штампованных» сосудов с гиперхромным эндотелием; здесь же обнаруживались «сосудистые почки».
И последней постоянной морфологической чертой мест воздействия на миокард являлось присутствие очаговых инфильтратов из крупных клеток, часто с пролиферативной активностью, частью многоядерных (Рис.17). Эти гиперхромные клетки с преобладанием цитоплазмы часто формировали своеобразные цепочки (Рис.18.).
Более того, можно было проследить стадию формирования капилляра от крупной клетки с гиперхромным, эксцентрично расположенным ядром и слабо оксифильной цитоплазмой в стадию, когда ядро удлинялось и появлялось своеобразное расщепление с неравномерной конденсацией хроматина. Следующим этапом было собственно формирование сосудистой почки без четко сформированного просвета к сосудистой почке со сформированным просветом (Рис. 19).
Интересным симптомом, также выявляемым в зоне воздействия, был феномен мумификации отдельных волокон или небольших групп волокон, когда сохранялась характерная для поперечнополосатой мускулатуры поперечная исчерченность и могла определяться кальцификация (Рис. 20, 21).
У всех трех животных с моделью ХИБС выявлены распространенные дефекты перфузии в области передней стенки ЛЖ, частично боковой стенки ЛЖ и захватывали всю верхушку (Рис. 22, 23, 24).
Результаты воздействия на миокард в комбинации «лазер плюс клетки» показали, что воздействие на периинфарктную область комбинированного метода - «лазер плюс клетки» привело к увеличению перфузии на 50% в верхушечном сегменте и полному исчезновению дефекта перфузии по боковой стенке левого желудочка (Рис.25), сопоставление с (Рис.24).
Анализировались только поперечные контуры позитивно окрашиваемых сосудов, от темно-коричневого до черного цвета. Если встречались косо-продольные или продольные контуры сосудов, они не учитывались при морфометрическом анализе. В таблице 1 представлены материалы, послужившие предметом изучения: суммарное количество анализируемых капилляров и сумма анализируемых площадей по группам (мкм2).
Из данных, представленных в таблице 1, видно, что плотность сосудов миокарда в зоне воздействия «лазер плюс клетки» достоверно выше.
В таблице 2 представлены материалы, послужившие предметом изучения: суммарное количество анализируемых капилляров и сумма анализируемых площадей по группам (мкм2). На рисунке (Рис.20) представлено двухканальное изображение миокардиального волокна, желто-оранжевые контуры капилляров, аутофлюоресценция в качестве контрастера.
