Введение к работе
Проблема лечения хронической печеночной недостаточности до настоящего времеїш остается нерешенной проблемой [Voigt, 2005; Williams, 2006; Friedman, 2010], т.к. летальность при далеко зашедших диффузных поражениях печени с исходом в тяжелую печеночную и гепатоцеребральную недостаточность не снижается и колеблется в пределах от 50 до 70-90% [Шумаков В Л., Онищенко Н.А., 1994; Damen, 1995, Рахманова А.Г., 2006, Friedman 2008; Lee, 2010].
Установлено, что развитие хронического повреждения печени является результатом снижения регенерационного потенциала гепатоцитов и уменьшения их массы, а также результатом избыточного образования компонентов внеклеточного матрикса.
Единственно эффективным методом лечения таких больных признана трансплантация печени [Williams, 2006; Lee, 2008; Готье СВ., Мойсюк Я.Г., 2010; Frei, 2011], которая, однако, не может быть осуществлена всем нуждающимся из-за дефицита донорских органов, который имеет место во всем мире [Чжао А.В., 2002; Perkins, 2007; Berg 2007; Kim, 2008; Alison, 2009].
Традиционно считается, что повреждения при циррозе печени необратимы. Тем не менее, исследования последних лет, выполненные на животных и в клинике, указывают на возможность, хотя бы частичного, регресса уже сформировавшегося фиброза [Arthur, 2002; Issa et al., 2004; Friedman, 2007; Zhang, 2011] с помощью клеточных технологий - трансплантации изолированных гепатоцитов и стволовых (прогениторных) клеток из разных источников [Dhawan, 2006; Kallis, 2007; Enns, 2008; Lysy, 2008; Oertel, 2008, Alison, 2009; Almeida-Porada, 2010; Stutchfield, 2010], в том числе из костного мозга (КМ) -мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [Quintanilha, 2008; Alison, 2009, Almeida-Porada, 2010]. В условиях эксперимента и клиники установлен факт антифиброзного действия стволовых/прогениторных клеток костного мозга [Fang et al., 2004; Di Vinicius, 2005; Zhao et al., 2005; Aziz et al., 2007; Dai et al., 2009]. Однако не все исследователи признают фибролитический эффект стволовых клеток и указывают даже на возможность усиления фиброза
при их использовании [Russo ct al., 2006; Di Bonzo et al., 2008; Higashiyama et al., 2007].
Констатация диаметрально противоположных результатов может быть следствием недоучета роли типа используемых клеток и их биорегуляторной активности (гемопоэтические или стромальные клетки), а также степени тяжести и обратимости имеющихся повреждений в печени.
Для установления причин противоречивых результатов применения, в частности ММСК КМ, а также для выработки показаний к их применению для лечения хронической недостаточности необходимо иметь четкие представления: об особенностях динамики развития соединительной ткани в печени под влиянием трансплантированных клеток. Для этого необходимо использовать адекватную модель фиброзирующего повреждения печени без и на фоне применения клеток костного мозга, определить эффективные дозы и сроки для их применения с учетом степени выраженности предсуществующих процессов фиброзирования печени. Такие данные в литературе отсутствуют, и это позволило нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования: изучить динамику развития соединительной ткани в печени при моделировании токсического фиброзирующего повреждения печени и трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аллогенного костного мозга.
Задачи исследования
-
Оптимизировать способ моделирования устойчивого фиброзирующего повреждения печени у крыс для оценки терапевтических эффектов клеточной трансплантации.
-
Оценить динамику морфологических изменений в печени при ее токсическом фиброзирующем повреждении.
-
Установить способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток обеспечивать коррекцию процессов фиброзирования в печени.
-
Изучить эффект трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на морфологические и функциональные нарушения печени при токсическом фиброзирующем повреждении в зависимости от дозы (однократная и двукратная трансплантация клеток).
-
Установить эффективные сроки выполнения трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для коррекции морфологических и функциональных нарушений в печени при хроническом фиброзирующем повреждении.
-
Установить связь коррекции морфологических нарушений в печени при трансплантации мезенхимальных стромальных клеток со снижением активации звездчатых клеток - регуляторов фиброгенеза и ускорением процессов пролиферации паренхиматозных клеток.
Научная новизна
Разработана схема введения СС14 для моделирования устойчивого фиброзирующего повреждения печени, которая исключает возможность спонтанной реверсии возникших морфо-функциональных нарушений.
Изучена динамика процесса фиброзирования печени после введения ССЦ. Впервые установлено, что процесс фиброзирования имеет фазный характер и приобретает прогрессирующее течение в отдаленные сроки - 60 и 90 сутки после курсового применения ССЦ. Исследование экспрессии маркеров активации звездчатых клеток печени - десмина и а-ГМА, позволило подтвердить, что процесс фиброзирования печени осуществляется при участии активированных звездчатых клеток. С помощью маркеров клеточной пролиферации и апоптоза (АФП, PCNA, Вс12, каспазы-3 и каспазы-9) было подтверждено, что развитие соединительной ткани в печени происходит на фоне замедления восстановительной регенерации гепатоцитов.
Установлено, что аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) от здорового донора при
трансплантации животным с хроническим фиброзирующим повреждением печени способны перепрограммировать процессы регенерации поврежденной печени и предотвращать формирование соединительной ткани в печени, если ММСК КМ используются в достаточной дозе и на ранних сроках развития процессов фиброзирования.
Впервые установлено, что применение ММСК в терапевтически эффективной дозе (двукратная трансплантация) и на ранних сроках развития фиброзирующего повреждения печени характеризуется двухфазной динамикой воздействия на развитие соединительной ткани: первоначально происходит достоверное увеличение удельной площади соединительной ткани (более выраженное, чем в контроле), а затем в отдаленные сроки наступает уменьшение площади и общего объема соединительной ткани (резорбции соединительной ткани печени; однократная трансплантация ( эффективной дозы на 3 сутки после затравки) была малоэффективна. Динамика корригирующего эффекта ММСК при воздействии эффективной дозы клеток коррелирует с убылью содержания активированных звездчатых клеток (по экспрессии десмина и а-ГМА), и с более ранней активацией пролиферации гепатоцитов (по экспрессии альфа-фетопротеина). Отсроченная трансплантация ММСК в терапевтически эффективной дозе (на 30 и 37 сутки после затравки) на фоне разрастания соединительной ткани неэффективна, т.к. не предотвращает разрастание соединительной ткани. Сформулирована гипотеза, согласно которой для реализации терапевтического эффекта ММСК и перепрограммирования регенерационного процесса в ткани печени с фиброзирующего на восстановительный должны быть сохранены адаптационные резервы восстановительной регенерации, которые еще сохранены на ранних сроках после повреждения печени и которые отсутствуют на поздних сроках регенерационного процесса.
Практическая значимость работы
Предложена новая схема введения ССЦ для моделирования устойчивого фиброзирующего повреждения печени и проведения доклинических испытаний
безопасности и терапевтических возможностей клеточных биотехнологий. Установлено, что применение ММСК КМ должно проводиться в терапевтически эффективных дозах на начальных этапах развития соединительной ткани в печени, когда еще сохранены местные адаптационные механизмы для перепрограммирования процессов фиброгсисза (фиброзирующей регенерации). Предотвращение развития соединительной ткани находится в непосредственной и прямой зависимости от суммарной дозы ММСК и достигается за счет раннего применения ММСК в эффективной дозе. Введение ММСК снижает функциональную активность синусоидных клеток (звездчатых клеток) и повышает пролиферативную активность гепатоцитов, что восстанавливает нарушенное межклеточное взаимодействие паренхиматозных и непаренхиматозных клеток и способствует резорбции соединительной ткани. Полученные результаты могут стать основой для применения аллогенных мезеихимальных стромальных клеток костного мозга в клинической практике у больных с хронической печеночной недостаточностью. Положения, выносимые на защиту
-
Новая схема введения СС14 для создания модели устойчивого фиброзирующего повреждения печени у крыс эффективна и может использоваться для оценки доклинических результатов коррекции фиброзирующих процессов с помощью ММСК КМ.
-
Выраженность корригирующего антифиброзирующего эффекта аллогенных мезеихимальных стромальных клеток костного мозга здоровых доноров находится в прямой зависимости от дозы (кратности введения клеток) и степени тяжести фиброзирующих изменений в печени (срока введения).
-
ММСК КМ, примененные в достаточной терапевтической дозе (двукратная трансплантация) на раннем этапе фиброзирования способствуют перепрограммированию процессов регенерации, что находит отражение в резорбции соединительной ткани (фибролиз).
4. ММСК КМ, примененные в той же терапевтической дозе, но на этапе развернутого фиброзирования печени (отдаленные сроки), не способствуют редукции соединительной ткани в печени.
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась 23 июня 2011 г. на заседании объединённой межлабораторной научной конференции ФГБУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.
Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IV Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 9 - 10 ноября 2008 г.); Конференции «Клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии» (г. Москва, 2009 г.); на Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (г. Тула, 9-10 ноября 2009 г.); на II Международной конференции «Мезенхимальные стволовые клетки в органной трансплантации» (г. Роттердам, Нидерланды, 17-18 января 2010 г.); на 45-м Конгрессе Европейского общества хирургических исследований (г. Женева, Швейцария, 9-12 июня 2010 г.); на VI Европейской гастроэнтерологической конференции (г. Прага, Чехия, 24-26 июня 2010 г.); на V Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 8-Ю октября 2010 г.); на IV Конгрессе регенеративной биологии и медицины (г. Штутгарт, Германия, 13-15 октября 2010 г.); на XVIII Объединенной европейской гастроэнтерологической неделе (г. Барселона, Испания, 23-27 октября 2010 г.); на XIII Международной конференции азиатской тихоокеанской ассоциации хирургических банков ткани (г. Букиттингги, Индонезия, 26-30 октября 2010 г.); на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и пекарство» (г. Москва, 11-15 апреля 2011 г.); на III Международной конференции «Мезенхимальные стволовые клетки в органной трансплантации» (г. Лювен, Бельгия, 17-18 апреля 2011 г.); на XXXVIII Конгрессе Европейского общества искусственных органов (г. Порту, Португалия, 9-12 октября 2011 г.); на Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (г. Москва, 14-15 октября 2011 г.); на XXV Ежегодной
конференции австрийского общества трансплантологии, трансфузиологии и генетики (г. Грац, Австрия, 19-22 октября 2011 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 в центральных рецензируемых журналах и 9 в зарубежных изданиях.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 146 страницах печатного текста. Состоит из введения, 5 глав, выводов, списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 70 рисунками и 5 таблицами.
