Введение к работе
Ожоговые поражения кожи стали в современном мире одним из наиболее социально значимых и распространенных типов травматических повреждений человека [Азолов В.В. и др., 1997, 1999].
Наряду с возросшей частотой термического поражения кожи в последние десятилетия резко повысилась их тяжесть, (увеличилось число ожоговых больных с сочетанной механической и термоингаляционной травмой), а также летальность (Багдатьев В.Е. и др., 1996; Азолов В.В. идр., 1999], которая в России достигла 3,3% и продолжает увеличиваться [Герасимова Л.И., 1999], особенно среди детей раннего возраста [Будкевич Л.И., 1998; Воздвиженский СИ. идр., 1999]. Высокая летальность, а также инвалидизация больных после глубоких или обширных ожоговых поражений кожи, послужило поводом к совершенствованию интенсивной и детоксикационной терапии, применению антибиотиков и иммунокорректоров [Распутин П.Г. и др., 1992; Багдатьев В.Е. и др., 1996; Адамян А.А. и др., 1998; Герасимова Л.И. и др., 1996; 1999; Ведерникова О.Л. и др., 1999; Алексеев А.А. и др., 1999; Reimann P.M. et al., 1990; Dorling A. et al., 1994], а также методов раннего «закрытия» ожоговых поверхностей аутодермотрансплантатами для предотвращения потерь организмом жидкости и плазменных белков и защиты ран от инфекции [Смирнов СВ. идр., 1998; Germann G. et al., 1995, Гришкевич В.М. и др. 1996; Воздвиженский СИ. идр., 1996, 1999; ТюрниковЮ.И. и др., 1997].
Между тем, при обширных глубоких ожогах кожи (более 20-30% поверхности тела) закрытие ожоговых ран при помощи перфорированных аутодермотрансплантантов оказалось весьма травматичным и даже невозможным для пострадавшего из-за дефицита его донорских ресурсов [МатчинЕ.Н, идр, 1998,2000].
В последние двадцать лет для улучшения результатов лечения ожоговых ран и снижения травматичности хирургического лечения, сочетающегося с аутодермопластикой, а также для снижения остроты дефицита донорского материала стали осуществлять трансплантацию клеток кожи и биоинженерных конструкций с иммобилизованными клетками для ускоренной реабилитации ожоговых больных.
Первоначально для трансплантации использовали культивированные ауто и аллогенные кератиноциты [Туманов В.П. и др., 1989;
Васильев АБ.идр, 1997; O'Connor N.E.etal., 1981;Alitalo K.etal, 1982; DeLappetal., 1990;Duins]aegerL.A.Yetal., 1994;WoodF.M, 1996], затем стали применять культивированные аллофибробласты кожи [Саркисов Д.С. и др., 1991; 1996; 1998] и аллогенные фетальные фибробласты [Саидгалин Г.З., 2000; Фаязов А.Д., 2003].
Однако применение фетальных фибробластов оказалось затруднительным в связи с нерешенностью этических, правовых и юридических проблем забора и использования этого материала; использование культивированных кератиноцитов и фибробластов из кожи взрослого человека не получило широкого распространения из-за высокой себестоимости процедуры наращивания клеточной массы в культуре.
В последние 5-8 лет в связи с развитием учения о стволовых клетках и, прежде всего, учения о мезенхимальных стромальных клетках (МСК) - костного мозга (КМ), появилась возможность их легитимного применения в практической комбустиологии для ускоренного закрытия ожоговых поверхностей и спасения больных с обширными и глубокими (критическими) ожогами.
Однако, в 2000 году приступая к исследованию результативности применения клеточных технологий в комбустиологии, мы не обнаружили работ, касающихся применения пред ифференцированых - фибробласто-подобных МСК аллогенного и аутогенного КМ для лечения ожоговых ран, а также для реанимации и реабилитации больных с ожогами.
Цели и задачи исследования
Цель исследования - изучить целесообразность трансплантации фибробластоподобных МСК, т.е. продифференцированных мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток аллогенного и аутогенного костного мозга, для повышения эффективности лечения ожоговых ран и ускоренной реабилитации ожоговых больных.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Воспроизвести модель поверхностного и глубокого термического ожога кожи со стандартно одинаковым размером зоны повреждения для изучения терапевтических эффектов клеточной трансплантации.
Отработать технологию выделения мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга, идентифицировать в культуре получение фибробластоподобных МСК и определить показания к применению аутогенных и аллогенных МСК для трансплантации на поверхность ран.
Отработать технологию иммобилизации фибробластоподобных МСК КМ на биодеградируемых мембранах и определить условия использования таких биоконструкций для заживления обширных ожоговых ран.
Сравнить в модельных опытах на крысах эффективность восстановительного лечения поверхностных и глубоких ожоговых ран при трансплантации фетальных фибробластов, а также алло и аутогенных фибробластоподобных МСК КМ.
Изучить особенности морфологии раневого процесса при использовании методов клеточной терапии.
Показать на моделях термического ожога взаимосвязь активизации регенераторных процессов в ожоговой ране с присутствием в ней трансплантированных клеток (фетальных фибробластов, а также аллогенных и аутогенных фибробластоподобных МСК КМ).
Изучить влияние функциональной активности трансплантированных клеток аллогенных фибробластоподобных МСК на коррекцию клинических проявлений (детоксикация, иммунокоррекция) ожоговой болезни у больных с поверхностными и глубокими ожоговыми ранами.
Установить роль трансплантированных клеток для осуществления ранней аутодермопластики ожоговых ран и ускорения сроков приживления аутодермотрансплантата.
Показать целесообразность интраоперационного использования аутологичных фибробластоподобных МСК КМ для качественного приживления полнослойного лоскута аутокожи во время пластических операций при лечении поздних послеожоговых рубцовьгх деформаций и при коррекции врожденных дефектов кожи.
Научная новизна
В настоящей работе, выполнявшейся в рамках программы «Клеточные технологии - медицине» по заданию Росздрава (регистрационный номер - 01.2.00 305442) представлены результаты изучения эффективности применения предифференцированных фибробластоподобных МСК из алло и аутогенного КМ для местного лечения ожоговых ран и реабилитации ожоговых больных.
Впервые в мировой практике для ускоренного заживления ожоговых ран применены культуры фибробластоподобных мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга, идентифицированных морфо-
логически, а также иммуногистохимически по маркерам МСК - белку цитоскелета - виментину, по поверхностному антигену - CD 133 и по коллагену III типа.
Показано, что для получения стабильно высокого процента живых и активных фибробластоподобных МСК в культуре не следует использовать клетки аутологичного костного мозга от ожоговых больных в остром периоде; следует использовать ФМСК от аллогенных доноров с 75-80% монослоем этих клеток в культуре и с пассированием их не более 4 -5 раз.
Впервые на моделях термического повреждения кожи у крыс проведена сравнительная оценка темпов заживления ожоговых ран после трансплантации фетальных фибробластов, а также аллогенных и аутогенных фибробластоподобных МСК КМ здоровых доноров. Установлено, что алло и аутогенные фибробластоподобные МСК, так же как и фетальные фибробласты, достоверно повышают скорость регенерации поверхностных; и глубоких ожоговых ран по сравнению со спонтанным их заживлением.
Показано, что при выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать фибробластоподобным МСК, а не фетальным фибробластам, так как применение фибробластоподобных клеток характеризуется более высоким темпом регенерации ожоговой раны, а на этапе культивирования более высоким темпом накопления клеточной массы по сравнению с фетальными фибробластами.
С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора (содержащего Lac-Z-ген E.coli), внедренного в донорские клетки (фетальные фибробласты, алло и аутогенные фибробластоподобные МСК) на этапе культивирования, доказано, что ускорите темпа регенерации ожоговых ран после трансплантации этих клеток связано с присутствием и функционированием (продукция цитокинов) их в зонах термического поражения (в сроках не менее 4 недель).
Показано, что ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных клеток сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в области ожоговой раны. Высказано предположение, что разрастание сосудистой сети предотвращает развитие грубых рубцовых изменений в зонах заживления ожоговой раны и сохраняет текстуру трансплантированной кожи.
Установлено, что аллогенные фибробластоподобные МСК, трансплантированные больным на глубокие ожоговые раны не только сокращают фазу деструктивных изменений в ране и способствуют осуществлению ранней а>тодермогшастики, но и приводят к более быстрому устранению клинических проявлений ожоговой болезни (восстановление функций органов детоксикации, снижение проявлений системной воспалительной реакции и иммунной дизрегуляции). Высказано предположение, что последнее связано с устранением цитокинового дисбаланса и продукцией противовоспалительных цитокинов.
Ускоренное заживление поверхностных и глубоких ожоговых ран в клинике связано со стимуляцией процесса образования микрососудов и созревания грануляционной ткани, оптимизирующих условия эпителизации ожоговой раны.
Практическая значимость работы
Отработаны технологические режимы выделения и накопления в культуре фибробластоподобных МСК. Предложено для лечения ожоговых ран и ускорения их регенерации использовать аллогенные, а для пластических операций аутологичные фибробластоподобные МСК КМ.
Установлена целесообразность использования биодеградируемых пленок с иммобилизованными фибробластоподобными МСК на ранних этапах лечения ожоговых ран, при этом клеточный монослой не должен превышать 80%.
Трансплантация аллогенных фибробластоподобных МСК на поверхность глубоких ожоговых ран не только ускоряет темп их заживления, но и ослабляет или даже предотвращает возникающие проявления ожоговой болезни: эндотоксикозы и полиорганную недостаточность.
Показано, что трансплантация фибробластоподобных МСК способствует ускоренному осуществлению аутодермопластики ожоговой поверхности и повышает качество приживления кожного трансплантата.
Положения, выдвигаемые на защиту
Культивированные in vitro алло и аутогенные фибробластоподобные мезенхимальные стромальные клетки из костного мозга, так же как и фе-тальные фибробласты ускоряют темп регенерации ожоговых ран за счет длительного сохранешю их жизнедеятельности в зонах трансплантации и продукции в рану биологически активных ростстимулирующих факторов.
Ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных фибробластоподобных мезенхималъных стромальньгх клеток
сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в ожоговой ране, что в свою очередь снижает вероятность образования грубых рубцов в отдаленном послеоперационном периоде.
При выборе клеточного материала для трансплантации на ожоговую рану предпочтение следует отдавать аллогенным фибробласто-подобным МСК из КМ, а не фетальным фибробластам, так как их использование способствует более высоком}' темп}' регенерации ран, а на этапе подготовки клеточного материала к трансплантации отмечается более высокий темп нарастания клеточной массы.
Иммобилизованные фибробластоподобные МСК способствуют ускоренному заживлению ожоговой раны на раннем этапе раневого процесса, что связано с формированием в таком монослое адекватных межклеточных взаимодействий, которые определяют более высокую функциональную активность иммобилизованных клеток.
Так как фибробластоподобные МСК КМ не являются продуцентами кератиноцитов, то для окончательного закрытия глубоких ожоговых ран трансплантация этих клеток должна завершаться аутодермопластикой.
Внедрение результатов работы
Отработанные методики культивирования фибробластоподобных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга использовались для получения клеточного материала и трансплантации пациентам травматологического отделения. МУ ЦРБ г. Оха Сахалинской обл, в Ожоговом центре больницы имени Н.В. Соловьева г. Ярославль, в ГО Российской детской клинической больнице Росздрава г. Москва.
Апробация диссертации
Апробация работы состоялась 15 марта 2006 года на межлабораторной юнференции в ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию России.
Основные положения работы доложены и обсуждены: на конференции "Новые оперативные технологии" (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты) (Москва, июнь 2002г.), на II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002г.), на конференции Новые технологии- медицине. 1-я Всероссийская конференция "Стволовые клетки" и перспективы исполь-
зования их в здравоохранении. (Москва, май 2003г.), на XXX Конгрессе Европейского общества искусственных органов (ESAO) (Германия. Аахен, сентябрь 2003г.); на II ежегодном совещании Европейского общества по тканевой инженерии (Италия. Генуя, сентябрь 2003г.), на Ученом совете института пластической хирургии (Москва, январь 2003г.), на Научном обществе травматологов и ортопедов Ярославской-Костромской-Вологодской областей (г. Ярославль, март 2004), на 2-ой Международной конференции "Патофизиология и современная медицина", (Москва, апрель 2004г.), на конференции "Человек и лекарство" (Москва, май 2004г), в Государственном комитете по науке и новым технологиям. (Москва, май. 2004г.), на XIII и XV сессиях РАМН (Москва, февраль, ноябрь 2004г.), на XIII Международной конференции по проблеме "Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии", (Пущино, июнь 2003г), наIII Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004г.), на Международной научно практической конференции "Управление качеством медицинской помощи на основе стандартизации и доказательной медицины" (г. Красногорск, декабрь. 2004г), на XV Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, октябрь 2004г.), на IV и V Междунардном конгрессе Kocmetik international (Москва, февраль-сентябрь 2005г.), на I Национальном конгрессе по биоэтике (Ташкент, сентябрь 2005г.), на III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2005г.), на XI Конгрессе Европейской ожоговой ассоциации (Португалия - Эшторил, сентябрь 2005г.), на Международной конференции "Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов" (Казахстан, г. Астана, ноябрь 2005г.).
Публикации
По теме диссертации опубликована 41 работа, из них 18 - в центральной печати, 7 - опубликованы за рубежом.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста. Состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы (522 источник, из них 160 -отечественных и 362 -зарубежных). Работа иллюстрирована 69 рисунками и 18 таблицами.
