Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль особенностей биотрансформирующей функции печени в формировании резистентности организма и патологии (обзор литературы) 11
1.1. Метаболизм ксенобиотиков в печени 12
1.2. Влияние скорости метаболизма на возникновение и течение патологических процессов 16
1.3. Функциональные пробы печени 19
1.4. Нагрузочные тесты 22
ГЛАВА 2. Методы определения модельных веществ в биологических жидкостях организма для проведения нагрузочных тестов (обзор литературы) 32
2.1. Методы определения антипирина 32
2.2. Методы определения пропранолола и других блокаторов 34
2.3. Выбор тест-ткани 37
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 39
3.1. Характеристика обследованных лиц 39
3.2. Методы клинического обследования 47
3.3. Методы оценки детоксикационной функции печени 48
3.4. Статистическая обработка материала 51
ГЛАВА 4. Разработка ВЭЖХ методов определения пропранолола и антипирина в биологических жидкостях (результаты собственных исследований) 52
4.1. Разработка ВЭЖХ метода определения пропранолола и других блокаторов 52
4.2. Модификация жидко-жидкостной экстракции антипирина 67
ГЛАВА 5. Изменения детоксикационной функции печени при вирусных гепатитах (результаты собственных исследований) 71
5.1. Сравнительный анализ изменений наиболее применяемых функциональных проб печени при вирусных гепатитах 71
5.1.1. Изменения индикаторов цитолиза гепатоцитов 71
5.1.2. Закономерности изменений уровня билирубина 74
5.1.3. Изменения белоксинтетической функции и показателей мезенхимально-воспалительного синдрома .. 76
5.2. Оценка возможностей инструментальных методов исследования 81
5.3. Сравнительный анализ диагностических возможностей нагрузочных тестов 84
5.3.1. Этнические особенности скорости биотрансформации модельных веществ у здоровых 84
5.3.2. Изменения скорости элиминации модельных веществ при вирусных гепатитах 90
5.4. Взаимосвязи между изменениями наиболее употребляемых функциональных проб печени и нагрузочными тестами 101
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов 105
Выводы 121
Практические рекомендации 122
Список литературы 123
- Влияние скорости метаболизма на возникновение и течение патологических процессов
- Методы определения пропранолола и других блокаторов
- Разработка ВЭЖХ метода определения пропранолола и других блокаторов
- Изменения белоксинтетической функции и показателей мезенхимально-воспалительного синдрома
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирусные гепатиты являются важнейшей клинической проблемой, как во всем мире, так и в Российской Федерации. Ежегодно они выявляются впервые у 1 млн. человек на Земном шаре и поражают самую дееспособную часть общества: наибольшая заболеваемость отмечается среди лиц 15-30 лет [10, 14, 18,29,38,219].
Вирусные гепатиты сопровождаются нарушением функций печени разной степени выраженности: от бессимптомной гепато депрессии до развития печеночной энцефалопатии и комы, причем первая встречается значительно чаще [10, 24]. Особо отмечается, что гепатодепрессия - скорее функциональный синдром, так как постоянные морфологические признаки при нем отсутствуют и далеко не всегда выявляется некроз гепатоцитов. По своей сути гепатодепрессия - это угнетение детоксикационной и, отчасти, синтетической функций органа [24, 132-134, 140, 147, 186].
Состояние функции детоксикации при гепатитах чаще принято оценивать косвенно, ориентируясь на клинические симптомы, степень выраженности цитолиза гепатоцитов, нарушений белоксинтетической функции, изменений в гемостазе в комплексе с вирусологическими исследованиями. Также учитываются данные ультразвукового и радиоизотопного скенирований, предполагается, что, чем значительнее структурные изменения, тем в большей степени угнетены функции печени [19,38,119].
Прямыми индикаторами состояния функции детоксикации являются нагрузочные пробы, из которых чаще используется антипириновый тест [4, 20, 32, 70, 75, 97, 139, 163, 164, 192]. Но его клиническое применение частично ограничено побочными эффектами препарата, техническими неудобствами проведения пробы, несовершенством методик обнаружения вещества в жидкостях организма. Также противоречивы данные о
чувствительности и диагностической ценности теста [92, 117, 136, 140, 180, 135,236,237].
Скорость биотрансформационных процессов в печени генетически детерминирована и зависит от этнической принадлежности, пола, возраста [15, 16, 23, 125, 182, 220, 234]. Следовательно, степень ее нарушений при вирусных гепатитах индивидуальна, что также затрудняет интерпретацию результатов нагрузочных проб.
Ранее для оценки скорости процессов биотрансформации в печени при проведении фармакокинетических исследований использовался тест с пропранололом [225], но мы не обнаружили работ о его применении для оценки изменений детоксикационной функции при ее заболеваниях.
Проведение нагрузочных тестов требует многократного определения концентрации модельного вещества, поэтому в качестве тест-ткани желательно использовать неинвазивно получаемые биологические жидкости организма. Кроме того, метод его обнаружения должен быть высокоспецифичным, так как во время проведения проб пациенты принимают различные лекарственные препараты [136].
В связи с вышесказанным особенности изменений детоксикационной функции печени при вирусных гепатитах требуют дополнительного изучения. Также остается открытым вопрос о надежном, неинвазивном, технически приемлемом методе ее исследования, который позволил бы объективизировать оценку степени гепатодепрессии при вирусных гепатитах.
Цель исследования: установить с помощью нагрузочных проб (антипириновой и теста с пропранололом) закономерности изменений детоксикационной функции печени при вирусных гепатитах и их взаимосвязи с наиболее употребляемыми функциональными пробами печени.
Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
Разработать способ определения пропранолола и модифицировать метод обнаружения антипирина в слюне, плазме/сыворотке крови; апробировать методику проведения нагрузочного теста с пропранололом с использованием слюны для оценки состояния детоксикационнои функции печени.
Изучить с помощью нагрузочных тестов особенности биотрансформирующей функции печени здоровых в зависимости от этнической принадлежности (у бурят и русских).
Исследовать с помощью нагрузочных проб характер изменений детоксикационнои функции печени при разных формах вирусных гепатитов и сравнить чувствительность тестов между собой.
Оценить характер взаимосвязей между состоянием детоксикационнои функции, с одной стороны, и степенью цитолиза гепатоцитов, v. нарушениями билирубинового обмена, белоксинтетической функции при разных формах вирусных гепатитов - с другой.
Научная новизна
Впервые разработан метод твердофазной экстракции пропранолола и других р-адреноблокаторов с использованием нового отечественного сорбента Purosep-2001 (на основе сверхсшитого полистирола) для ВЭЖХ анализа в биологических жидкостях (слюна, плазма/сыворотка крови) с УФ-детекцией.
Автором сорбента является проф. В.А. Даванков (Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН, Москва). Разработка методики проводилась при его личной информационной поддержке.
Предложена модификация жидко-жидкостной экстракции антипирина для ВЭЖХ анализа в слюне, плазме/сыворотке крови с УФ-детекцией.
Установлено, что скорость процессов детоксикации в печени, по данным теста с пропранололом, у здоровых лиц (бурят и русских) вне зависимости- от национальной принадлежности имеет бимодальное распределение: с одинаковой частотой встречаются «быстрые» и «медленные» элиминаторы. У «медленных» элиминаторов бурят процессы биотрансформации происходят с меньшей скоростью.
Впервые показано, что при вирусных гепатитах, по данным теста с пропранололом, развиваются неоднозначные изменения детоксикационной функции печени: при остром гепатите средней степени тяжести в период разгара заболевания происходит ее активация, а при хроническом -угнетение уже на ранних стадиях развития заболевания. При этом характер нарушений процессов детоксикации не зависит от степени цитолиза гепатоцитов, изменений билирубинового обмена, белоксинтетической функции. Нарушение биотрансформационных процессов при хроническом вирусном гепатите предшествует другим дисфункциям печени.
Теоретическая и практическая значимость работы
В ходе исследования был разработан чувствительный, специфичный, воспроизводимый метод определения пропранолола и других (3-блокаторов (бисопролола, атенолола и соталола) в биологических жидкостях организма: плазме/сыворотке крови, слюне.
Разработана и апробирована методика проведения нагрузочного теста с пропранололом для исследования детоксикационной функции печени при вирусных гепатитах. Показано, что для определения параметров скорости элиминации модельного вещества достаточно 4-5 определений его концентрации, что позволяет сократить время исследования и исключить
забор пробы в ночное время. Использование слюны в качестве тест-ткани позволило проводить тест с пропранололом неинвазивно.
Полученные данные расширили представление о характере изменений детоксикационной функции печени при различных формах вирусных гепатитов. Показано, что при остром гепатите средней степени тяжести в стадию разгара происходит компенсаторная активация детоксикационной функции печени. В патогенезе хронических вирусных гепатитов функция детоксикации угнетается на самых ранних этапах развития заболевания, в том числе при отсутствии активности, процесса.
Обнаруженная разница в скорости биотрансформационных процессов у бурят и русских по данным теста с пропранололом позволит оптимизировать терапию лекарственными препаратами, которые метаболизируются в печени с участием тех же изоформ системы CYP, что и пропранолол (липофильные-Р-блокаторы, антидепрессанты, нейролептики, ингибиторы протонной помпы и др.).
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, госпитальной терапии, инфекционных болезней с курсом общей и военной эпидемиологии Читинской государственной медицинской академии.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации и результаты исследований
доложены: на Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием «Медико-биологические аспекты
мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); на VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2006); на Всероссийском симпозиуме РАН «Хроматография в
химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва -Клязьма, 2007); на I межрегиональной конференции «Сочетанные заболевания внутренних органов в терапевтической практике» (Иркутск, 2007); на Всероссийской 15-ой научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2007); на совместном заседании кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии, биохимии, фармакологии с участием сотрудников НИИ «Медицинской экологии» ЧГМА (Чита, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 - в изданиях, определенных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.
Положения, выносимые на защиту:
Разработанный метод определения пропранолола является чувствительным и воспроизводимым по сравнению с имеющимися аналогичными. Пропранололовый тест с использованием слюны может применяться для оценки детоксикационной функции печени при вирусных гепатитах.
Скорость метаболических процессов в печени у бурят и русских, по данным теста с пропранололом, имеет этнические особенности: у «медленных» элиминаторов бурят она меньшая.
Характер изменений детоксикационной функции, а также ее взаимосвязи с наиболее употребляемыми функциональными пробами печени зависят от формы вирусных гепатитов.
Влияние скорости метаболизма на возникновение и течение патологических процессов
Превращение веществ в печени традиционно рассматривается как обезвреживание, однако в результате биотрансформации возможен переход неактивных молекул в более активные, а иногда и в более токсичные метаболиты [16, 73, 127]. В зависимости от метаболического статуса одно и то же вещество может оказывать разный эффект на индивидуумов, обуславливая чувствительность к действию ксенобиотика [6, 45, 47, 49, 61, 73, 106, 118, 143].
Особенно ярким примером является токсическое действие этанола. Развитие алкогольной болезни печени не коррелирует ни с дозой, ни с видом употребляемых спиртных напитков; цирроз печени развивается не более чем у 50% лиц, злоупотребляющих алкоголем [78, 140]. В организме этанол, под действием алкогольдегидрогеназы (АДГ) и частично при участии CYP2E1, превращается в токсичный ацетальдегид, который альдегиддегидрогеназой (АЛДГ) трансформируется в ацетат. Обнаружен генетический полиморфизм обоих этих ферментов. У лиц со сниженной активностью АЛДГ в печени накапливается ацетальдегид, который вызывает flush-синдром (резкое опьянение, жар, тахикардия, аритмии, мышечная слабость) после приема спиртных напитков. При злоупотреблении алкоголем у них происходит накопление ацетальдегида, который инициирует жировое перерождение гепатоцитов и фиброз органа; индуцирует развитие этанол-ассоциированных злокачественных опухолей ЖКТ [2, 46, 53, 73, 118, 146, 158, 159, 208].
Генетическая предрасположенность к онкологическим заболеваниям, по данным некоторых авторов, также обусловлена скоростью метаболических процессов. Многие химические вещества: полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), афлатоксины, нитрозамины являются проканцерогенами, в организме происходит их метаболическая активация [9, 16, 34, 105, 106]. Доказано, что CYP1A1 и CYP3A4 активируют ПАУ, CYP1A2 модифицирует ариламины, CYP2A1 влияет на низкомолекулярные канцерогены (уретан, винилхлорид) [16]. Высокая активность CYP2D6 опасна для курильщиков, т.к. эта изоформа активирует канцероген табачного дыма - 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон, поэтому «сильные» метаболизаторы-курилыцики по этой изоформе в 4-5 раз чаще страдают бронхогенным раком легких [106, 154]. С другой стороны, система CYP и энзимы II фазы дезактивируют истинные канцерогены. Так CYP2D6 обезвреживает метиловые галиды, и «медленные» метаболизаторы по этой изоформе достоверно чаще страдают астроцитомой и менингиомой. Медленный фенотип ацетилирования в ряде работ отмечается как предрасполагающий фактор развития рака мочевого пузыря [105].
Система цитохрома Р-450 регулирует метаболизм арахидоновой кислоты - предшественника большого спектра биологически активных веществ иммуномодулирующего действия [16, 28]. Наследственная предрасположенность к различным заболеваниям легких также реализуется ; посредством этой системы. Существуют взаимосвязи между активностью изоформ CYP2J2, CYP2E1 и риском развития бронхиальной астмы, полиморфизмом эпоксидгидролазы и хронической обструктивной болезнью легких [3,25, 109].
Различия между людьми в лекарственном ответе и нежелательные эффекты препаратов являются на сегодняшний день существенной проблемой здравоохранения [15, 40, 42, 104, 118]. В зависимости от скорости биотрансформации, один и тот же препарат, назначенный в равной дозе, может оказывать действие от индифферентного до токсического, включая развитие лекарственных гепатитов с летальным исходом [50, 63, 122, 234]. В США ежегодно от побочных действий лекарственных средств погибают до 100 000 человек, что занимает шестое место среди причин смертности в этой стране, при этом учитываются только эффекты при лечении стандартными дозами препаратов, в расчет не включаются случаи передозировок или ошибок в назначении лекарств [104, 117]. Подобная статистика в России, к сожалению, не ведется. Не менее актуальным является то, что от 10 до 40% пациентов не отвечают на стандартную терапию антидепрессантами, антигипертензивными, антиаритмическими, противосудорожными, антиастматическими, противоязвенными препаратами [26, 40, 80, 82, 104]. Отсутствие эффекта часто побуждает врача к увеличению дозы препарата, что приводит к драматическим последствиям [45, 82, 86]. Таким образом, именно от метаболического статуса организма зависят: риск развития и характер течения многих заболеваний, в том числе злокачественных опухолей; успех фармакотерапии, особенно если она назначается на длительное время, и одновременно применяются несколько препаратов. Особенности биотрансформирующих процессов организма должны учитываться при профессиональном отборе в химической промышленности и других вредных производствах [93, 106]. По данным ряда исследований, для более успешной трансплантации органов и тканей дополнительно к используемому критерию иммуносовместимости v предлагается введение критерия метаболической совместимости (метаболического равенства) донора и реципиента [106, 107].
Учитывая, что скорость биотрансформирующих процессов у индивидуумов разная изначально, безусловно, можно предположить, что при заболеваниях печени степень ее угнетения также будет индивидуальна.
В большинстве случаев определить истинную тяжесть состояния пациента при гепатитах и циррозах, верно прогнозировать реакцию печени на оперативное вмешательство, назначаемую лекарственную терапию, предвидеть надвигающуюся печеночно-клеточную недостаточность можно лишь зная состояние детоксикационной функции органа [20, 32, 49, 92, 93, 97, 106, 134, 140].
Методы определения пропранолола и других блокаторов
Анализу Р-блокаторов в биологических жидкостях посвящено достаточно исследований, результаты которых суммированы в обзорах [153, 170] и публикациях последних лет [172, 231, 235]. В основном исследования касаются методов ВЭЖХ анализа отдельных Р-блокаторов — атенолола [201], соталола [188], бисопролола [177], пиндолола [155], надолола [222] и пропранолола [59, 233]. По своим физико-химическим свойствам Р-блокаторы являются слабыми основаниями и эта их особенность определяет подходы к экстракции из биологических жидкостей и последующему хроматографическому разделению.
Наиболее распространена жидко-жидкостная экстракция (LLE) из алкалинизированной биопробы в несмешивающийся с водой органический растворитель и последующей реэкстракцией из него в малый объем разведенной минеральной кислоты [59, 87, 90, 153]. Однако LLE имеет свои известные недостатки. Во-первых, это высокая токсичность экстрагирующих растворителей, таких как диэтиловый эфир, метил-тертбутиловый эфир, этилацетат, дихлорметан, хлороформ, пентанол. Во-вторых - недостаточный и вариабельный процент экстракции. Даже в исследованиях последних лет удовлетворительной считается экстракция 74-90% для полярных р-блокаторов и всего 20-56% для неполярных [172].
Ранее в лаборатории ГУЗ «Читинский областной медицинский диагностический центр» были разработаны методы LLE двух "групп р-блокаторов — липофильных и гидрофильных и для них же два состава элюентов [12, 43]. И хотя процент экстракции в этих исследованиях был высок (91-100%) для обеих групп р-блокаторов, сама технология LLE требует разработки альтернативных вариантов в силу перечисленных причин.
Существующие методики твердофазной экстракции в ее классическом варианте на картриджах с обращенно-фазными сорбентами (С 18 и GN) также, дают сравнительно невысокий выход (70-80%) большинства р-блокаторов [170].
В настоящее время появился новый отечественный сорбент -сверхсшитый полистирол (Purosep-200) - (автор проф. Даванков В.А. и др.), поверхность которого более 1000 м /г, частицы неправильной формы 40-160 мкм). Он обладает уникальным механизмом поглощения веществ: это скорее растворение в фазе увеличивающегося в объеме полимера, чем адсорбция на его поверхности. Отсюда понятна и исключительно высокая сорбционная емкость материала: он продолжает набухать в сорбате вплоть до достижения сеткой полистирола максимально растянутого ненапряженного состояния. В благоприятных случаях один грамм сорбента поглощает до двух-трех граммов сорбата. Сорбционная емкость сверхсшитого полистирола в 3-4 раза превышает таковую Cig сорбентов, использующихся в настоящее время при твердофазной экстракции в ВЭЖХ. Другими свойствами Purosep-200, отличающими его от Cis сорбентов являются: высокая механическая прочность гранул и его химическая стабильность (устойчив к крайним значениям рН и органическим растворителям), одинаково высокая эффективность сорбции полярных и неполярных соединений из водной фазы и гексана, способность к концентрированию следовых количеств веществ из воды или воздуха для их последующего анализа, легкая регенерация (полностью отдает поглощенные вещества при нагревании, либо обработке органическими растворителями) [102, 167-169,241]. Сверхсшитый полистирол применяется в промышленных сорбционных технологиях (для поглощения газовых выбросов предприятий, экстракции фенолов из воды), но его возможности в приложении к биомедицинской хроматографии изучены недостаточно [102, 167-169]. Другая проблема - хроматографическое разделение. Для веществ со -свойствами оснований характерен асимметричный ("хвостатый") пик, и это обстоятельство сильно снижает чувствительность определения. Поэтому большое внимание уделяется улучшению формы пиков путем модификации состава элюента [152, 235]. Для этой цели в их состав включают органические аминные модификаторы (триэтиламин, диэтиламин, пропиламин, октиламин), которые драматически уменьшает срок службы колонки [152], вследствие чего увеличивается стоимость анализа. При анализе существующих ВЭЖХ-технологий определения (3-блокаторов определено, что актуальным является решение следующих проблем: 1. разработка универсального для большинства Р-блокаторов метода твердофазной экстракции на полимерном сорбенте (сверхсшитый полистирол), пригодного для рутинного клинического применения; 2. оптимизация состава элюентов, исключающая использование аминных модификаторов; 3. возможность реализации полученного метода на стандартном хроматографическом оборудовании. Исследование кинетики модельных веществ требует повторного забора тест-ткани: для построения кривой элиминации препарата из организма необходимо, как минимум, три точки (соответственно трехкратный забор биоматериала). Сбор проб крови требует повторных венепункций, что делает метод исследования более трудоемким для медицинского персонала, и менее -привлекательным для обследуемого. В пробах мочи содержатся преимущественно метаболиты веществ (чаще несколько), для обнаружения каждого из которых нужны специальные технологии. Поэтому мониторинг маркерных веществ в слюне является особенно привлекательным. Проникновение модельных препаратов в слюну осуществляется в соответствии с общими принципами движения веществ через биологические мембраны. В слюну из плазмы проникает только свободная фракция препарата, и существует зависимость между ее рН и коэффициентом слюна/плазма для многих полярных ксенобиотиков [187].
Разработка ВЭЖХ метода определения пропранолола и других блокаторов
В качестве тестируемых препаратов использовали липофильные (пропранолол и бисопролол) и гидрофильные (атенолол и- соталол) Р-блокаторы. В качестве внутреннего стандарта для пропранолола использовали бисопролол (справедливо и обратное), для соталола - атенолол (также справедливо обратное). Все эти препараты являются слабыми основаниями, и эта их особенность определяет подходы к экстракции.
Разработка и оптимизация экстракции. Мы решили отказаться от наиболее часто используемой при анализе р-блокаторов LLE-экстракции, в силу вышеперечисленных ее недостатков.
Твердофазную экстракцию производили на картриджах, упакованных новым отечественным сорбентом сверхсшитым полистиролом (Purosep-200)" [102]. Экстракционные картриджи готовили по собственной методике на основе 3-мл полипропиленовых шприцев с фторопластовыми фильтрами (Supelco, США). Они упаковывались следующим образом: сначала в шприц помещался фильтр, затем быстро наливалась суспензия сорбента в 3 мл 50% водного этанола (30 мг сорбента в 3 мл, то есть 1мг/мл), сверху помещался второй фильтр.
В качестве тест-ткани использовали плазму/сыворотку крови, слюну. К образцам плазмы/сыворотки перед загрузкой в картридж добавляли кислоту для высвобождения Р-блокаторов из связи с белками. Опытным путем определили, что для этих целей лучше использовать фосфорную кислоту. Альтернативный вариант — добавление уксусной кислоты, но экстракты в этом случае получаются более «грязными». Разницы в степени экстракции препаратов при использовании плазмы либо сыворотки не обнаружено.
Экстракция из слюны технически сложнее, чем из плазмы, поскольку она содержит высокомолекулярные гликопротеины (муцины), которые выводят из строя фильтры, забивая- их. Устранить эти соединения можно последовательным замораживанием-оттаиванием и центрифугированием. В некоторых случаях требуется дополнительная фильтрация через бумажный. фильтр (белая лента). Подкислять или подщелачивать слюну нет необходимости. Опытным путем установили, что исходная рН биопробы — кислая, щелочная или нейтральная - не влияет на выход р-блокаторов.
Промывка. Для выяснения оптимального состава для 1-ой промывки проводилась серия опытов с использованием в разных концентрациях нейтрального водного метанола и водного метанола с добавлением аммиака. Эффективней является промывка с использованием щелочного водного метанола, в этом случае процент метанола можно увеличить. 2-ую промывку проводили хлороформом или этилацетатом. Альтернативный вариант -использование гексана, но чистота экстракта в этом случае значительно меньшая. Подкисление органических растворителей трифторуксусной кислотой, либо подщелачивание аммиаком или триэтиламином, не улучшает чистоту экстрактов.
Высушивание является одним из важных моментов, во многом определяющим конечную чистоту экстракта. Продолжительность процедуры подбиралась также опытным путем. Полное высушивание сорбента можно определить визуально - он из красно-коричневого становится бледно-кремовым. В отличие от традиционных обращенно-фазных сорбентов С18, сорбенты на основе полистирола не теряют анализируемые вещества даже при длительном (15-20 мин) высушивании [246].
Элюирование можно проводить как подкисленным водным метанолом, так и безводными элюентами. В последнем случае экстракты гораздо чище. Минеральные кислоты (фосфорная, соляная и серная) для этой цели не. подходят, так как дают «грязные» экстракты. Самые чистые экстракты получаются при элюировании смесью метанол - хлороформ с добавлением малых количеств трифторуксусной кислоты. При этом преобладание метанола над хлороформом лучше смывает гидрофильные, а хлороформа над метанолом — липофильные (3-блокаторы. Менее чистые экстракты получаются при элюировании подкисленными ацетоном-метанолом и метанолом.
Растворение сухого остатка после упаривания, можно проводить как в соответствующем элюенте, так и в слабой кислоте. В первом случае -неудерживаемьтй пик заметно меньше.
Изменения белоксинтетической функции и показателей мезенхимально-воспалительного синдрома
Рост числа больных с хроническими гепатитами и циррозами печени требует диагностической информации (в идеале полученной неинвазивно) о функциональном состоянии органа. Этим обстоятельством объясняется растущий интерес к печеночным пробам и в гепатологии, и в других областях медицины, так как поражения печени все чаще выступают в роли сопутствующих заболеваний. Основное внимание сосредоточено на характере изменений интегративной функции печени - метаболизирующей (в практическом применении - детоксикационной), так как она обуславливает гомеостаз организма, а значит и последствия воздействий на больного экзогенных (в том числе лекарственных средств) и эндогенных факторов.
В настоящей работе мы исследовали особенности детоксикационной функции печени у здоровых лиц в зависимости от этнической принадлежности, а также закономерности ее изменений при различных формах вирусных гепатитов. Нами анализировалась возможность косвенной оценки степени изменения биотрансформирующей функции печени с помощью общепринятых методов, входящих в обязательные стандарты обследования больных, и нагрузочных тестов: антипиринового, который применяется чаще в исследовательских целях, и теста с пропранололом, ранее использовавшегося только в фармакокинетике.
В начале нашего исследования возник вопрос выбора аналитического метода обнаружения модельных веществ в биологических жидкостях организма. Точность построения кривой элиминации вещества достигается путем многократного забора тест-ткани (чаще крови) для определения его концентрации (до 6-8 измерений), что травматично для пациента и трудоемко для персонала. Сокращение числа заборов допустимо только в случае наличия высокоточного, специфичного и воспроизводимого метода обнаружения индикаторного препарата [88, 117, 136]. Для того, чтобы сделать исследование неинвазивным, аналитический метод должен быть адаптирован для работы с другими биологическим жидкостями, например со слюной.
В доступной нам литературе описаны методы ВЭЖХ анализа концентрации пропранолола и других Р-блокаторов с жидко-жидкостной экстракцией и флюореметрической детекцией [59, 87, 90, 153, 170]. Весомым недостатком жидко-жидкостной экстракции, который ограничивает ее применение при массовых исследованиях, является необходимость использования, высокотоксичных растворителей (эфира, хлороформа, этилацетата и др.). Флюореметрическая детекция также малоприемлема для серийных исследований. Во-первых, она требует высокой чистоты экстрактов анализируемых веществ (в противном случае на хроматограммах будет фиксироваться много дополнительных мешающих пиков из-за высокой чувствительности детектора), что невсегда возможно1 достичь при работе с биоматериалом, тем более со слюной, и тем более, если- планируется внедрение методики в практическое применение. С другой стороны, флюореметрический детектор не входит в стандартную комплектацию хроматографического оборудования, что уменьшает доступность технологий и повышает их стоимость. Кроме того, даже в работах последних лет [172] процент экстракции для неполярных (3-блокаторов (в том числе пропранолола) составляет 20-56%, что, безусловно, снижает чувствительность методик.
Нами разработан оригинальный метод ВЭЖХ анализа пропранолола и других Р-блокаторов в биологических жидкостях (плазма/сыворотка крови, слюна) с УФ-детекцией и твердофазной экстракцией на полимерном сорбенте - сверхсшитом полистироле (Purosep-200), автором которого является проф. Даванков В.А. Сверхсшитый полистирол является уникальным по своим поглощающим способностям сорбентом, появление которого считается прорывом в химии полимеров. Он способен концентрировать следовые количества веществ из воды или воздуха для последующего их анализа. Так 1мл сорбента полностью извлекает фенол из Зл питьевой воды. Он уже используется в промышленных технологиях, в том числе и за рубежом. Но в биомедицинской хроматографии этот сорбент только начинает осваиваться [102, 167-169, 241]. Чистота экстрактов, получаемых по нашей технологии высока, что позволило повысить чувствительность при УФ-детекции. Воспроизводимость предлагаемых экстракционных технологий приближается к 100% и практически не зависит от качества обрабатываемой биопробы. Частичный гемолиз, гиперлипидемия не влияют на экстракцию Р-блокаторов из крови. Степень экстракции для липофильных пропранолола и бисопролола — 94-100%, гидрофильных атенолола и соталола - 88-98%, что значительно выше описанных в, доступной нам литературе методик [59, 87, 172]. Предлагаемый метод может быть использован не только для проведения теста с пропранололом, но, возможно, и для терапевтического лекарственного мониторинга Р-блокаторов. При выборе метода определения концентрации антипирина мы столкнулись с тем, что даже в работах последних лет используются спектрофотометрический метод его обнаружения [58, 64, 65, 85]. Чувствительность этого метода невысокая (в пределах 1 мкг/мл), он неселективен (дает ложно положительные результаты в случае приема испытуемым схожих по строению лекарственных средств), плохо воспроизводим: качество обнаружения вещества зависит даже от температуры окружающей среды [7, 103, 136].
Похожие диссертации на Закономерности изменений детоксикационной функции при вирусных гепатитах
![Закономерности изменений кардиогемодинамики и микроциркуляции при хроническом рецидивирующем панкреатите и возможности их коррекции курантилом [Электронный ресурс]](/i/i/4230/203754.png "Закономерности изменений кардиогемодинамики и микроциркуляции при хроническом рецидивирующем панкреатите и возможности их коррекции курантилом [Электронный ресурс] Бурлакова Евгения Ивановна")