Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13 стр
1.1. Экспериментальные модели ишемических повреждений головного мозга 13 стр
1.2. Основные механизмы ишемического поражения головного мозга 17 стр
1.3. Фармакологическая коррекция мнестических расстройств при ишемическом повреждении мозга 27 стр
1.3.1. Стратегия нейропротекции 27 стр
1.3.2. Нейропептиды - ноотропная
и нейропротективная активность 35 стр
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 45 стр
2.1. Моделирование фотоиндуцированного тромбоза сосудов префронтальной коры 45 стр
2.2. Исследование двигательной активности и исследовательского поведения крыс в автоматизированном «открытом поле» РОДЭО-1 47 стр
2.3. Условный рефлекс пассивного избегания 47 стр
2.4. Изучение поведения крыс в Т-образном лабиринте 48 стр
2.5. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ с ЭД)
2.5.1. Определение содержания моноаминов в ткани мозга 48 стр
2.5.2. Определение содержания нейромедиаторных аминокислот в мозговых структурах 49 стр
2.6. Определение интегральных биохимических показателей сыворотки крови методом лазерной корреляционной спектроскопии 50 стр
2.7. Статистические методы обработки данных 51 стр
ГЛАВА 3. Результаты исследования 52 стр
3.1. Сравнительная оценка нарушений интегративной деятельности ЦНС при очаговом ишемическом повреждении префронтальной и теменной коры головного мозга крыс 52 стр
3.2.Функциональные нарушения, вызванные фототромбозом префронтальной коры головного мозга крыс; коррекция ноопептом. 55 стр
3.3. Нейрохимические нарушения, вызванные фототромбозом префронтальной коры головного мозга крыс; коррекция ноопептом .66 стр
3.4.Влияние одностороннего фототромбоза заднефронтальной коры у крыс на поведение в Т-образном лабиринте; эффекты ноопепта 72 стр
3.5. Аитиамнестическое и нейропротективное действие сверхмалых доз антител к белку S-100 (пропротен-100) на модели фототромбоза префронтальной коры 75 стр
3.6. Сопоставление изменений поведения крыс и интегральных биохимических показателей крови, оцененных методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС), после фототромбоза префронтальной коры; эффекты ноопепта 79 стр
ГЛАВА 4. Заключение 84 стр
Выводы 94 стр
Литература 97 стр
- Экспериментальные модели ишемических повреждений головного мозга
- Моделирование фотоиндуцированного тромбоза сосудов префронтальной коры
- Сравнительная оценка нарушений интегративной деятельности ЦНС при очаговом ишемическом повреждении префронтальной и теменной коры головного мозга крыс
- Нейрохимические нарушения, вызванные фототромбозом префронтальной коры головного мозга крыс; коррекция ноопептом
Введение к работе
Ишемический инсульт (инфаркт мозга) - одна из наиболее тяжелых форм сосудистых поражений мозга, занимающая в России второе место в структуре общей смертности и первое место как причина стойкой утраты трудоспособности (Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я., 2001). Ежегодно в России переносят инсульт более 450000 - 500000 человек (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Высокая заболеваемость, частые неблагоприятные исходы, в том числе летальные, высокий процент инвалидизации трудоспособного населения - все это позволяет считать инсульт проблемой медицинской и социальной значимости.
В последние годы значительно расширился фронт исследований, направленных на изучение патогенеза ишемического поражения головного мозга и поиск фармакологических препаратов, предназначенных для стимуляции регенераторных процессов при данной патологии (Фишер М., Шебитц В., 2001; Оковитый СВ. и др., 2001; Островская Р.У., 2003; Brott Т., Bogousslavsky J., 2000; Kidwell C.S. et al, 2001). Эти исследования имеют не только теоретическое патофизиологическое значение, но и большую практическую значимость для неврологической клиники, поскольку известно, что тромбоз сосудов головного мозга является причиной приблизительно 75% инсультов у человека (Профилактика и лечение инсульта. Рекомендации Европейской инициативной группы по проблеме инсульта, 2001; Де Фританс Г.Р., Богуславский Д., 2001; Гусев Е.И.и др., 2003).
Изучение различных форм ишемического повреждения головного мозга основывается на применении экспериментальных моделей на животных, наиболее близко воспроизводящих клинические аналоги этой формы патологии (Hunter A.J. et al, 1995; Фишер M., Шебитц В., 2001). Различают две категории моделей церебральной ишемии: модели глобальной и локальной ишемии (Мирзоян Р.С, 2000; Lipton Р., 1999). В эксперименте глобальную ишемию моделируют путем окклюзии сонных артерий, снабжающих передний мозг, чаще в сочетании гипотензией (от 5 до 30 минут) и последующей рециркуляцией (Rosemary L., 1997). Этот тип ишемии вызывает гибель нейронов преимущественно «избирательно уязвимых» регионов мозга.
История экспериментального моделирования фокальной ишемии головного мозга насчитывает более 20 лет, когда в 1981 году A. Tamura предложил модель проксимальной окклюзии средней мозговой артерии (СМА) с использованием субтемпоральной краниотомии. При моделировании воспроизводится основной патофизиологический процесс - ишемия мозга в определенном бассейне кровоснабжения. Моделирование фокальной ишемии сводится к прекращению кровотока в определенном сосуде мозга, т.е. его окклюзии. Независимо от способа создания острая артериальная окклюзия приводит к резкому снижению объема мозгового кровотока, причем, если мозговой кровоток ниже Юмл/ЮОг ткани в минуту, развивается церебральный инфаркт с гибелью всех элементов ткани мозга (Nedergaard М., 1988).
В настоящее время предпочтение при выборе экспериментального метода отдается моделям фокальной ишемии, воспроизводящим очаги локального повреждения. Основное требование, предъявляемое к моделям фокальной ишемии, состоит в создании воспроизводимого из опыта в опыт постоянного по локализации и объему ишемического очага, что необходимо для количественной оценки степени повреждения мозга и эффективности использования фармакологических препаратов. Этому требованию отвечает неинвазивный, позволяющий выбрать нужную локализацию, метод фотостимулируемого тромбоза сосудов коры головного мозга (Watson В. et al, 1985), наиболее адекватно воспроизводящий картину клинического ишемического инсульта.
Инсульт сопровождается не только прямым повреждением нервной ткани, но и вторичными повреждениями вследствие отсроченных метаболических и нейрохимических процессов. Для коррекции этих нарушений деятельности ЦНС используются как препараты, непосредственно действующие на мозговой кровоток, так и фармакологические вещества, влияющие на высшие интегративные функции мозга, поскольку нарушение этих функций является ведущим симптомом инфаркта мозга. К таким соединениям относятся прежде всего ноотропы (Воронина Т.А., Середенин СБ., 1998; Островская Р.У. и др., 2002).
Ноотропные вещества, применяемые в настоящее время для лечения когнитивного дефицита, имеют ряд ограничений и недостатков. Родоначальник этой группы - пирацетам недостаточно эффективен, кроме того отсутствуют данные о специфических механизмах его действия. Недостаточность мнестических функций, возникающая на фоне инсультов, сенильных нарушений сосудистого и нейродегенеративного характера, сопровождается выраженными структурными изменениями мозговой ткани. Для лечения этих состояний целесообразно применение препаратов, сочетающих ноотропную активность с нейропротективной. Однако большинство нейропротективных веществ, применяемых в практической медицине (антиоксиданты, блокаторы кальциевых каналов), лишены прямого положительного влияния на мнестические функции.
В настоящее время в России и за рубежом при разработке фармакологических средств компенсации когнитивного дефицита и нарушений памяти большое внимание уделяется эндогенным регуляторам -аминокислотам и коротким нейропептидам, сочетающим антиамнестическую и нейропротективную активность, легко проникающим через ГЭБ и имеющим низкую токсичность (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Островская Р.У. и др., 2002).
В НИИ фармакологии РАМН разработан дизайн коротких пептидов на основе имитации структуры непептидного нейротропного средства. Дизайн дипептидов, облегчающих когнитивные функции, основан на гипотезе о пептидергическом механизме действия пирацетама и о роли олигопептидов, содержащих одну из эндогенных пиролидин-карбоновых аминокислот, пироглютаминовую или пролин, в качестве эндогенных лигандов гипотетических мест связывания пирацетама. Наибольшей активностью среди более 30 ацилпролилсодержащих дипептидов обладает соединение ГВС-111 (этиловый эфир N-фенилацетил-Ь-пролилглицин), получивший название «ноопепт» (Seredenin S.B., Voronina Т.A., Gudasheva Т.A., Ostrovskaya R.U. et al., Patent USA N5,439,930,1995; Патент РФ 2119496 (1998). Использование модели локальной ишемии мозга позволило оценить как функциональные, так и морфологические эффекты ноопепта, свидетельствующие о перспективности использования этого соединения в комплексной патогенетической терапии мнестических нарушений при инсульте.
Все больше привлекает внимание как исследователей фундаментальной науки, так и клиницистов применение малых и сверхмалых доз антител к ряду эндогенных субстанций (структурные белки, опиоиды, пептиды) при проведении комплексной фармакотерапии расстройств функций ЦНС. Принципиально новым направлением регуляторного воздействия на информационные и метаболические процессы в ЦНС является использование антител к белку S100 в сверхмалых дозах (СМД). В серии экспериментальных исследований было выявлено, что антитела к белку S100 в СМД обладают широким спектром психотропной и нейротропной активности, включая нейропротективную и ноотропную (Эпштейн О.И., 2003). В данной работе использован «Пропротен-100» - оригинальный отечественный препарат, представляющий собой потенцированные антитела к мозгоспецифическому белку S100, который является одним из важнейших регуляторов интегративной деятельности мозга и, как другие Са - связывающие белки, участвует в синаптических процессах, что послужило основанием использовать этот препарат при коррекции нарушений поведения, вызванных фототромбозом префронтальной коры головного мозга крыс.
Использование модели локальной ишемии мозга позволило оценить как функциональные, так и морфологические эффекты новых фармакологических средств, свидетельствующие о перспективности использования этих соединений в комплексной патогенетической терапии мнестических нарушений при инсульте.
Своевременное вмешательство в этапы патологического процесса с помощью новых фармакологических форм позволяет оптимизировать лечение больных с инсультами - более продуктивно оказать экстренную помощь, снизить летальность, сократить длительность острого периода, уменьшить инвалидизирующие последствия заболевания.
Целью настоящего исследования являлось изучение функциональных и нейрохимических показателей нарушений поведения при очаговом ишемическом повреждении коры головного мозга крыс различной локализации; патогенетическая терапия мнестических нарушений с помощью фармакологических препаратов, обладающих ноотропными и нейропротективными свойствами.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Используя метод фототромбоза, воспроизвести двустороннее локальное ишемическое повреждение префронтальной и теменной коры головного мозга крысы; сравнить нарушения поведения.
2. При фотохимическом повреждении префронтальной коры изучить изменения содержания биогенных аминов и нейромедиаторных аминокислот в коре и подкорковых структурах мозга.
3. Провести анализ антиамнестического и нейропротективного действия ацилпролилсодержащего дипептида - ноопепта и исследовать роль нейромедиаторов в этих эффектах на модели когнитивного дефицита.
4. Изучить влияние одностороннего фотохимического ишемического повреждения заднефронтальных отделов коры на поведение крыс в Т-образном лабиринте; оценить ноотропный эффект дипептида - ноопепта при таком повреждении.
Исследовать антиамнестические свойства сверхмалых доз антител к белку S100 (пропротен-100) на модели фототромбоза префронтальной коры.
На модели фототромбоза префронтальной коры сопоставить нарушения поведения и изменения интегральных биохимических показателей сыворотки крови; оценить эффекты ноопепта.
Научная новизна. Впервые дана сравнительная характеристика поведенческих расстройств, возникающих при моделировании очага ишемического повреждения в префронтальной, заднефронтальной и теменной областях коры головного мозга крыс. Показаны отличия нарушений поведенческих реакций в зависимости от локализации фотохимического повреждения коры головного мозга животных. Проведена патогенетическая терапия когнитивных расстройств, возникших при экспериментальном ишемическом повреждении префронтальной коры, с помощью нового дипептида - ноопепта, подтверждено его ноотропное и нейропротективное действие. Впервые показано, что использование сверхмалых доз антител к белку S100 (пропротен-100) на модели когнитивного дефицита способствует сохранению памятного следа, нарушенному локальным ишемическим повреждением коры головного мозга.
Впервые экспериментально сопоставлены изменения поведенческих реакций и суммарный показатель содержания в крови животных аутоантител и низкомолекулярных липопротеиновых комплексов, оцененный методом ЛКС, при локальной ишемии префронтальной коры и лечении ноопептом.
Теоретическое и практическое значение работы. Обоснована перспективность модели фотохимического тромбоза для экспериментального воспроизведения ишемического инсульта в разных областях коры головного мозга и изучения поведенческих расстройств, возникающих в зависимости от локализации очага ишемии в коре. При помощи исследования нарушений условного рефлекса пассивного избегания дана характеристика мнестических расстройств в остром периоде экспериментального ишемического инсульта и обоснована необходимость и возможность коррекции нарушений памяти на ранней стадии патологии, в критический период цереброваскулярной катастрофы. Показан лечебный и профилактический эффект ноопепта при нарушениях мозгового кровообращения, ухудшении сохранения выработанного навыка, что свидетельствует о целесообразности применения препарата для лечения инсульта. Установлен нейромодулирующий эффект сверхмалых доз антител к мозгоспецифическому белку S100 (пропротен-100) при ишемическом повреждении коры префронтальной локализации.
Сопоставление динамики восстановления условных рефлексов, нарушенных фототромбозом префронтальной коры, с изменением содержания аутоиммунных и липопротеиновых компонентов сыворотки крови позволяет предположить, что такой подход является перспективным для оценки эффективности лечения при исследовании экспериментального и клинического материала.
Внедрение результатов работы.
На модели фотохимического повреждения префронтальной коры проведено доклиническое испытание ампульной формы дипептида - ноопепта. В эксперименте на животных показана высокая эффективность данного соединения (доза 0,5 мг/кг, внутрибрюшинно) при ишемическом повреждении мнестических функций мозга.
Экспериментально установлено, что сопоставление показателей содержания аутоиммунных и липопротеиновых компонентов сыворотки крови, оцененых методом лазерной корреляционной спектроскопии, с динамикой восстановления мнестических функций, нарушенных ишемическим повреждением коры, может быть перспективным подходом для раннего выявления групп риска и оценки эффективности лечения. Положения, выносимые на защиту.
1. Локальное двустороннее фотохимическое повреждение префронтальной коры приводит к нарушениям условнорефлекторной деятельности животных, тогда как фототромбоз теменной коры не вызывает мнестических расстройств.
Дизрегуляционные нарушения условнорефлекторной деятельности животных при локальном ишемическом повреждении префронтальной коры сопровождаются дисбалансом уровня биогенных аминов и нейромедиаторных аминокислот в структурах мозга.
Дипептид - ноопепт проявляет ноотропное и нейропротективное действие, оказывает модулирующее влияние на уровень биогенных аминов и нейромедиаторных аминокислот в коре и подкорковых структурах мозга.
При фототромбозе префронтальной коры нарушения условно-рефлекторного поведения крыс сопровождаются изменениями интегральных биохимических показателей сыворотки крови. Курсовое введение ноопепта наряду с антиамнестическим эффектом оказывает модулирующее влияние на интегральные биохимические показатели сыворотки крови этих животных.
5. Сверхмалые дозы антител к мозгоспецифическому белку S100 (пропротен- 100) оказывают нейромодулирующее действие при фокальном ишемическом повреждении префронтальной коры головного мозга крыс.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы были доложены на: Международной конференции «Проблемы нейрокибернетики», Ростов-на-Дону, 2002; 3-ей Всероссийской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 2002; Всероссийской конференции «Нейрофармакология в XXI веке», Москва, 2002; Второй всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии», Москва, 2003; 10 Meeting of European Behavioral Pharmacology Society (EBPS) Meeting, Antverpen, Belgium, 2003; Всероссийской конференции «Основные общепатологические и клинические закономерности развития критических, терминальных и постреанимационных состояний», Москва, 2003; III Конференции молодых ученых России с Международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; 8th Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry «Stress and Behaviour», St. Petersburg, Russia, 2004; 8 Congress of the European Federation of Neurological Societies, Paris, France, 2004.
Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 94 отечественных и 104 иностранных источника. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 19 рисунков.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 5-ти статьях и 10-ти тезисах.
Экспериментальные модели ишемических повреждений головного мозга
Ишемия головного мозга - одна из наиболее распространенных форм патологии центральной нервной системы (ЦНС) в современной неврологии и нейрохирургии. Эта патология может проявляться либо как самостоятельное заболевание (инфаркт мозга), либо как осложнение при травме мозга и нейрохирургических операциях. Сосудистые поражения мозга не ограничиваются только острыми нарушениями мозгового кровообращения, но одновременно являются причиной постепенного нарастания неврологических и психических расстройств, вплоть до сосудистой деменции (Гусев Е.И. и др., 1982; Калашникова Л.А., 1988; Верещагин Н.В. и др., 1997). Хроническая сосудистая мозговая недостаточность представляет собой проградиентный патологический процесс, в основе которого лежит нарастающее несоответствие между кровоснабжением головного мозга и потребностями обмена веществ, что в 2-3 раза увеличивает риск инсульта (Манвелов Л.С., 2000). Поэтому проведение лечебных мероприятий, направленных на предупреждение возникновения мозгового инсульта является назревшей медико-социальной проблемой.
Изучение патофизиологических и патохимических механизмов, индуцированных ишемией головного мозга и лежащих в основе повреждения вещества головного мозга и развития неврологического дефицита, имеет как теоретический интерес, так и практическую значимость, определяя новые направления профилактики и патогенетической терапии ишемических поражений головного мозга. 1.1. Экспериментальные модели ишемических повреждений головного мозга.
Для изучения патофизиологических механизмов мнестических расстройств при ишемической патологии мозга и разработке методов эффективной патогенетической терапии необходимо моделирование когнитивных нарушений в эксперименте на животных. Для достижения этой цели была выбрана префронтальная кора.
Фронтальная кора головного мозга, являясь неоднородной по своей структуре и функции, выполняет важную роль в организации сложных форм поведения (Анохин П.К., 1949; Светухина В.М., 1962; Лурия А.Р., 1970; Рябинская Е.А., 1978; Kolb В., 1984). Префронтальные отделы коры головного мозга человека являются ключевыми в осуществлении когнитивных функций. Синдром поражения передних отделов коры А.Р. Лурия (1966, 1974) определил как нарушение программирования произвольных движений, расстройство механизма самоконтроля за своими действиями, нарушение сложных форм мнестической деятельности.
Фронтальная кора крысы по классификации Krettek J.L., Price J.L. (1977) делится на четыре области: 1) прецентральную, 2) прелимбическую ростральную, 3) орбитальную и 4) агранулярную инсулярную. Kolb В. (1984) сгруппировал области коры, описанные предыдущими авторами, в три зоны: 1) медиальную фронтальную, 2) вентральную фронтальную и 3) префронтальную (Frl и Fr2) в соответствии с атласом Paxinos G. and Watson С. (1986).
Префронтальная кора является одной из основных структур, участвующих в осуществлении пространственной ориентации и вместе с гиппокампом играет ключевую роль в процессах обучения и памяти (Kolb В., 1982; Sutherland R., et al., 1982; Романова Г.А., Трофимов С.С., 1986; Романова Г.А. с соавт., 1994; 1998). Удаление лобных отделов коры мозга у животных приводит к нарушению как кратковременной, так и долговременной памяти, расстройствам цепи сложных поведенческих реакций.
Применение ауторадиографического метода (Krettek J.E., Price J.L., 1977) позволило выявить морфологические связи фронтальной коры. Эфферентные связи фронтальной коры представлены следующим образом: 1) кортикальные эфференты (к задней цингулярнои, ретросплениальнои, энторинальнои, пириформной коре), 2) эфференты к полосатому телу (эта группа волокон является глутаматергической и влияет на нигростриальные дофаминергические нейроны), 3) эфференты к таламусу, 4) к мозговому стволу.
Выявлены аксоны, проецирующиеся от каждой из трех частей медиодорзального таламического ядра (медиальной, латеральной, центральной), а также от антеро- и вентромедиальных таламических ядер к фронтальной коре крыс. Помимо таламокортикальных проекций, существенное значение имеют специфические ДА-ергические неталамические афференты из амигдалы, прилежащей пириформной коры, из черной субстанции и вентрального тегментума.
Неспецифические афференты к фронтальной коре включают в себя серотонинергические проекции от дорсального и центрального ядер шва, норадренергические - от синего пятна, холинергические - от базального переднего мозга, а также волокна от латерального гипоталамуса и некоторых ядер таламуса (Seguela P., Kennet С, 1988). Эти данные указывают на морфологическую дифференциацию и организацию внешних связей фронтальных отделов коры головного мозга крысы.
Для изучения патогенеза ишемического поражения головного мозга и тестирования новых соединений большое значение имеет адекватность и воспроизводимость используемых экспериментальных моделей. В своей монографии Lipton Р. (1999) выделяет 3 основные модели глобальной ишемии: переднемозговая ишемия путем двухсторонней окклюзии сонных артерий, модель переднемозговой ишемии путем 4-х сосудистой окклюзии и модель 2-х сосудистой ишемии на песчанках. Для усиления патологических изменений в головном мозге окклюзию сонных артерий сочетают с гипотонией путем кровопускания или фармакологического воздействия (ганглиоблокаторы).
В клинике наиболее часто встречаются локальные нарушения мозгового кровообращения. Типичная локализация ишемического инсульта - бассейн средней мозговой артерии (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Чехонин В.П. и др., 2004). В эксперименте окклюзия средней мозговой артерии может быть осуществлена в результате экстравазального (перевязка, коагуляция, микроклипсирование сосудов) и интравазального (фототромбоз, эмболия, введение капроновой нити) подходов. Одной из наиболее распространенных моделей ишемии мозга является ишемия, вызванная перевязкой средней мозговой артерии у крыс (Мирзоян Р.С., 2000; Robinson R.G.,1998).
В обзоре Hossmann К.-А. (1998) предлагает классификацию наиболее распространенных моделей окклюзии средней мозговой артерии: трансорбитальный, транскраниальный подход, интралюминальная окклюзия, эмболизация кровяным сгустком, микросферами. Определенным недостатком этих моделей является техническая сложность их воспроизведения, вариабельность объема очага ишемического повреждения, что затрудняет морфометрические исследования и не позволяет достоверно количественно определить эффективность фармакологических препаратов, используемых в качестве нейропротекторов.
Моделирование фотоиндуцированного тромбоза сосудов префронтальной коры
Работа выполнена на 380 нелинейных крысах-самцах, весом 200-250 г. Животные содержались в виварии при свободном доступе к пище и воде и естественной смене дня и ночи.
В экспериментах использовались следующие вещества: 3% хлоралгидрат (300 мг/кг, внутрибрюшинно для наркотизации крыс); 3% раствор фоточувствительного красителя Bengal Rose (Sigma, cat.№ 4507); препараты:
ГВС-111 (этиловый эфир !ч[-фенилацетил-Ь-пролилглицина) - ноопепт, синтезированный в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН; сверхмалые дозы антител к белку S-100 (пропротен - 100), предоставленный научно-производственной фирмой «Материа Медика Холдинг», Москва. 2.1. Моделирование фотоиндуцированного тромбоза сосудов префронтальной коры
Для воспроизведения двустороннего фотохимического повреждения коры головного мозга крысы, голову животного, находившегося под наркозом (хлоралгидрат 3%, 300 мг/кг внутрибрюшинно), фиксировали в головодержателе стереотаксического прибора фирмы «Медикор» (Венгрия). Кожу головы выбривали и обрабатывали 2% раствором йода. Скальпелем производили срединный продольный разрез кожи, раздвигали ее и отсепаровывали надкостницу.
Двусторонний фокальный ишемический очаг в префронтальной (поля Frl и Fr2) и теменной (Par 1), коре головного мозга крыс, а также односторонний в заднефронтальной (Fr3) коре по атласу G. Paxinos and С. Watson (1986) создавали методом фотохимического тромбоза, (B.D. Watson at al. 1985) в модификации Викторова И.В. (1991). Перед операцией наркотизированным животным вводили внутривенно в v.jugularis 3% раствор фоточувствительного красителя Bengal Rose в дозе 40 мг/кг. Для воспроизведения фотоиндуцированного тромбоза использовали оригинальную установку, состоящую из галогеновой лампы (25V, 250W), от которой с помощью волоконного световода с оптическим отверстием Змм луч света (560 nm) подводили к поверхности интактного черепа на расстоянии 1-2 мм. Время световой экспозиции составляло 17 минут с каждой стороны (Романова Г.А., 2001). В результате взаимодействия флюоресцентного красителя со световым лучом выделяется свободный кислород, который повреждает эндотелий сосудов, что ведет к адгезии и агрегации тромбоцитов, образованию тромбов и нарушению локального кровотока. Для предупреждения термокоагуляционного эффекта галогеновую лампу охлаждали с помощью вмонтированного в установку вентилятора, а поверхность черепа во время экспозиции охлаждали дистиллированной водой. Контрольные измерения температуры проводились в области светового пучка и per rectum. Температура в области светового пучка не превышала 37,0 С, а температура тела животного колебалась от 36,8С до 37,6С. После операции рану обрабатывали сухой калийной солью пенициллина, кожу ушивали, шов обрабатывали 2% раствором йода. Ложная операция производилась по той же схеме, за исключением внутривенного введения красителя Bengal Rose.
Для изучения патоморфологических изменений нейронов при фокальной ишемии, экспериментальных животных под хлоралгидратным наркозом транскардиально перфузировали модифицированным фиксатором Беллесницкого - Лилли (Лилли Р., 1969) смесью формалин-спирт-уксусная кислота ФУ С в пропорции 2: 7: 1. Мозг крыс извлекали из черепа и подвергали морфологическому исследованию. Парафиновые срезы головного мозга крыс окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля и гематоксилин-эозином.
Морфометрические измерения объема фокального ишемического очага проводили на сериальных срезах мозга, окрашенных 0,2% метиленовым синим, с помощью прибора для полуавтоматического анализа изображения АСМ-Лейтц. Объем очага ишемического повреждения определяли по формуле (инструкция Bildanalyse System-LEITZ-A.S.M.): а- коэффициент фотоувеличения; d-толщина среза; Sn-сумма площадей ишемических очагов на сериальных срезах.
Оценку основных статистических показателей (средней арифметической, стандартного отклонения и др.) проводили с использованием компьютерной программы STAT.BAS. поведения крыс в автоматизированном «открытом поле»
Координацию движений животных оценивали визуально. Состояние мышечного тонуса исследовали в тесте вращающегося стержня (диаметр 3 см; скорость вращения 1 об/мин). Каждому животному предоставлялось по три попытки. Состояние ориентировочно-исследовательской активности животных изучали, помещая крысу на 5 мин. в камеру электронно - оптического регистратора оценки движений РОДЕО-1 (МПО «Экран» МЗ СССР; 46x46x19 см), где проводилась автоматическая цифровая оценка (количество пересечений световых лучей в закрытой камере) поведения подопытного животного -горизонтальной, вертикальной и исследовательской активности. До повреждения префронтальной коры экспериментальные группы животных значимо не различались.
УРПИ вырабатывали сразу после тестирования в «открытом поле» (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д., 1991), оценивая латентный период (ЛП) перехода крысы из светлого в темный отсек челночной камеры Биотест РК-5201. В первый день обучения крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощностью 100Вт), обследовав который, она через несколько секунд переходила в темный, после чего дверцу в этот отсек камеры закрывали и оставляли там крысу в течении 300 сек. Через 1 час процедуру повторяли, но крысу сразу после перехода извлекали из темного отсека. На следующий день эту же процедуру повторяли дважды с часовым перерывом. При повторном заходе животного в темный отсек камеры дверцу в него закрывали и через металлические прутья пола пропускали электрический ток (1,0 мА, 50 Гц, 5 сек). УРПИ считали выработанным, если латентный период пассивного избегания составлял 300 сек и больше, животных с меньшими показателями исключали из эксперимента.
Сравнительная оценка нарушений интегративной деятельности ЦНС при очаговом ишемическом повреждении префронтальной и теменной коры головного мозга крыс
Целью данного раздела исследования было сравнить изменения поведения 2-х групп крыс: с двусторонним локальным ишемическим повреждением префронтальной и теменной коры. Повреждение последней рассматривается как функциональный контроль избирательности нарушения когнитивных функций мозга при повреждении префронтальных отделов.
Условно-рефлекторное поведение животных оценивали по показателям латентного периода условного рефлекса пассивного избегания (ЛП УРПИ) до ишемического повреждения и через 9 суток после двустороннего фототромбоза как префронтальной, так и теменной областей коры. Анализ изменений двигательной активности крыс проводили по тесту «открытое поле» в автоматизированной установке РОДЭО-1. Контролем служили ложнооперированные животные. Локальный очаг ишемического повреждения воспроизводили в зонах Frl, Fr2 и Pari, соответствующих префронтальной и теменной областям (рис.5). Полученные результаты показали, что двустороннее ишемическое повреждение префронтальной коры приводит к существенному нарушению сохранения следов памяти, что выражалось в достоверном снижении ЛП УРПИ на 9-е сутки после ишемизации по сравнению с дооперационным уровнем (ЛП=106,6±26,7с против 300,0с; Р 0,001, таб.1). У ложнооперированных животных заметных изменений этого показателя в те же сроки не наблюдалось. Фототромбоз теменной коры не нарушал сохранения УРПИ, выработанного до операции. ЛП УРПИ на 9-ые сутки после ишемического повреждения теменной коры значимо не отличался от дооперационного уровня и составил 280,1±8,7 сек против 300,0 сек (Р 0,1). Это свидетельствует о том, что повреждение теменной области коры не влияет на сохранение и воспроизведение выработанного до фототромбоза УРПИ. Исследование двигательной активности животных тех же групп проводили в автоматизированном «открытом поле» РОДЭО-1. До ишемического повреждения коры экспериментальные группы животных по показателям горизонтальной двигательной активности (количество пересечений световых лучей по уровню горизонтального движения) значимо не различались. Во всех экспериментальных группах на 9-ые сутки после операции не было существенных изменений массы тела, мышечного тонуса и координации движений. Снижение горизонтальной двигательной активности (ГА) как в ложнооперированной, так и в ишемизированной группах на 9-ые сутки после фототромбоза префронтальной коры по сравнению с исходными показателями не было статистически значимо (таб.2). Двустороннее фотохимическое повреждение теменной коры мозга крыс напротив сопровождалось выраженным (65,7±7,4 против 202,6 ±17,8; Р 0,001) снижением двигательной активности в тесте «открытое поле» по сравнению с её исходным уровнем у этих животных и достоверно отличалось от этого показателя у ложнооперированных и в группе с фототромбозом префронтальной коры. коры. Таким образом, двустороннее очаговое фотохимическое повреждение теменной коры, не влияя на сохранение и воспроизведение памятного следа, значительно нарушает моторную функцию. Исходя из результатов можно заключить, что двустороннее очаговое фотохимическое повреждение префронтальной коры крыс можно рассматривать как экспериментальную модель ишемического инсульта, позволяющую исследовать механизмы избирательного нарушения когнитивных функций мозга. Целью данного исследования было сопоставление нарушений поведенческих реакций животных и развития деструктивных изменений в ишемическом очаге; коррекция этих повреждений с помощью нового ноотропа-(этилового эфира КГ-фенилацетил-Ь-пролилглицина)-ноопепта, пептидного аналога пирацетама.
До начала эксперимента исследовали двигательную активность крыс в тесте «открытое поле». Достоверных отличий этого показателя в разных экспериментальных группах не выявлено, что свидетельствует о гомогенности экспериментального материала.
Выполнено три серии экспериментов. В 1-ой серии (рис.6, схема эксперимента 1) начинали с выработки УРПИ, затем проводили операцию фототромбоза префронтальной коры. Перед операцией УРПИ считали выработанным, если крыса в течение 300 сек не уходила из освещенного отсека камеры в темный. Сохранение УРПИ исследовали до и на 9-ые сутки после тромботизации префронтальной коры. Животные были разделены на 5 групп: 1-ложнооперированные, получавшие изотонический раствор (п=13), 2-ишемизированные + изотонический раствор (п=10), 3- ишемизированные, получавшие ноопепт (0,5 мг/кг/день) (п=12), 4-ложноооперированные + ноопепт (0,5 мг/кг/день) (п=12) и 5-фототромбоз+пирацетам (п=10).
Нейрохимические нарушения, вызванные фототромбозом префронтальной коры головного мозга крыс; коррекция ноопептом
На модели двустороннего фотохимического ишемического повреждения префронтальной коры головного мозга крыс исследовали роль биогенных аминов и нейромедиаторных аминокислот в механизмах нарушения и восстановления условно-рефлекторной деятельности животных после ишемического повреждения префронтальной коры. Коррекцию возникших нарушений проводили с помощью ноопепта.
Двусторонние очаги ишемического повреждения префронтальной коры создавали по описанной выше методике. Оценку состояния двигательной активности и воспроизведения УРПИ проводили на 9-ый день после фототромбоза префронтальной коры. Контролем служили ложнооперированные животные, которым вводили NaCl 0,9%. Проведены две серии экспериментов. В 1-ой серии проводили исследование изменения уровня моноаминов (МА) и их метаболитов в структурах мозга крыс в постишемическом периоде на 9-ый день после фототромбоза префронтальной коры, сравнивая эти показатели с уровнем МА у животных с таким же повреждением коры и системным введением ноопепта.
Экспериментальные животные были разделены на три группы: 1-ложная операция+0,9%КаС1; 2-фототромбоз коры+0,9% NaCl; 3-фототромбоз+ноопепт.
Ампульный ноопепт в дозе 0,5 мг/кг/день вводили внутрибрюшинно в течение 9-ти дней после фототромбоза коры. Изотонический раствор вводили по той же схеме. На 9-ый день крыс декапитировали и выделяли структуры мозга для биохимического исследования. Содержание дофамина (ДА), 5-окситриптамина (5-ОТ), диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) определяли в префронтальной коре, гиппокампе и гипоталамусе, структурах, участвующих в организации интегративной деятельности мозга, методом ВЭЖХ с ЭД (Кудрин B.C. и др., 1995).
Проведенный анализ показал значительные изменения содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс на 9-ый день после фототромбоза префронтальной коры по сравнению с их уровнем у контрольных ложнооперированных животных (таблица 4). Наибольшие изменения отмечены в префронтальной коре, где был создан очаг ишемии: на 20,1% снизился уровень ДА по отношению к контролю, принятому за 100%. При этом на 50,2% возрос уровень ГВК и на 15,4% увеличился оборот ДОФУК/ДА, что указывает на активацию дофаминэргической системы в очаге ишемического повреждения. Содержание 5-ОТ в этой структуре снизилось на 30,5%, а оборот 5-ОИУК/5-ОТ- на 20,7%.
В гиппокампе после локального ишемического повреждения префронтальной коры имелась тенденция к снижению уровня 5-ОТ (на 21,4%), 5-ОИУК (на19,4%) и оборота 50ИУК/5-ОТ (на 19,2%), а также ДА (на 23,2%), и ДОФУК (на 18,9%о). В гипоталамусе снизился уровень ДОФУК (на 37%, Р 0,05), оборот ДОФУК/ДА на 32%, Р 0,05), снижение уровня серотонина и его метаболитов, а также ДА носило характер тенденции.
Таким образом, фототромбоз префронтальной коры вызвал значительные изменения содержания моноаминов как в очаге ишемии, так и в подкорковых структурах, что может быть одной из причин нарушения условно-рефлекторной деятельности этих животных, т.е. амнезии. Эффекты ноопепта при его курсовом введении в течение 9-ти дней после фототромбоза были наиболее выражены в префронтальной коре. Так, значительно повысился уровень ДА, ДОФУК (на 79±7,9% и 73±8,1% соответственно), оборот 5-ОИУК/5-ОТ возрос на 40±6,7% по сравнению с нелеченной группой (Р 0,05). В гиппокампе отмечено достоверное возрастание уровня дофамина на 110±12,1% (Р 0,01) по сравнению с нелеченной ишемизированнои группой животных. В гипоталамусе при введении ноопепта животным с фототромбозом префронтальной коры на 57±4,5% (Р 0,01) повысился уровень ДОФУК и на 43±5,6% (Р 0,01) увеличился оборот ДОФУК/ДА по сравнению с нелеченной группой.
