Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ (обзор литературы)
1.1 ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК И
ИХ МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 10
Липидно-белковый бислой 12
Белковый цитоскелет мембраны эритроцита 14
Деформации мембраны 18
Роль деформаций цитоплазматических мембран в
регуляции функций клеток 22
1.2 БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ 30
ЧАСТЬ ВТОРАЯ
(собственные исследования)
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 39
2.2 ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ПО
ИССЛЕДОВАНИЮ ВЫХОДА АДФ ИЗ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ
ИХ СДВИГОВОЙ ДЕФОРМАЦИИ IN VITRO, С КОНТРОЛИРУЕМОЙ
ВЕЛИЧИНОЙ УСИЛИЯ СДВИГА 47
2.3. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИИ ВЫХОДА АДФ ИЗ
КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ SHEAR STRESS И
СПОСОБНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ К ДЕФОРМАЦИИ В УСЛОВИЯХ
ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА 58
2.4. КОРРЕКЦИЯ АНТИОКСИДАНТАМИ ИЗМЕНЕНИИ
ВЫХОДА МОЛЕКУЛ АДФ ИЗ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ
ИХ СДВИГОВОЙ ДЕФОРМАЦИИ В УСЛОВИЯХ
ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА 72
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 82
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДФ - аденозиндифосфат АТФ - аденозинтрифосфат Г1Б - гидропероксид трет.бутила АФК - активные формы кислорода ОМ - окислительная модификация
Введение к работе
Актуальность проблемы. Клетки крови выполняют специфические, жизненоважные для организма функции. Наряду с этим, независимо от их функциональной» специализации;, форменные элементы крови участвуют в процессах, которые определяют содержание в плазме крови биологически активных веществ. Во-первых, вследствие того, что в цитоплазме клеток крови имеется высокая концентрация различных метаболитов, молекулы которых могут пассивно поступать в плазму по градиенту концентрации. Одновременно имеет место и обратный процесс диффузии молекул веществ из плазмы крови в цитоплазму форменных элементов. В настоящее время установлено, что из эритроцитов и тромбоцитов в плазму крови поступают молекулы таких биологически активных веществ как АТФ и АДФ и это не является следствием разрушения клеток /Alkhamis е.а., 1988/. Концентрация в плазме крови молекул биологического активного вещества - N0 зависит не только от активности NO-синтетазы, но и от скорости диффузии N0 в цитоплазму эритроцитов, где эти молекулы очень быстро дезактивируются, переходя в нитраты при взаимодействии с гемоглобином /Kuang-Tse Huang е.а. 2001/. Соответственно одним из факторов, лимитирующих скорость указанных процессов, является проницаемость цитоплазматических мембран форменных элементов крови для диффундирующих веществ.
Клетки крови и эндотелия кровеносных сосудов функционируют в условиях, при которых они постоянно подвергаются силовому воздействию со стороны смещающихся слоев движущейся плазмы, что является причиной сдвиговой деформации цитоплазматических мембран (shear stress) /Evans, Skalak 1980/. Деформации мембран являются для клеток регуляторными стимулами. В цитоплазматических мембранах клеток эндотелия и гладких мышечных волокнах кровеносных сосудов имеется специальная механосенсорная система, обеспечивающая реакцию на механические воздействия. Важная функциональная роль в реализации механизма механочувствительности в эндотелиальных клетках и гладких мышечных волокнах кровеносных сосудов принадлежит белкам цитоскелета, и гликокаликсу /Lehoux, Tedkui, 1998;. Goldschmidt е.а., 2001; Weinbaum е.а., 2003/.
Клетки крови также обладают способностью реагировать на механические воздействия. При воздействии shear stress возрастает проницаемость мембран тромбоцитов и эритроцитов для молекул АДФ /Alkhamis е.а., 1988/. Наряду с этим в эритроцитах меняется интенсивность метаболизма /Санников А.Г., 1999/, возрастает проницаемость; мембран для ионов, /Ney е.а. 1990/. Установлено, что реакция клеток на механические воздействия зависит от величины механического стимула /Goldschmidt е.а., 2001/. Изменения параметров гемодинамики - давления крови, линейной скорости кровотока, которые, например, имеют место при физической нагрузке или стенозе кровеносных сосудов при атеросклерозе, влечет за собой и изменения величины силы сдвига, обуславливающую сдвиговую деформацию мембран клеток крови /Ersoz е.а., 2002/. Соответственно это является причиной увеличения проницаемости мембран форменных элементов крови, которая и обусловливает изменения концентрации биологически активных веществ в плазме. Особо значимым является увеличение проницаемости мембран клеток крови для молекул АДФ, поскольку даже очень незначительное увеличение в плазме крови концентрации АДФ активирует процесс агрегации тромбоцитов.
Есть все основания предполагать, что реакция клеток крови на сдвиговую деформацию зависит не только от величины механического воздействия, но и от вязко-эластических свойств их цитоплазматических мембран, которые определяются химическим составом липидного матрикса мембран и уровнем фосфорилирования белков цитоскелета /Chasis, Mohandas 1986; Evans, Needman 1987/.
Модификация химического состава липидов мембран может иметь место при нарушениях липидного обмена, а также при окислительном стрессе. В последнем случае, когда возрастает уровень свободно-радикального окисления липидов мембран, в этот процесс вовлекаются в первую очередь молекулы фосфолипидов, которые содержат полиненасыщенные жирные кислоты, что приводит к изменению механических свойств материала мембран. Следует особо подчеркнуть, что окислительный стресс может возникать при различных патологических состояниях.
Таким образом, все выше изложенное свидетельствует о том, что исследование изменений проницаемости для молекул АДФ мембран клеток крови
при их сдвиговой деформации на фоне окислительного стресса является актуальной научной проблемой.
Целью - настоящей работы являлось исследование и количественная оценка изменений выхода АДФ из клеток крови в ответ на сдвиговую деформацию при модификации их структуры в результате окислительного стресса, а также исследование эффективности применения антиоксидантов для восстановления нормального функционирования мембран.
Задачи исследования:
Разработка атравматичного метода для обеспечения сдвиговой деформации мембран клеток крови in vitro с контролируемой величиной усилия сдвига;
Проведение количественной оценки выхода АДФ из клеток крови в ответ на сдвиговую деформацию мембран при модификации их структуры гидропереокисидом трет.бутила;
Исследование изменений способности эритроцитов к деформации при модификации структуры их мембран в результате окислительного стресса;
Исследование возможности коррекции с помощью антиоксидантов изменений проницаемости мембран клеток крови при их сдвиговой деформации для молекул АДФ в условиях окислительного стресса;
Исследование возможности коррекции с помощью антиоксидантов изменений способности эритроцитов к деформации в условиях окислительного стресса.
Научная новизна.
Впервые показано, что концентрация АДФ в плазме крови в результате выхода из клеток крови при их сдвиговой деформации линейно возрастает с увеличением усилия сдвига и времени воздействия shear stress.
Уменьшение плотности упаковки молекул липидов в цитоплазматических мембранах является одной из наиболее вероятных причин увеличения проницаемости клеток крови для молекул АДФ при их сдвиговой деформации.
Между величиной выхода молекул АДФ из клеток крови при их сдвиговой деформации и глубиной свободнорадикального окисления липидов мембран имеет место U — образная зависимость
Способность эритроцитов к деформации линейно уменьшаться с увеличением глубины свободнорадикального окисления липидов мембран.
Ингибиторы свободнорадикального окисления а-токоферол и СО-3 проявляют наибольший эффект в составе синергической смеси не только в модельной системе окисления, но и в клетках крови. Они способны корригировать изменение выхода молекул АДФ из клеток крови при их сдвиговой деформации, а также восстанавливать способность эритроцитов к деформации в условиях окислительного стресса.
Научно-практическая значимость работы.
На основе результатов настоящей работы были разработаны и научно обоснованы:
новые представления о механизмах выхода молекул аденозиндифосфата из клеток крови при их сдвиговой деформации;
экспериментальная технология, которая позволяет моделировать изменения функционального состояния цитоплазматических мембран клеток крови, путем контроля уровня инициированной пероксидации липидов мембран;
экспериментальная модель исследования выхода молекул
аденозиндифосфата из клеток крови в ответ на их сдвиговую деформацию при контролируемой величине усилия сдвига;
новая экспериментальная технология, которая позволит оценивать эффективность действия антиоксидантов по восстановлению проницаемости
мембран клеток крови для молекул аденозиндифосфата при их сдвиговой деформации в условиях окислительного стресса.
Положения выносимые на защиту:
1. Увеличение количества АДФ в плазме при сдвиговой деформации клеток
крови не является следствием их разрушения, а обусловлено ростом проницаемости
клеточных мембран для молекул АДФ.
2. Уменьшение плотности упаковки молекул в липидном бислое
цитоплазматических мембран клеток крови при их сдвиговой деформации
определяет увеличение проницаемости для молекул АДФ.
3. Антиоксиданты а-токоферол и СО-3 способны корригировать изменение
выхода молекул АДФ из клеток крови при их сдвиговой деформации, а также
восстанавливать способность эритроцитов к деформации в условиях
окислительного стресса.
Апробации и публикации. Основные положения диссертации доложены на всероссийских конференциях «Актуальные проблемы эволюционной и популяционной физиологии человека» Тюмень 2001, «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной медицины» Тюмень, 2002, 2003, 2004. XI Международной конференции по химии органических и элементорганических пероксидов» Москва, 2003;
Материалы работы опубликованы в сборниках соответствующих конференций, и в журналах «Научный вестник тюменской государственной медицинской академии» Тюмень 2002, 2003; «Известия Челябинского научного центра» Челябинск 2004.
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ
(обзор литературы)
1.1 ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК И ИХ МЕХАНИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА
Цитоплазматические мембраны различных клеток у животных имеют ряд общих структурных особенностей. В центре мембраны; локализован жидкокристаллический липидно-белковый бислой, основой которого является липидный матрикс. Внешняя поверхность, липидно-белкового слоя покрыта гликокаликсом, сформированным гликолипидами и гликопротеинами. Разветвленные группы гликолипидов и гликопротеинов выступают на несколько нм в экстрацеллюлярное пространство (рис. 1).
Экстрацеллюлярный матрикс Гликокаликс
Липидно-белковый
бислой Цито скелет
Рис.1. Структура цитоплазматических мембран клеток животных /Sackmann, 1995/.
На внутренней поверхности липидно-белкового бислоя цитоплазматической мембраны локализована макромолекулярная белковая сеть цитоскелета.
Липидно-белковый бислой и гликокаликс образуют селективный фильтр, который контролирует трансмембранный транспорт ионов, различных молекул, молекулярных агрегатов и крупных частиц, например, таких как вирусы;
Липидно-белковый бислой является мультифункциональной системой, обеспечивающей процессы преобразования и запасания энергии, восприятия и передачи гормональных сигналов к внутриклеточным структурам;
Гликокаликс обеспечивает рецепцию экстрацеллюларных сигналов и является посредником между внутриклеточным содержимым' и внешним окружением клетки;
Другая важная функция гликокаликса это формирование связей между экстрацеллюларным матриксом клеток (например при образовании связей между клетками эпителия), которые опосредуются через рецепторы к коллагену и фибронектину.
Липидно-белковый би слой и белковая сеть цитоскелета обеспечивают эластичность и механическую стабильность цитоплазматических мембран.
В настоящее время наиболее детально изучена молекулярная структура цитоплазматических мембран эритроцитов. На рисунке 2 схематично представлена молекулярная структура цитоплазматических мембран эритроцитов. Рассмотрим особенности молекулярной организации липидно-белкового бислоя и белкового цитоскелета мембран эритроцитов.
.-: Спектрин
Рис. 2. Молекулярная структура цитоплазматических мембран эритроцитов /Sackmann, 1995/.
1.1.1 Липидно-белковый бислой
Молекулы липидов формируют липидный бислой, который является основой композитной структуры мембран эритроцитов. Одни из липидов являются преимущественно структурными элементами мембран, а другие выполняют регуляторные функции. К первой группе относят холестерол, цереброзиды и четыре преобладающих в количественном отношении представителей фосфолипидов: фосфотидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (PS) и сфингомиелин (SPHM). Липиды, выполняющие регуляторную роль: фосфатидилинозитол (РІ) (предшественник вторичных мессенджеров); фосфатидная кислота, фосфатидилглицерол (промежуточные продукты синтеза липидов) и многочисленные типы ганглиозидов, определющих антигенную специфичность групп крови. Молекулы различных фосфолипидов отличаются структурой полярного фрагмента, длинной углеводородных цепей жирных кислот и степенью их ненасыщенности.
Белки, входящие в структуру липидно-белкового бислоя мембран, можно разделить на четыре больших класса: 1. Белки преимущественно связанные с гидрофобной сердцевиной липидного бислоя. В цитоплазматических мембранах эритроцитов представителями данного класса белков являются: белок полосы III - анионный обменник и белки транспортных систем (Na+, К+ -зависимой -АТФ-азы и Са^-зависимой АТФ-азы). В мембране эритроцита находится около 10б молекул белка полосы три, который имеет два высокоспециализированных домена. Аминоконцевой -фосфорилируемый домен белка полосы три, локализован на цитоплазматической поверхности мембраны эритроцита, и связан с анкирином, белками полос 4.1 и 4.2, с гемоглобином и гликолитическими
ферментами /Low, 1986; Steck, 1978; Walder е.а., 1984; Anstee е.а., 1995; Bordin е.а., 1995/. Карбоксиконцевой домен встроен в липидный бислой мембраны и
ответственен за перенос хлорид-, бикарбонат-, фосфат-анионов /Jay, Cantley, 1986; Jennings, 1985; Lodish, 1987/.
Трансмембранные белки. Они связаны посредством одного гидрофобного фрагмента с липидным бислоем мембраны. Представителями этого класса являются белки рецепторы (например для инсулина и трансферина), а также молекулы интегральных белков мембран эритроцитов - гликофоринов. Эти гликопротеины способны специфически связывать растительные лектины, аглютинины групп крови, вирусы, и обеспечивают фиксацию спектрин/актиновой сети цитоскелета к липидному би слою /Le Van Kim е.а., 1987; Huang е.а., 1992/.
Белки - связанные с мембраной через липидный якорь. Возможны три типа заякоревания:
а). Взаимодействие белков с гликолипидами. В этом случае они входят в структуру комплекса с олигосахаридами. Подобным образом обеспечивается связывание фосфотаз с внешней поверхностью мембран; б). Фиксация молекул белков (например а-субединицы G-белков) к углеводородным цепям жирных кислот фосфолипидов; в). Образование S-S сшивок между гирофобными участками полипептидных цепей белков (например полипептидые цепи р/у доменов G-белков) и -СН2-SH фрагментами полярных головок молекул фосфолипидов. 4. Белки, адсорбированные на поверхности липидного бислоя, за счет взаимодействия с полярными фрагментами молекул фосфолипидов (цитохром С, спектрин) /Johnson е.а., 1991/.
1.1.2 Белковый цитоскелет мембраны эритроцита
Цитоскелет мембраны эритроцита представляет собой прочную, эластичную белковую сеть, локализованную на внутренней поверхности липидного бислоя цитоплазматической мембраны: эритроцита /Bennett, 1985/. Основа молекулярной структуры цитоскелета - это спектрин- актиновый комплекс, который содержит добавочные белки: анкирин, 4.1 и 4.9. Другие белки обеспечивают спектрин-актиновое взаимодействие - белок полосы 4.2, аддуцин /Gardner, Bennett, 1987; Mische е.а., 1987/, тропомиозин /Fowler, Bennett, 1984а, b/, тропомиозин связующий белок или тропомодулин /Fowler, 1987/.
Похожие диссертации на Закономерности изменений выхода молекул аденозиндифосфата из клеток крови при их сдвиговой деформации в условиях окислительного стресса. Коррекция антиоксидантами
