Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Клинические и экспериментальные исследования цереброваскулярных повреждений головного мозга: патогенетические аспекты и новые стратегии лечения на основе клеточных технологий (обзор литературы) 11
1.1. Патогенез нарушений церебрального кровообращения 11
1.2. Нарушение венозного кровотока при удалении менингиом в области средней трети верхнего сагиттального синуса 20
1.3. Экспериментальные модели сосудистых поражений головного мозга 26
1.4. Мск в лечении очаговых повреждений головного мозга у экспериментальных животных 29
1.4.1. Регенеративный ответ в цнс как новая мишень в лечении повреждений головного мозга 29
1.4.2. Мск как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга 30
1.4.3. Влияние мск на неврологическое восстановление в моделях ишемического инсульта 33
1.4.4. Механизмы, лежащие в основе эффекта мск 34
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Объект исследования 37
2.2. Методика моделирования очагового нарушения венозного кровообращения головного мозга у экспериментальных животных 39
2.3. Характеристика сформированных групп 41
2.4. Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока 45
2.4.1. Оценка неврологического статуса животных 46
2.4.2. Электрофизиологическая активность головного мозга крыс 48
2.4.3. Магнитно-резонансная томография головного мозга крыс 49
2.4.4. Морфологическое исследование головного мозга 50
2.5. Генерация мезенхимальных стромальных клеток 51
2.6. Статистическая обработка полученных результатов 52
Глава 3. Результаты собственных исследований 53
3.1. Морфо-функциональная характеристика созданной экспериментальной модели очага нарушения венозного кровообращения головного мозга 53
3.1.1. Характеристика общего состояния и неврологических выпадений при самопроизвольном восстановлении функции головного мозга животных 53
3.1.2. Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока 60
3.2. Влияние мск на восстановление неврологических выпадений крыс при экспериментальном очаговом повреждении головного мозга, вызванном нарушением венозного кровотока 76
3.3. Влияние мск на электрофизиологическую активность головного мозга в модели очагового нарушения венозного кровообращения 83
3.4. Влияние мск на характер морфологических изменений в модели очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока 89
Заключение 98
Выводы 103
Практические рекомендации 103
Список сокращений 106
Список литературы
- Экспериментальные модели сосудистых поражений головного мозга
- Мск как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга
- Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока
- Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Поражение головного мозга (ПГМ) в результате нарушения мозгового кровообращения представляет серьезную медико-социальную проблему и наносит огромный экономический ущерб обществу, поскольку является причиной экстренной госпитализации, длительной инвалидизации и в развитых странах занимает третье место среди причин смертности взрослого населения после онкологических заболеваний и сердечной патологии (Гусев Е.И. и др., 2001; Elbert T. et al., 2003; Петрова О.А., 2005; Тибекина Л.М. и др., 2009; Федоров В.Н., 2012).
Лидирующая позиция в структуре сосудистых заболеваний головного мозга принадлежит ишемическим инсультам, которые встречаются в 70–80% случаев, 20–30% приходится на долю геморрагических инсультов и 5 % в структуре цереброваскулярных патологий занимают субарахноидальные кровоизлияния (Исмагилов М.Ф., 2005).
Наряду с нарушениями артериального кровообращения серьезную проблему – в связи со сложностью диагностики, недостаточной изученностью патогенеза и отсутствием эффективных методов лечения – представляют нарушения венозного кровотока, обусловленные венозными кровоизлияниями, тромбозами мозговых вен и тромбозами синусов. В последнее время этой патологии посвящено немало работ (Литвиненко Д.В., 2006; Музлаев Г.Г. и др., 2002; Семенов С.Е. и др., 2009; Стулин И.Д. и др., 2009; Шахнович А.Р. и др., 2009; . et al., 2005; Dawson E. A. et al., 2004; Doepp F. et al., 2008; Handley T.P. et al., 2010; Mller-Bhl U., 2010; Иванов А.Ю., 2011; Kotlinska-Hasiec E. et al., 2013; Beggs C.B. et al., 2013; Guo X.B. et al., 2013).
Вместе с этим, развитие очаговых церебрально-васкулярных нарушений может быть следствием осложнений хирургического лечения парасагиттальных менингиом, локализованных в средней и задней трети верхнего сагиттального синуса (Габибов Г.А., 1975; Иванов А.Ю. 2011; Ступак В.В. и др., 2013). Это связано с тем, что удаление парасагиттальных менингиом данной локализации нередко ведет к травматизации впадающих в синус крупных венозных коллекторов и развитию обширного венозного инфаркта мозга. Все это нередко приводит у больного к развитию нового или к углублению уже имеющегося неврологического дефицита. Развитие парезов и параличей в конечностях приводит к значительному снижению качества жизни. Об этом свидетельствует тот факт, что после удаления менингиом, растущих из верхнего сагиттального синуса, большое число больных остаются инвалидами. Так, по данным Габибова Г.А. (1975), только 50 % больных через 5 лет после операции были практически здоровы и трудоспособны, 15 % являлись инвалидами, но могли обслуживать себя, а остальные оставались глубокими инвалидами. Согласно исследованиям Габибова Г.А. (1975); Тиглиева Г.С., Можаева С.В. и др. (1994) до 50 % (28,8-47,5 %) больных после операции имеют неврологические нарушения, а 18,6 % – остаются глубокими инвалидами (Беставашвили Ф.И., 1995; Чернов С.В., 2008; Ступак В.В. и др., 2013).
Отсутствие эффективных методов лечения при данных поражениях головного мозга побуждает искать новые терапевтические подходы, направленные на стимуляцию процессов репарации нервной ткани. Особая роль в этом направлении отводится клеточным технологиям. Долгое время считалось, что центральная нервная система (ЦНС) не способна к репарации. Однако экспериментальные исследования последних лет показали, что процессы репарации могут наблюдаться и в поврежденной ткани ЦНС, причем эти процессы во многом обусловлены образованием новых сосудов, генерацией новых нервных клеток и в значительной степени – реорганизацией нейронной сети (нейропластичность) (Tate C.C. et al., 2012). Более того, многочисленные экспериментальные исследования показали эффективность клеточной терапии при коррекции неврологических нарушений в моделях повреждения головного мозга сосудистого генеза (Omori et al., 2008; Акопян Ж.А., 2010; Yang M. et al., 2010; Ярыгин К.Н. и др., 2012).
Среди различных типов клеток наибольшее внимание в последнее время привлекают мезенхимальные стромальные клетки (МСК), способные стимулировать ангиогенез, активировать нейральные стволовые клетки, оказывать нейротрофическую поддержку и модулировать процессы воспаления (Chen J. et al., 2001; Соколова И.Б. и др., 2007; Griffiths М.R. et al., 2010; Walker Р.А. et al., 2011; Wang S. P. et al., 2012; Bao X.J. et al., 2013).
Однако ограниченность моделей очаговых ПГМ сосудистого генеза, среди которых основной является окклюзия среднемозговой артерии, а также отсутствие ясности в отношении оптимальных сроков и путей введения клеток, существенно тормозят развитие клеточных технологий и их трансляцию в клиническую практику.
Цель исследования: Разработать экспериментальную модель очагового церебрального поражения, индуцированного нарушением венозного кровотока, и на основании комплексных исследований оценить влияние мезенхимальных стромальных клеток на морфо-функциональное восстановление головного мозга.
Задачи исследования:
1. Разработать модель очагового поражения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока, и оценить характер повреждений головного мозга, тяжесть неврологических расстройств и эффективность их спонтанного восстановления.
2. В разработанной модели исследовать влияние мезенхимальных стромальных клеток на восстановление неврологического дефицита в зависимости от путей и сроков проведения клеточной терапии.
3. Провести сравнительную оценку электрофизиологических параметров головного мозга путем регистрации сомато-сенсорных вызванных потенциалов до и после оперативного вмешательства в группах животных с самопроизвольным восстановлением неврологического дефицита и с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток.
4. В рамках разработанной модели провести сравнительную характеристику патогистологических изменений головного мозга у экспериментальных животных после трансплантации мезенхимальных стромальных клеток и в группах с самопроизвольным восстановлением.
Научная новизна заключается в том, что впервые:
- показано, что облитерация верхнего сагиттального синуса в средней трети путем его полной биполярной коагуляции с одновременной коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области у крыс моделирует выраженное ПГМ, которое характеризуется тяжелым неврологическим дефицитом с доминированием очаговых расстройств, сочетающихся в остром периоде с общемозговой симптоматикой, и низким уровнем спонтанного восстановления;
- установлено, что морфологическим субстратом церебрального повреждения является зона омертвения (некроза) головного мозга, который развивается на фоне выраженного отека и нарушения микроциркуляции в венозном русле по смешанному типу (стазы, тромбозы, кровоизлияния), и впоследствии подвергается рубцовому замещению с кистозной дегенерацией. Формирование очага отека на фоне выключения венозного кровотока при сохранении артериального кровообращения с последующим образованием в зоне повреждения кистозной полости подтверждается также данными магнитно-резонансной томографии (МРТ);
- на основе полученных экспериментальных данных разработан новый способ очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровообращения «Способ моделирования ишемического поражения головного мозга» (Патент №. 2 432 619 РФ. Авторы Ступак В.В., Васильев И.А., Самохин А.Г.);
- в разработанной оригинальной модели очагового нарушения церебрального венозного кровотока продемонстрирована безопасность и эффективность трансплантации МСК с целью коррекции неврологического дефицита;
- установлено, что трансплантация животным МСК в разработанной модели не вызывает локальных или системных осложнений и приводит к достоверному улучшению неврологических функций. Положительный эффект трансплантации МСК проявляется при внутривенном и локальном их введении, как в остром, так и в подостром периодах. При этом наиболее эффективным режимом является внутривенное введение клеток и проведение терапии в остром периоде, начиная с 1-х суток с момента формирования очага венозной ишемии.
Клиническая эффективность трансплантации МСК подтверждается данными электрофизиологического обследования. У животных контрольной группы снижение амплитуды сомато-сенсорных вызванных потенциалов (ССВП) в послеоперационном периоде носит выраженный и стойкий характер. У крыс с трансплантацией МСК с 14-х суток наблюдается возрастание амплитуды ССВП, а к 21-м суткам – восстановление электрофизиологической активности практически до исходного уровня.
На основании исследований морфологических изменений головного мозга животных после трансплантации МСК установлено, что позитивный эффект внутривенного введения клеток ассоциирован с активацией ангиогенеза, подавлением деструктивного отека, дистрофических изменений и воспаления и более эффективной организацией поврежденной ткани (образование компактного глиомезодермального рубца с меньшей кистозной дегенерацией).
Практическая значимость
Разработанная модель тяжелых очаговых ПГМ позволяет оценить безопасность и эффективность различных фармакологических и клеточных воздействий. Данный способ приближен к патогенезу повреждений, связанных с развитием венозного инфаркта, возникающих после травматизации крупных венозных коллекторов и венозных синусов после удаления парасагиттальных менингиом.
Выявленный позитивный эффект трансплантации МСК на восстановление неврологического дефицита у экспериментальных животных в разработанной модели очагового ишемического поражения головного мозга является обоснованием для дальнейшего продвижения клеточных технологий в клиническую практику.
Морфо-функциональные данные в виде ССВП и МРТ-исследования головного мозга свидетельствуют о целесообразности их использования в клинической практике для объективизации эффектов клеточной терапии при очаговых повреждениях головного мозга.
Положения, выносимые на защиту
1. Моделирование поражений головного мозга венозного характера путем биполярной коагуляции верхнего сагиттального синуса с последующей коагуляцией корковых вен в левой теменно-височной области приводит к развитию тяжелого неврологического дефицита с доминированием очаговых расстройств и низким уровнем спонтанного восстановления.
2. Морфологическим субстратом в разработанной модели является очаг некроза головного мозга с последующим замещением зоны повреждения рубцовой тканью с кистозной дегенерацией.
3. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток в разработанной модели является эффективным методом восстановления неврологического дефицита с наилучшим клиническим эффектом при использовании внутривенного режима введения и проведения терапии в ранние сроки, что подтверждается данными клинических, электрофизиологических и морфологических исследований.
Основные положения работы доложены на:
Всероссийской научной школе-конференции МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2010 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск, 2010 г.; Заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска. 2011 г.; VII Сибирском физиологическом съезде, г. Красноярск, 2012 г.; VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Цивьяновские чтения», НИИТО, Новосибирск 2013 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21-а научная работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах, содержит 32 рисунка, 10 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка использованной литературы, содержащего 241 источник, из них 85 на русском и 156 на иностранных языках.
Личный вклад автора. Автор лично провел все 100% оперативных вмешательств на животных по моделированию очагового поражения головного мозга венозного характера и отработал методику забора клеточного материала. Все 100% клинического материала, полученные в эксперименте, проанализированы и статистически обработаны автором самостоятельно.
Экспериментальные модели сосудистых поражений головного мозга
Нарушения венозного кровообращения в головном мозге, вызванные преимущественно тромбозом или сдавлением церебральных венозных синусов, крайне трудны для диагностики в связи с небольшой распространенностью и отсутствием характерной симптоматики поражения. И поэтому механизмы нарушений венозной гемоциркуляции остаются во многом неизученными.
Единственным крупным исследованием тромбоза церебрального венозного синуса является завершенное в 2004 году исследование (International Studyon Cerebral Veinand Dural Sinus Thrombosis) [212], охватившее 624 пациента в 89 центрах Европы.
Анализируя патологические факторы, вызывающие нарушения мозгового венозного кровообращения, важно отметить, что многие из них известны как причины расстройства кровообращения в артериальном русле. Это подтверждает взаимосвязь и взаимозависимость артериального и венозного компонентов мозгового кровообращения.
Раннее возникновение очага некроза в какой-либо области мозга при сосудистых заболеваниях объясняли закрытием соответствующего сосуда. При этом в тех наблюдениях, в которых причина образования инфаркта была неясна, чаще всего формирование его считали результатом эмболии мозгового сосуда. Несколько позже было установлено, что параллелизм между анатомическими изменениями мозга и его сосудов отмечается только в небольшом проценте наблюдений.
Основные положения о сосудистой мозговой недостаточности разработаны Corday et al., Denny-Brown [115, 118]. Согласно этой теории, в развитии инфаркта мозга имеют значение не только местные условия кровообращения в мозге (анатомическое состояние сосудов, степень развития коллатерального кровообращения, особенности ангиоархитектоники), но и экстрацеребральные факторы. Среди последних главными являются состояние сердечно-сосудистой системы, кровопотери, перераспределение крови с отвлечением ее от головы. Каждый из факторов может выявить уже имеющуюся недостаточность снабжения кровью мозга, при этом полная закупорка просвета сосуда не является обязательным условием для возникновения инфаркта.
Еще ранее в экспериментальных исследованиях [27, 30] было показано, что в развитии очаговых изменений в головном мозге при перевязке крупной артерии большое значение имеют величина системного артериального давления и состояние коллатерального кровообращения.
В 60-х годах прошлого века были уточнены отдельные положения концепции сосудистой мозговой недостаточности [82, 83, 190, 191]. Было установлено, что у лиц со стенозом внечерепных и внутричерепных отделов артерий мозга повторные неврологические нарушения могут быть обусловлены преходящим внезапным уменьшением кровотока в той или иной области мозга.
Сосудистая мозговая недостаточность в самой общей форме определяется как состояние диспропорции между потребностью и возможностями обеспечения головного мозга полноценным кровоснабжением. Возникновение мозговой недостаточности происходит на фоне неполноценности кровоснабжения мозга вследствие изменений в его сосудистой системе и при дополнительном уменьшении притока крови к мозгу под влиянием экстрацеребральных факторов. В участках мозга с критическим уровнем кровоснабжения требуется усиление мозгового кровотока вдвое в связи с повышением в них неврональной активности [2].
До настоящего времени причина возникновения разных видов инфарктов точно не установлена. Остается открытым вопрос о том, почему при одинаковых условиях в одних случаях возникают белые, а в других красные или смешанные инфаркты [241]. Существуют различные объяснения, но ни одно из них не является исчерпывающим.
Чаще всего белые инфаркты возникают при очень слабо развитом коллатеральном кровообращении. Причины его недостаточности могут быть разными: быстрое наступление недостаточности кровоснабжения, вследствие чего коллатерали не успевают развиться, низкий уровень артериального давления, патологические изменения стенок сосудов [27, 30].
Большинство исследователей считают, что в патогенезе красных инфарктов важную роль играют повышенное артериальное давление и хорошо развитое коллатеральное кровообращение [126]. Некоторые авторы полагают, что возникновение геморрагических инфарктов возможно лишь при неполном или кратковременном закрытии просвета сосуда с последующим восстановлением кровотока [108]. Многие авторы [12] придают значение повышению проницаемости сосудов, находящихся в ишемизированной зоне. Немаловажную роль, как в развитии ишемии, так и восстановлении кровотока, играет фактор внезапности. Верещагин и Колтовер [12] наблюдали развитие обширных геморрагических инфарктов в полушариях мозга в зонах смежного кровообращения при внезапном распрямлении двусторонних перегибов сонных и позвоночных артерий в связи с восстановлением кровотока в них. В редких случаях в механизме развития красных инфарктов ведущим является прекращение или значительное затруднение венозного оттока [53, 138].
Обращает на себя внимание то, что красные инфаркты развиваются только в сером веществе мозга, а при смешанных инфарктах геморрагические участки располагаются также лишь в сером веществе мозга. Этот факт подчеркивает значение в патогенезе инфарктов (помимо приведенных выше факторов) местных условий, в основном ангиоархитектоники. Серое вещество гораздо богаче сосудами, чем белое, при этом в нем особенно обильна сеть мелких сосудов, в которых легче (а потому и чаще) возникают процессы дистонии с последующими диапедезными кровоизлияниями. Кроме того, в сером веществе более высок уровень процессов обмена, поэтому любое нарушение его питания скорее всего выявляется в этих образованиях мозга.
Мск как перспективные кандидаты для клеточной терапии повреждений головного мозга
На протяжении длительного времени считалось, что поврежденная нервная ткань не восстанавливается. Тем не менее, исследования 2-х последних десятилетий показали, что ЦНС также подвержена репаративной регенерации, хотя и в меньшей степени, чем другие ткани. Во-первых, выяснилось, что в головном мозге присутствуют нейральные стволовые клетки, которые сосредоточены в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и зубчатой извилине гипокампа [156, 202,]. При повреждении головного мозга эти клетки могут мигрировать в зону повреждения и дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [134, 176]. Во-вторых, стало очевидно, что важнейшим механизмом репарации является реорганизация нейронной сети – т.е. изменение количества и длины нейритов и установление новых синаптических связей – явление, получившее название нейропластичности [216]. Кроме того, обязательным компонентом репарации является восстановление гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и образование новых сосудов за счет ангио- и васкулогенеза [172, 238]. Способность ЦНС к репарации позволила предположить, что репаративный её ответ при сосудистых повреждениях головного мозга может являться новой мишенью терапевтических воздействий. Поэтому за последние годы произошло существенное смещение интереса от исследований в области нейропротекции к исследованиям нейрорегенеративных подходов, среди которых наибольший интерес представляют клеточные технологии.
Выявленное участие НСК в репарации ЦНС послужило основой для экспериментальных исследований, которые в первую очередь были сосредоточены на стволовых клетках (СК). В настоящее время по происхождению СК разделяются на эмбриональные и соматические. Первые выделяют из внутреннего слоя бластоцисты, вторые – из органов и тканей человека (постнатальные СК) или плода (фетальные СК). СК у взрослого человека присутствуют во всех органах и тканях, в том числе ЦНС. Среди них наиболее доступными и изученными являются СК костного мозга, обеспечивающие регенеративный резерв организма [96]. Костный мозг содержит как минимум три типа предшественников – гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), МСК и эндотелиальные предшественники (ЭП). ГСК дают начало всем типам клеток крови, ЭП – клеткам эндотелиального ряда, МСК дифференцируются в клетки мезенхимальных тканей. Среди них МСК привлекают особое внимание в качестве кандидатов для клеточной терапии при повреждениях ЦНС в силу ряда их биологических свойств [208]. МСК были впервые обнаружены отечественным исследователем А.Я. Фриденштейном и описаны как адгезивные клетки костного мозга, способные к самообновлению. Свое название они получили благодаря возможности дифференцировки в различные виды клеток (остеоциты, адипоциты, хондроциты и др.) в рамках мезенхимальной линии [140]. Хотя впервые эти клетки были выявлены в костном мозге, впоследствии выяснилось, что МСК могут быть выделены из жировой ткани, скелетных мышц, пульпы зуба, плаценты, амниотической жидкости, вартонова студня и пуповинной крови [171, 197, 209]. Предполагается также, что в организме нативные формы МСК могут быть представлены периваскулярными перицитами, локализованными во всех органах и тканях, а периваскулярные ниши являются естественным микроокружением для МСК в различных тканях [198, 199].
В 2006 году Международное общество по клеточной терапии предложило три «минимальных» критерия для идентификации МСК. Первый – это адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология; второй – характерный иммунофенотип, т.е. более 95 % МСК должны нести на поверхности стромальные маркеры CD105, CD73 и CD90 и менее 2 % – экспрессировать линейные маркеры гемопоэтических клеток (CD45), стволовых кроветворных клеток (CD34) и линейные маркеры лимфоцитов или моноцитов; и третий – способность к трилинейной дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты [193].
Исследование биологической активности МСК показало, что МСК обладают целым рядом привлекательных свойств [102, 189]: 1) относительно легко выделяются из различных тканей; 2) быстро разращиваются в культуре in vitro; 3) обладают низкой способностью к спонтанной дифференцировке при экспансии ex vivo; 4) способны мигрировать в очаг повреждения/воспаления, что позволяет использовать не только локальный, но и системный (внутривенный) путь введения клеток; 5) иммунологически интертны, что дает возможность использовать не только аутологичные, но и аллогенные МСК; 6) обладают противовоспалительной, иммуносупрессивной активностью; 7) секретируют множество трофических факторов, способных стимулировать рост различных клеток и обладающих противовоспалительной, антиапоптотической и антифибротической активностями; 8) характеризуются достаточно высокой пластичностью и могут в определенных условиях дифференцироваться в клетки тканей экто- и мезодермального происхождения.
Способность МСК к миграции в зону повреждения обусловлена экспрессией этими клетками различных хемокинов и хемокиновых рецепторов. Основными факторами, которые сопровождают любое повреждение и обеспечивают миграцию МСК, являются воспаление и гипоксия [105, 152, 200]. Клетки в зоне повреждения продуцируют различные цитокины, хемокины и ростовые факторы, которые привлекают МСК через взаимодействие с соответствующими рецепторами на поверхности клеток. Ключевая роль в миграции МСК отводится взаимодействию хемокинового рецептора CXCR4 на МСК с его лигандом SDF-1 [128, 175]. В адгезии МСК к эндотелию принимают участие молекулы E- and P-selectin, CD44, и VCAM-1 [185]. Миграция МСК в зону повреждения может также опосредоваться через взаимодействие высвобождаемого апоптотическими и некротическими клетками фактора роста гепатоцитов (HGF) с рецептором c-Met на МСК [148].
Оценка повреждений головного мозга, индуцированных нарушением венозного кровотока
Как видно (рисунок 2) исходный суммарный балл неврологического дефицита достоверно не отличался от такого в первой группе серии S1 и составлял 14,10 ± 0,35. Оценка выраженности неврологических расстройств в динамике наблюдения выявила снижение выраженности неврологической симптоматики вплоть до ее исчезновения. Так, уже на 7-е сутки суммарный балл по шкале ОТНН уменьшился до 7,80 ± 0,35, а к 14-м суткам – до 3,10 ± 1,07 баллов. Спустя три недели после операции он достиг минимального значения – 1,00 ± 0,09 балл. Погибших животных в этой группе не было.
В третью группу серии S1 вошли 16 выживших крыс (50 % от общего количества). У всех этих животных оперативное вмешательство сразу же приводило к тяжелому состоянию и возникновению грубых неврологических нарушений.
Сразу оговоримся, что в эксперимент не вошли погибшие животные и крысы, у которых общее состояние соответствовало средней степени тяжести. Их клинические результаты и морфо-функциональные данные не учитывались.
На первые сутки послеоперационного периода у выживших животных наблюдался тетрапарез во всех конечностях, наиболее выраженный и доходящий в ряде случаев до гемиплегии на контрлатеральной стороне от повреждения мозга, а также повышение тонуса мышц в паретических конечностях и хвосте. Эта симптоматика сочеталась с развитием гипостезии и грубым нарушением координации движений.
Наряду с очаговыми расстройствами, у крыс имелась выраженная общемозговая неврологическая симптоматика в виде выраженной вялости и сонливости и неспособности к самостоятельному приему пищи. Суммарный балл неврологических нарушений по шкале ОТНН в 1-е сутки в этой группе значительно превышал аналогичный показатель у животных первых двух групп, составляя 22,20 ± 0,13, что свидетельствовало о наличии тяжелой степени неврологического дефицита (рисунок 2). Общее состояние всех животных 3-й группы на протяжении первой недели послеоперационного периода оставалось тяжелым, что требовало проведения принудительного кормления.
Дальнейшее наблюдение за животными 3-й группы серии S1 и оценка неврологической симптоматики показало незначительное снижение балла ОТНН. Выраженный неврологический дефицит регистрировался через неделю с момента проведения операции (21,00 ± 0,10 балл). На 14-е сутки балл ОТНН продолжал оставаться близким к категории тяжелых повреждений (19,00 ± 0,10 баллов). Лишь к 21-м суткам с момента проведения операции отмечено снижение балла ОТНН до 15,70 ± 0,30. К этому сроку неврологические выпадения стабилизировались, отчетливого регресса неврологической симптоматики в дальнейшем не отмечено: у животных формировался особый стереотип в движениях, приеме пищи, воды. Двигательные нарушения на контралатеральной стороне были более выражены. Крысы становились не способными двигаться прямолинейно – периодически наблюдалось движение с поворотом в паретичную сторону. При оценке теста при поднятии животного за хвост отсутствовало сгибание передних и задних конечностей. К этому сроку, согласно шкале ОТНН, их состояние расценивалось как умеренное повреждение.
Анализируя полученные результаты очаговой и общемозговой неврологической симптоматики животных в трех группах, можно констатировать, что созданная модель локального очагового венозного поражения головного мозга у животных в группе №3 серии S1 не только приводит к тяжелому общему состоянию животных, но и вызывает развитие выраженного стойкого неврологического дефицита.
После экспериментальной отработки на крысах оригинальной модели очага нарушения венозного кровообращения головного мозга, в соответствии поставленными задачами, в дальнейшем исследовалось влияние МСК на динамику восстановления функции поврежденного головного мозга. С целью изучения влияния МСК на морфо-функциональное состояние головного мозга с очагом нарушения венозного кровообращения использованы два способа трансплантации МСК – внутривенный и местный.
Местная трансплантация МСК предполагала введение клеток через полихлорвиниловый катетер, подведенный к очагу поражения мозга. Для изучения степени травматичности данного пути введения клеток проведены две серии экспериментов на животных (таблица 3). Восьми крысам группы № 1 серии S2 формировали только очаговое повреждение мозга по разработанной нами методике и оценивали результаты самопроизвольного восстановления утраченных церебральных функций. Полученные результаты сопоставлены с данными самостоятельного восстановления неврологического дефицита, имеющимися у животных группы № 2 серии S2, которым также формировался аналогичный очаг венозного нарушения кровообращения, но с дополнительным введением под кожу полихлорвинилового катетера, через который планировалась трансплантация клеток.
На 1-е сутки после оперативного вмешательства у выживших животных первой и второй групп серии S2 суммарный средний балл неврологических нарушений по шкале ОТНН был одинаков и составлял 22,20 ± 0,10 и 22,50 ± 0,20 баллов соответственно (таблица 6), что свидетельствовало о наличии у всех крыс тяжелой степени неврологического дефицита. В дальнейшем общее состояние всех животных на протяжении первой недели послеоперационного периода оставалось тяжелым, требовало ухода и принудительного кормления.
К 7-м суткам послеоперационного периода в группе № 1 состояние крыс улучшалось, при этом регистрировалось достоверное снижение балла оценки тяжести неврологического дефицита (PКЗ=0,013), однако степень восстановления утраченных функций составляла, по сравнению с первыми сутками наблюдения, всего (9 ± 1) %. Из 8-и животных к этому сроку только две особи имели ОТНН менее 20 баллов, т.е. перешли в категорию умеренного неврологического дефицита.
Характеристика морфологических изменений головного мозга при моделировании нарушения венозного кровотока
Снижение амплитуды ССВП на поврежденной стороне регистрировалось на 7-е, 14-е и 21-е сутки у всех 8-и животных. Лишь у двух крыс этой группы наблюдалось незначительное спонтанное восстановление амплитуды ССВП к 21-м суткам.
Кроме того, у 5-и из 8-и животных на 14-е сутки по сравнению с исходными значениями отмечалось снижение ССВП в интактном полушарии (рисунок 25 б), что обусловило тенденцию к снижению средних значений амплитуды ССВП на 14-е (с 7,20 ± 1,19 до 5,30 ± 2,22 мкВ; p 0,05) и 21-е (6,30 ± 0,96 мкВ; p 0,05) сутки. Моделирование очагового повреждения приводило также к увеличению задержки ССВП с 9,20 ± 0,99 мс до 11,00 ± 1,14 мс, p 0,05 (различия не достоверны).
Подобно второй, у животных 3-й группы на 7-е сутки после операции выявлялось выраженное снижение амплитуды ССВП (с 8,00 ± 0,97 до 2,20 ± 1,42 мкВ; p 0,05) и незначительное увеличение задержки основных компонентов ССВП (с 11,20 ± 1,42 до 12,60 ± 1,37 мс; p 0,05) (рисунок 25 а). Однако введение МСК в первые сутки после операции приводило к значимому увеличению амплитуды ССВП к 14-м суткам у большинства особей (6 из 8-и) (рисунок 25 а). К этому сроку среднее значение амплитуды практически не отличалось от исходного показателя (7,90 ± 2,00 мкВ по сравнению с 8,00 ± 0,97 мкВ до операции). В итоге к 21-м суткам у всех животных амплитуды ССВП практически полностью восстанавливались.
На рисунке 27 представлены ССВП одного из животных третьей группы при наблюдении в динамике на протяжении 21-х суток.
Суммируя полученные данные, можно заключить, что отсутствие выраженных изменений ССВП у животных 1-й группы серии S3 подтверждает сохранность функциональной активности головного мозга при выполнении трепанации.
Формирование локального ПГМ вследствие нарушения венозного кровотока ассоциируется с выраженными изменениями регистрируемых потенциалов в течение всего срока (21 сутки) наблюдения. Наибольшая выраженность изменений ССВП на стороне поражения и незначительность этих изменений на интактной стороне являются дополнительными аргументами в пользу очагового характера моделируемого повреждения. Тем не менее, наличие изменений ССВП в контралатеральном полушарии у 5-и из 8-и животных может отражать тяжесть процесса, обусловливающего у ряда животных вовлечение в патологический процесс интактного полушария. Рисунок 27 – ССВП у животного № 6, 3-й группы серии S3: а – до оперативного вмешательства; б – через 7 суток; в – через 14 суток и г – через 21 сутки после формирования нарушения венозного кровообращения.
Наконец, улучшение показателей ССВП на фоне трансплантации МСК свидетельствует о позитивном эффекте МСК на восстановление функциональной активности головного мозга в виде значительного увеличения амплитуды ССВП к 14-м суткам эксперимента у большинства животных, с полным восстановлением амплитуд к 21-м суткам.
Полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют о том, что моделирование локального повреждения головного мозга, обусловленного нарушением венозного кровотока, ассоциируется с изменением электрофизиологической активности головного мозга у экспериментальных животных. Динамика ССВП при самопроизвольном восстановлении и на фоне трансплантации МСК существенно различалась, что свидетельствует, с одной стороны, о невысокой скорости естественного восстановления функционального состояния коры головного мозга в данной модели, а с другой стороны – об эффективности клеточной терапии в коррекции функциональной активности головного мозга при очаговых поражениях. Вышесказанное убеждает в перспективности использования ССВП с целью оценки эффективности клеточной терапии.
Влияние МСК на характер морфологических изменений в модели очагового повреждения головного мозга, индуцированного нарушением венозного кровотока Для оценки возможного уровня позитивности механизма МСК на восстановление неврологического дефицита при модельных нарушениях венозного кровотока проведен сравнительный анализ морфологических изменений поврежденного головного мозга в случаях с самопроизвольным его восстановлением (контроль) и с восстановлением, обусловленным трансплантацией МСК.
Согласно данным литературы, механизмы действия трансплантируемых МСК связывают в первую очередь с их паракринными эффектами, направленными на стимуляцию ангио- и нейрогенеза, предупреждение гибели нервных клеток и подавление воспаления [224]. Поэтому морфологические исследования были нацелены на анализ показателей, прямо или косвенно характеризующих эти процессы. В частности, оценивалась объемная плотность формирующихся кровеносных капилляров – как характеристика ангиогенеза, соотношение площади среза кровеносных капилляров к площади среза вен – как косвенный признак деструктивного отека и проницаемости сосудов. При исследовании цитоархитектоники производили подсчет волокнистых астроцитов, фибробластов и макрофагов (характеризующих воспалительный и репаративный процессы). Изменения головного мозга на 7-е сутки исследования.
Макроскопически: отмечается незначительное пролабирование мозгового вещества в трепанационный дефект.
Микроскопически: в очаге повреждения наблюдается макрофагальная реакция с элиминацией продуктов распада, пролиферация фибробластов, формирование рыхлой соединительной ткани, увеличение астроцитарной глии, внедрение сосудов из демаркационной зоны (рисунок 28).
Макрофагальная реакция и начало организации зоны повреждения: а – элиминация продуктов распада макрофагами; б – формирования рыхлой соединительной ткани с пролиферацией сосудов. Окрашено гематоксилин-эозином. Увеличение 200.
Объемная плотность кровеносных капилляров в площади среза в группе с внутривенным введением МСК на 1-е сутки с момента поражения мозга составляла 24,50 ± 2,70 и достоверно превышала таковую у крыс контрольной группы № 1 серии S2 (16,30 ± 1,40). Объемная плотность кровеносных капилляров в группе с местным введением клеток в очаг поражения мозга на 1-е сутки составляла 19,50 ± 0,30 и также превышала соответствующий показатель в группе контроля. При этом анализируемый показатель в группе с внутривенным введением МСК был достоверно выше (p 0,05), чем при локальном введении клеток в эти же сроки.
Отношение площади среза кровеносных капилляров к площади среза вен (индекс К/В) в группе контроля № 1 серии S2 составило 0,72 ± 0,19, тогда как в группе № 3 с внутривенным введением МСК на 1-е сутки данный показатель был в практически в 2, 5 раза выше и составлял 1,78 ± 0,67 (p 0,05). В то же время введение МСК в зону повреждения головного мозга у животных группы № 5 серии S2 не приводило к возрастанию индекса К/В: данный показатель оставался на уровне контрольной группы – 0,66 ± 0,19. Абсолютное и относительное количества клеточных элементов демаркационной зоны (на границе с инфарктом) при разных способах введения МСК представлены в таблице 8.
![Нарушения микроциркуляции и регионарного кровотока у пациентов с онихомикозом и болезнью Рейно, методика коррекции [Электронный ресурс]](/i/i/4269/183972.png "Нарушения микроциркуляции и регионарного кровотока у пациентов с онихомикозом и болезнью Рейно, методика коррекции [Электронный ресурс] Кузнецов Алексей Владимирович")
