Введение к работе
Актуальность темы. Возрастная макулярная дистрофия (ВМД) занимает лидирующее положение в мире среди заболеваний, ведущих к стойкому снижению зрения и слепоте (Егоров Е.А., 2006). Её выраженные проявления в разной степени присутствуют более чем у 50% европейцев старше 65 лет (Акопян B.C., 2004). Заболеваемость ВМД растет на фоне увеличения продолжительности жизни. В России, по разным данным, ВМД страдает от 14 до 46 % населения этой возрастной группы. Ситуация осложняется несвоевременной постановкой диагноза и тенденцией к омоложению заболевания, что ведет к инвалидизации трудоспособного населения. Патогенез ВМД до конца не ясен, эффективных способов лечения нет, что обусловлено неполнотой знаний механизмов развития заболевания - комплексного и многофакторного, как и сам процесс старения (Cook Н. et al., 2008).
Патогенез ВМД связан с гипоксией и воспалением. Их мишенью становятся пигментный эпителий сетчатки, мембрана Бруха и сосуды хориоидеи. В качестве основного повреждающего звена выступает окислительный стресс - нарушение баланса между генерацией и детоксикацией активных форм кислорода (АФК), его следствием - отек, отслойка пигментного и нейроэпителия, кровоизлияния, неоваскуляризация, потеря зрения. Неоваскуляризацию в условиях гипоксии в тканях внутренних оболочек глаза больных ВМД провоцирует фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial grows factor - VEGF). Он экспрессируется в клетках пигментного эпителия и в физиологических условиях обеспечивает жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов (Lau L., 2007, Ding X., 2008). Атрофия клеток пигментного эпителия и недостаточная экспрессия гена и синтеза белка VEGF ведут к атрофии хориокапилляров и развитию атрофической формы ВМД (Grisanti S., Tatar О., 2008). Ингибиторы VEGF снижают неоваскуляризацию, их всё шире используют в лечении ВМД, однако механизм участия этого фактора в патогенезе заболевания остаётся до конца не выясненным.
Окислительный стресс, с одной стороны, сопровождает возрастные изменения, с другой - становится их причиной. Несмотря на значительное количество работ, доказывающих связь с ним патогенеза ВМД, конкретные механизмы развития окислительного стресса в процессе старения организма и непосредственно тканей глаза до конца не ясны. Тем не менее количество антиоксидантов, используемых в профилактике и лечении ВМД, постоянно растет. Объективная оценка их эффективности в профилактике любых возрастных изменений у людей затруднена различиями в базовой обеспеченности антиоксидантами и индивидуальными темпами старения, обусловленными как генетическими, так и социальными детерминантами. Недавно появился принципиально новый класс антиоксидантов, способных проникать и накапливаться в митохондриях - основном источнике АФК в соматических клетках.
Впервые адресную доставку в митохондрии антиоксиданта mitoQ - комплекса убихинона (CoQ) и проникающего катиона трифосфония - осуществили М.Р. Murphy et al. (Murphy M.P., 2001; Kelso G.F., 2002). Ещё более эффективным соединением этого класса оказался созданный в России SkQl - кати-онный аналог хинона, составленный из пластохинона, проникающего катиона и деканового линкера (Скулачев В.П., 2007). Комплексные исследования показали, что SkQl является мощным антиоксидантом многократного действия, поскольку легко восстанавливается в дыхательной цепи митохондрий (Скулачев В.П. и др., 2008; Antonenko Y.N. et al, 2008). Обсуждаются большие потенциальные возможности применения митохондриально направленных антиок-сидантов в терапии заболеваний, патогенез которых связан с окислительным стрессом (Cocheme Н.М., 2007), однако их внедрение невозможно без проведения всесторонних фундаментальных исследований.
Один из подходов к выяснению этиологии и патогенеза, к разработке способов терапии - создание биологических моделей социально значимых заболеваний человека. Дистрофию сетчатки моделируют воздействием физических факторов либо используют генетические модели: животных трансгенных, с нокаутом генов или с определенными мутациями (Ding Н., 2008). По характеру изменений и механизму развития они не могут быть строго отнесены к моделям ВМД, т. к. воспроизводят, как правило, одну из стадий заболевания, но не дают комплексной картины его развития. У людей ВМД развивается на фоне множественных проявлений старения, возраст манифестации которых различается, затрудняя отделение причин от эффектов старения.
Существует три основных критерия соответствия модели тому или иному заболеванию: адекватность клинических проявлений, изменений на морфологическом уровне и реакция на стандартную терапию (Swanson K.S., 2004). По характеру морфологической и электронно-микроскопической картины близки развивающимся при ВМД у пожилых людей изменения глазного дна преждевременно стареющих мышей SAM (Р8), появляющиеся у них к возрасту 10-12 мес. (Maji А.В., 2000). Сегодня эта линия - единственная общепризнанная модель преждевременного старения, однако клиническая картина изменений тканей глазного дна у них не исследовалась.
Исследования последних лет показали, что комплексное проявление фе-нотипических признаков преждевременного старения характерно и для крыс линии OXYS, созданной в ИЦиГ СО РАН селекцией крыс Wistar по признаку ранней катаракты. В пяти первых поколениях её развитие провоцировали обогащенной галактозой диетой (Соловьева Н.А., 1975). В дальнейшем отбор шёл по ранней спонтанной катаракте, сцеплено с которой животные унаследовали синдромом преждевременного старения. Его проявлениями становятся сниженная по сравнению с исходной линией крыс Wistar продолжительность жизни и раннее развитие возраст-зависимых заболеваний на фоне ранней ин-
волгоции тимуса и снижения активности Т-клеточного звена иммунной системы (Колосова Н.Г., 2001, 2003, 2008; Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000; Маркова Е.В., 2003, Bobko A. et al, 2005; Kolosova N.G., 2006). Состояние линии по-прежнему контролируется по признаку ранней спонтанной катаракты, однако до настоящего времени анализ клинической картины возрастных изменений хрусталиков крыс линии OXYS не проводился. Наши предварительные исследования показали, что наряду с катарактой у крыс линии OXYS развиваются клинические проявления хориоретинальной дистрофии (ХРД), аналогичные наблюдаемым при ВМД у людей. Выяснение механизмов развития у крыс линии OXYS патологических изменений сетчатки как одного из проявлений преждевременного старения, обоснование соответствия линии критериям модели ВМД, пригодной для изучения молекулярно-генетических основ формирования этого заболевания и оценки эффективности терапевтических воздействий, представляются актуальными как для фундаментальной медико-биологической науки, так и для практической медицины.
Цель исследования: изучить особенности развития ХРД у преждевременно стареющих крыс линии OXYS, оценить профилактический и терапевтический потенциал митохондриально направленного антиоксиданта SkQl.
Задачи исследования:
Охарактеризовать клинические особенности развития патологических изменений сетчатки и хрусталиков у крыс линии OXYS.
Провести морфологическое исследование особенностей развития ХРД у крыс линии OXYS.
Изучить уровень экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в тканях внутренней оболочки глаз крыс линии OXYS на разных стадиях развития ХРД.
Установить связь развития катаракты и ХРД у крыс линии OXYS с окислительным стрессом и оценить возможность воздействия на их течение препаратов со свойствами антиоксидантов.
Изучить влияние митохондриального антиоксиданта SkQl на развитие ХРД и катаракты у крыс линии OXYS и связь его эффектов с влиянием на экспрессию гена VEGF в хориоретинальном комплексе и альфа-кристалли-нов в хрусталиках.
Научная новизна исследования. Впервые показано, что у преждевременно стареющих крыс линии OXYS параллельно с катарактой развивается ХРД, по клиническим и морфологическим проявлениям соответствующая ВМД у людей, что позволяет рассматривать эту линию как адекватную модель этого заболевания. Установлено, что в основе патогенеза ХРД у крыс линии OXYS лежат склеротические повреждения сосудов хориоидеи, нарушение кровотока в них и деструкция пигментного эпителия, которые приводят к ишемии и повреждению нейросенсорных клеток.
Показано, что развитие ХРД у крыс линии OXYS связано с изменениями уровня экспрессии гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс линии OXYS: его снижением на ранних стадиях заболевания, влияющим на тяжесть поражения сетчатки, и ростом в период формирования выраженных патологических изменений, когда между экспрессией гена VEGF и тяжестью поражения сетчатки устанавливается положительная связь.
Установлено, что окислительный стресс, выступая в качестве патогенетического фактора развития ХРД и катаракты, не лежит в основе их этиологии у крыс линии OXYS: он характерен для развитых стадий заболевания.
Впервые выявлен высокий терапевтический потенциал митохондри-ального антиоксиданта SkQl - пластохинон-децил-трифосфония: его способность при профилактическом приеме с кормом или в виде капель полностью предупреждать развитие катаракты и ХРД у крыс линии OXYS и снижать выраженность патологических изменений хрусталиков и сетчатки. Отработаны способы введения и оптимальная эффективная доза SkQl для профилактики и лечения дистрофических изменений хрусталиков и сетчатки у крыс линии OXYS
Показано, что в основе эффектов SkQl лежит нормализация кровотока в сосудах хориоидеи, восстановление функций пигментного эпителия, которые на молекулярном уровне связаны с нормализацией уровня экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в хориоретинальном комплексе. Антикатарактальный эффект SkQl связан с его способностью повышать экспрессию основных белков хрусталиков а-кристаллинов.
Научно-практическая значимость работы. Научно-практическая ценность работы определяется доказательством соответствия линии преждевременно стареющих крыс OXYS критериям модели катаракты и ВМД. Это открывает уникальные возможности в использовании этих животных для исследования этиологии и патогенеза анализируемых заболеваний, в том числе на ранних доклинических стадиях развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий. Использование крыс линии OXYS позволило выявить новое свойство препарата офтан-катахром («Сантен», Финляндия) - его эффективность в профилактике ВМД, усовершенствовать рецептуру БАД «Окулист» (ОАО «Диод»). Высокая эффективность использования модели для оценки терапевтического потенциала новых препаратов продемонстрирована на примере митохондриального антиоксиданта SkQl («Центр митоинженерии МГУ»). Установлена перспективность создания лекарственных препаратов на основе SkQl для профилактики и лечения катаракты и ВМД. Результаты исследования легли в основу создания ветеринарного препарата, эффективность которого подтверждена в испытаниях на домашних животных.
Положения, выносимые на защиту:
Развитие у крыс линии OXYS ХРД по клиническим и морфологическим проявлениям соответствует возрастной макулярной дистрофии у людей, развивается параллельно с формированием катаракты и является одним из проявлений преждевременного старения.
В основе патогенеза ХРД у крыс линии OXYS лежат склеротические повреждения сосудов хориоидеи, нарушение кровотока в них, деструкция пигментного эпителия, изменения уровня экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в хориоретинальном комплексе: снижение экспрессии на ранних стадиях и повышение по мере прогрессирования заболевания.
Митохондриальный антиоксидант SkQl обладает высоким профилактическим и лечебным потенциалом в отношении катаракты и ВМД, его эффекты связаны с нормализацией кровотока, восстановлением пигментного эпителия и экспрессии генов: VEGF в хориоретинальном комплексе и а-крис-таллинов в хрусталиках.
Использование линии преждевременно стареющих крыс OXYS позволяет получать более объективную оценку эффективности новых способов лечения и профилактики катаракты и ХРД.
Апробация материалов диссертации. Результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health» (Смоленск, 2003); межрегиональной конференции офтальмологов (Красноярск, 2003), научно-практической конференции «Пептидные биорегуляторы в офтальмологии» (Москва, 2005); школе офтальмологов «Диагностика и современные методы лечения дистрофических заболеваний глазного дна» (Новосибирск, 2006); V Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2005); 3 International Conference «Basic science for medicine» (Новосибирск, 2007); XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2007); 5-й национальной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007); 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007); конгрессе «Человек и лекарство. Урал-2007» (Тюмень, 2007); 7th Joint Meeting of AFERP, ASP, GA, PSE & SIF Athenaeum Intercontinental (Greece, Athens,2008); I научно-практической конференции «Ионы Скулачева» (Москва, 2007); III Всероссийском семинаре научного общества офтальмологов России «Макула-2008» (Ростов-на-Дону, 2008); научно-практической конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молеку-
лярных биологов (Новосибирск, 2008); 6th European Congress of Biogerontology -Ageing and individual life history (Netherlands, Noordwijkerhout, 2008); II международной конференции «Ионы Скулачева» (Суздаль, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 8 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.
Объём и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 230 страницах машинописного текста. Диссертация содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы, содержащие результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список цитированной литературы. Работа иллюстрирована 54 рисунками, цифровой материал представлен в 10 таблицах, указатель литературы включает 82 отечественных и 229 иностранных научных источников.
