Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки как дизрегуляционная патология организма 17
1.1.Ведущая роль иммунного дисбаланса в развитии и хронизации язв гастродуоденальной зоны 17
1.1.1.Нарушения гуморального и клеточного звена иммунной системы при язвенных 'поражениях слизистой оболочки гастродуоденальной зоны 17
1.1.2.Цитокиновые механизмы в иммунопатогенезе гастродуоденальных язв 22
1.1.3.Роль апоптоза в регуляции тканевого гомеостаза и патогенезе язвенной болезни 25
1.2.3начение аутоиммунных механизмов в патогенезе язвенной болезни 28
1.2.1. Аутоиммунные реакции и ульцерозный процесс 29
1.2.2. Связь аутоиммунных реакций с нарушениями микроциркуляции в слизистой оболочке желудка 34
1.3. Регуляторные пептиды в комплексном лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки 37
1.4 Возможности применения клеток костного мозга для лечения длительно незаживающих, трудно рубцующихся язв желудка и двенадцатиперстной кишки 42
1.4.1. Факторы регуляции, выделяемые клетками костного мозга для индукции восстановительных процессов в поврежденных органах 44
1.4.2. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга - как биорезерв тканевой регенерации 53
Глава 2. Материалы и методы исследования 62
2.1. Общая характеристика экспериментального и клинического материала..62
2.2. Технология получения и ведения культур клеток костного мозга 69
2.2.1. Технология получения, культивирования и подготовки для трансплантации мононуклеарной фракции клеток костного мозга 69
2.2.2. Технология получения, культивирования и подготовки для трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 70
2.3. Технология моделирования длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка у крыс 71
2.3.1. Подготовка животных к забору материала и приготовление водно-солевого антигена для моделирования длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка; Подготовка животных к моделированию ДНЯЖ и анестезиологическое обеспечение 71
2.3.2. Техника моделирования длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка 71
2.4. Техника трансплантации клеток в зону язвы желудка 73
2.5. Методы исследования 73
2.5.1. Методы культуральных исследований 73
2.5.2. Методы идентификации клеток после трансплантации в зону язвенного дефекта 75
2.6. Морфологические, биохимические и инструментальные методы исследования состояния зоны язвенного дефекта 80
2.6.1. Оценка регенерации язв 80
2.6.2. Оценка апоптоза эпителиальных клеток в слизистой оболочке желудка 81
2.6.3. Оценка системы «простагландины - циклические нуклеотиды» в слизистой оболочке желудка 82
2.6.4. Оценка состояния микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка 82
2.6.5. Электронно-микроскопическая оценка структурно-функциональных особенностей лимфоцитов в слизистой оболочке желудка больных с язвенной болезнью и животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами желудка 83
2.7. Исследования иммунного (цитокинового) статуса организма 84
2.7.1. Иммунологическое изучение слизистой оболочки желудка 84
2.7.2. Оценка морфофункционального состояния органов иммунной системы 84
2.7.3. Исследование цитокинового статуса в сыворотке крови 84
2.8. Статистическая обработка результатов 85
Глава 3. Прекулътивирование клеток костного мозга - как способ восстановления функциональной и биорегуляторной активности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутологичного костного мозга 86
3.1. Фенотипическая характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крысы (определение однородности культуры ММСК), предназначенных для трансплантационного лечения язвенной болезни 86
3.2. Культивирование как способ восстановления функциональной активности клеток аутологичного костного мозга у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами 87
Глава 4. Местные и системные патогенетические нарушения в организме при фрмировании длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка 93
4.1. Патоморфология аутоиммунной язвы желудка 94
4.2. Апоптоз эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка как индикатор хронического течения аутоиммунных язв желудка 95
4.3. Нарушения микроциркуляции при моделировании аутоиммунных язв желудка 98
4.4. Дисрегуляция системы «простагландины - циклические нуклеотиды» при язвообразовании 99
4.5. Цитокиновый дисбаланс как фактор развития и хронизации язвенной болезни 101
4.6. Морфофункциональное состояние органов иммуногенеза в процессе развития длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка 105
4.7. Цитотоксический эффект лимфоцитов в слизистой оболочке желудка при длительно незаживающей аутоиммунной язве желудка 107
4.8. Аутоиммунные факторы в патогенезе длительно незаживающих экспериментальных язв желудка 118
Глава 5. Влияние трансплантации культивированных клеток костного мозга на заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка 122
5.1. Влияние ММСК и МНК аутологичного КМ на динамику заживления язв и морфологическое состояние слизистой оболочки желудка 122
5.2. Влияние ММСК КМ на активность апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка в динамике лечения 133
5.3. Влияние ММСК КМ на систему «простагландины - циклические нуклеотиды» в регуляции процессов регенерации и цитопротекции в слизистой оболочке желудка 137
Глава 6. Влияние ммск и мнк км на коррекцию иммунного дисбаланса при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка 141
6.1. Морфофункциональное состояние тимуса животных при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации ММСК КМ 141
6.2. Морфофункциональное состояние селезенки животных при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка при трансплантации ММСК КМ 144
6.3. Коррекция цитокинового дисбаланса при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации ММСК КМ 149
6.4. Морфофункциональное состояние тимуса животных при длительно незаживающих язвах желудка и трансплантации МНК КМ 151
6.5. Морфофункциональное состояние селезенки животных при длительно незаживающих язвах желудка и трансплантации МНК КМ 154
6.6. Коррекция цитокинового дисбаланса при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации МНК КМ
157
Глава 7. Влияние клеток костного мозга на стимуляцию неоангиогенеза и восстановление микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка 159
7.1. Динамика показателей микроциркуляции и ангиогенеза в слизистой оболочке желудка при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации ММСК КМ 159
7.2. Динамика показателей микроциркуляции и ангиогенеза в слизистой оболочке желудка при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации МНК КМ 164
Глава 8. Обсуждение полученных результатов 169
Заключение 205
Выводы 211
Практические рекомендации 214
Список литературы 216
- Регуляторные пептиды в комплексном лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки
- Технология получения, культивирования и подготовки для трансплантации мононуклеарной фракции клеток костного мозга
- Культивирование как способ восстановления функциональной активности клеток аутологичного костного мозга у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами
- Апоптоз эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка как индикатор хронического течения аутоиммунных язв желудка
Введение к работе
В последние 10-15 лет в связи с развитием клеточных технологий и пробудившимся в мире интересом к регенерационным возможностям стволовых клеток костного мозга, появилась возможность их легитимного применения у больных с тяжелой хронической патологией. Клеточные биотехнологии стали использовать для лечения острой хронической сердечной недостаточности [Шумаков В.И и др., 2003, 2004; Assmus В. et al., 2002], ряда гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний [Витязев Г.А., 1993; Шумаков В.И и др., 1995, 1998; Онищенко Н.А и др., 2006], острой и хронической печеночной недостаточности разного генеза [Parekkadan В. et al., 2007], длительно незаживающих язв, ран и олсогов [Колосов Н.Г и др., 2000; Расулов М.Ф., 2007; Badiavas Е. et al., 2003] и др.
Для клеточной трансплантации используют гемопоэтическую или стромальную фракции клеток аутологичного костного мозга (КМ), которые содержат стволовые и прогениторные клетки [Kusmartsev S. et al., 1998; Terrazas L. et al., 2001; Caplan A. et al., 1997]. Эффективность гемопоэтических клеток KM обусловлена иммунорегуляторной активностью, выделяемых ими биорегуляторных пептидов [Terrazas L. et al., 2001]. Эффективность стромальной фракции клеток КМ, обусловлена не только тем, что эти клетки секретируют широкий спектр цитокинов и ростстимулирующих факторов, но и тем, что являясь предшественниками мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), они способны активно пролиферировать в культуре, дифференцироваться в мезенхимальные клетки других фенотипов и непосредственно участвовать в процессах восстановительной регенерации поврежденных тканей [Потапов И.В и др., 2005; Amado L. et al., 2005; Parekkadan В. et al., 2007; Caplan A. et al, 2008]. Кроме того, известно, что ММСК КМ могут участвовать в регуляции дифференцировки Т-клеток, вызывают супрессию пролиферации эффекторных клеток (цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров), а таклсе, ограничивают дифференцировку дендритных клеток [Fallarino F. et al., 2002; Aggarwal S., 2005], способствуя ингибированию системной воспалительной реакции.
Именно благодаря регуляторным эффектам пептидов, продуцируемых клетками КМ, оказалось оправданным их применение при лечении многих хронических заболеваний, сопровождающихся угнетением репаративных процессов, иммунной дизрегуляцией и развитием вторичного иммунодефицита [Шумаков В.И и др., 2004; Расулов М.Ф., 2007; Parekkadan В. et al., 2007].
К таким заболеваниям относится и язвенная болезнь (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки (ДНК), поиск путей повышения эффективности лечения которой является по - прежнему актуальной задачей современной медицины, ибо ЯБ остается одним из самых распространенных и социально значимых хронических рецидивирующих заболеваний желудочнокишечного тракта по срокам временной и стойкой нетрудоспособности [Ивашкин В.Т., 2004., Васильченков А.В., 2006; Захараш М.П и др., 2009].
При ЯБ желудка и ДИК имеет место местный иммунный дисбаланс, в результате чего начинает реализовываться патогенное действие Helicobacter pylori (Нр), которые часто (до 80-90%) бессимптомно инфицируют слизистую желудка и ДПК [Мансуров Х.Х., 2005; Васильченков А.В., 2006; Borody Т., 2002], но в условиях иммунодефицита предопределяют хроническое течение заболевания [Логинов А.С., 1998; Циммерман Я.С, 2000].
Пораженная ткань в области язвенного дефекта настолько изменяет индивидуальную биологическую принадлежность, что приобретает свойства аутоантигена [Чернин В.В., 2000], а в условиях иммунодефицита становится фактором активизации и прогрессирования аутоиммунных процессов, отягощающих течение заболевания и развитие осложнений [Кириченко Б.Б., 1990]. Дизрегуляция иммунной системы поддерживает деструктивновоспалительные изменения в зоне язвенного дефекта и ингибирует пролифератршно-репаративную фазу регенераторного процесса, что связано с нарушением не только синтеза структурных белков, но и синтеза молекул межклеточного взаимодействия (пептиды) [Потапова В.Б., 2004]. В этой связи, для улучшения результатов лечения через устранение дизрегуляции иммунной системы при ЯБ стали использовать пептиды селезенки, доставляемые в организм больного путем экстракорпорального подключения донорской свиной селезенки (ЭКПДС) или в виде нативных пептидов из селезенки свиньи (Спленопид) [Васильченков А.В., 2006], и клеток КМ
(Миелопид) [Михайлова Л.П., 1998]. Однако экстракорпоральное подключение донорской селезенки свиньи связано с организационными трудностями заготовки донорского материала, а также с иммунологическими проблемами и опасностью переноса трудно диагностируемых инфекций у животных. Применение нативных пептидов (Спленопид, Миелопид) ограничивается их ксенногенным происхождением, а таюке необходимостью курсового применения препаратов, производство которых имеет ограниченные масштабы и пока не может обеспечить потребности всех больных. Кроме того, все еще присутствует опасность переноса трудно диагностируемых инфекций.
Для клеточной терапии ЯБ желудка и ДПК использовали также трансплантацию фетальных клеток печени, селезенки и тимуса [Стрункин Д.Н. и др. 2000]. Однако применение фетальных клеток остается нелегитимным в связи с нерешенностью этических и юридических проблем забора и использования этого материала.
Выше изложенные ограничения побудили нас для стимуляции устойчивого заживления хронических язв желудка через регуляцию местных и системных иммунных механизмов репаративного морфогенеза - использовать регенерационные возможности стволовых клеток, и прежде всего, ММСК КМ, из-за возможности их легитимного и аутологичного применения.
Однако, приступая к этим исследованиям, мы не обнаружили работ, касаюш;ихся применения клеток аутологичного костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка. Кроме того, мы не только не обнаружили сведений о влиянии клеток костного мозга на состояние показателей иммунного (цитокинового) статуса организма и на связь иммунного (цитокинового) дисбаланса с состоянием регенераторных процессов в слизистой оболочке желудка, но и не обнарул<или адекватной модели аутоиммунных длительно незаживающих язв желудка для изучения этих вопросов.
Отсутствие в литературе выше указанных сведений и важность учета их для разработки эффективной терапии длительно незаживающих язв желудка позволили нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы.
Изучить и обосновать целесообразность трансплантации в слизистую оболочку желудка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга для обеспечения устойчивой регенерации длительно незаживающих язв желудка Задачи исследования:
1. Создать модель длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка, изучить иммунопатологические механизмы развития язвенной болезни и выбрать наиболее информативные показатели для контроля эффективрюсти клеточной терапии длительно незаживающих язв желудка.
2. Отработать технологию выделения клеток из аутологичного костного мозга, идентифицировать в культуре получение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и показать целесообразность их предварительного культивирования у больных животных для восстановления функциональной и биорегуляторной активности этих клеток.
3. Изучить особенности процессов репаративной регенерации длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка (ДНЯЖ) при трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных и мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного костного мозга.
4. Показать на моделях ДНЯЖ взаимосвязь активизации регенераторных процессов в язве желудка с присутствием в ней трансплантированных клеток.
5. Изучить влияние ММСК костного мозга на состояние микроциркуляторного русла, содержание биологически активных веществ (ПГЕ2) и циклических нуклеотидов, а также на апоптоз эпителиоцитов в слизистой оболочки желудка при ДНЯЖ и клеточной терапии.
6. Установить влияние клеток аутологичного костного мозга на коррекцию иммунного (цитокинового) статуса и восстановление морфофункциональных компартментов органов иммуногенеза (тимуса и селезенки) у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами при клеточной терапии.
7. Установить предпочтительность использования прекультивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток или мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга в качестве наиболее эффективного средства патогенетической терапии у больных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами желудка и двенадцатиперстной кишки.
Научная новизна. В настоящей работе, выполнявшейся в рамках программы «Клеточные технологии - медицине» по заданию Росздрава (регистрационный номер - 01.2.00 305442) впервые представлены патогенетически обоснованные результаты применения прекультивированных клеток аутологичного костного мозга для эффективного лечения длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка.
Впервые разработана модель аутоиммунной длительно незаживающей язвы желудка, позволяющая изучить иммунопатологические механизмы развития хронической язвы в слизистой оболочке желудка и влияние на них клеточной терапии.
Впервые в эксперименте для ускоренного заживления аутоиммунных ДНЯЖ применены культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных и мононуклеархгых клеток аутологичного костного мозга и выявлена предпочтительность (более высокая эффективность) ММСК. Показано, что при использовании клеток аутологичного костного мозга при лечении ДНЯЖ необходимо проводить предварительное культивирование этих клеток для восстановления их биорегуляторной активности; ингибированной хроническим заболеванием. Установлен оптимальный срок культивирования ММСК костного мозга (9-12 суток) при котором восстанавливается до нормы цитокиновый баланс и пролиферативная активность клеток. С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора (содержащего LacZ ген Е.соИ), внедренного в клетки (аутологичные ММСК) на этапе культивирования, доказано, что ускорение темпа регенерации ДНЯЖ после трансплантации клеток костного мозга связано с присутствием и функционированием (продукция факторов роста,
цитокинов) их в зоне язвенного дефекта (в сроках не менее 30 суток).
Установлено, что аутологичные прекультивированные ММСК КМ, трансплантированные в зону язвенного дефекта ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ (сокращение сроков и выраженности деструктивновоспалительной фазы и активизации пролиферативно-регенераторной фазы язвенного процесса) и это происходит за счет усиления ангиогенеза и улучшения микроциркуляции, активизации регенерационных процессов (восстановление регуляции в системе «простагландины - циклические нуклеотиды») и ингибирование активности апоптоза.
ММСК и МНК костного мозга устраняют иммунный (цитокиновый) дисбаланс в организме и восстанавливают морфофункциональные компартменты органов иммуногенеза (тимус и селезенка), дисфункция которых развивается при хронической длительно незаживающей аутоиммунной язве желудка и становится фактором ее хронического течения.
На клиническом и экспериментальном биопсийном материале иммуногистохимически и электронно - микроскопически подтвержден цитотоксический эффект лимфоцитов (CD8+;CD16+) в отношении фибробластов собственной пластинки слизистой оболочки желудка и установлено снижение активности молекулярного маркера (F0XP3), что подтверждает важное патогенетическое значение глубокой иммунной дизрегуляции в организме при развитии ДНЯЖ. Практическая значимость работы. Разработана модель аутоиммунной длительно незаживающей язвы желудка у крыс, на которой могут быть изучены иммунопатологические механизмы развития хронических язв лселудка, типичных для патологии человека. Разработанная модель может быть использована для скрининга медикаментозных препаратов, пригодных для лечения язв желудка, а также для разработки оптимальных режимов применения клеточной терапии.
Установлена необходимость и оптимальные сроки прекультивирования клеток костного мозга при аутологичном применении для эффективного лечения ДНЯЖ. Показано, что аутологичныи костный мозг после предварительной подготовки может служить источником оптимального биоматериала для эффективной клеточной терапии ДНЯЖ, так как клетки костного мозга, особенно ММСК, продуцируюет широкий спектр разнообразных биорегуляторных пептидов и факторов роста и способны возместить дефицит их регуляторных функций в организме у больных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами.
Показана необходимость включения в комплексную терапию язвенной болезни иммунокорректоров, так как доказано, что в патогенезе ДНЯЖ иммунопатологические (аутоиммунные) механизмы занимают ведущую роль.
Положения, выносимые на защиту. Предварительное культивирование клеток костного мозга in vitro - важный этап подготовки клеток при проведении клеточной терапии хронической длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка, так как устраняет дисрегуляторное влияние на них хронического патологического процесса и восстановливает биорегуляторную активность.
Культивированные in vitro и трансплантированные в слизистую оболочку желудка аутологичные ММСК или МНК КМ, ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ за счет быстрой смены фаз язвенного процесса: сокращения сроков и выраженности деструктивно-воспалительной фазы и активизации пролиферативно-регенераторной фазы язвенного процесса, что обусловлено длительным (30 суток- срок исследования) функционированием их в зоне язвенного дефекта.
Трансплантированные клетки костного мозга (ММСК и МНК) способствуют эффективной регенерации ДНЯЖ путем усиления процессов ангиогенеза и микроциркуляции в слизистой оболочке желудка, регуляции иммунного (цитокинового) гомеостаза в организме, местной регуляции системы «простагландины - циклические нуклеотиды» и апоптоза эпителиоцитов Внедрение результатов работы. Разработанная модель экспериментальной язвы желудка с аутоиммунным компонентом и водно - солевой антиген для ее моделирования внедрены и используются в научно - исследовательской работе: лаборатории патологической физиологии ГУ ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г. Москвы; в лаборатории иммуноморфологии воспаления ГУ НИИ морфологии человека РАМН, г.Москва; в лаборатории клеточных технологий ГУН Центр биомедицинских технологий РАМН, г.Москва. Результаты экспериментальной работы используются в лекционном курсе на кафедре трансплантологии и искусственных органов ММА им. И.М. Сеченова, а также приняты за основу при разработке медицинских клеточных технологий для лечения пациентов с ЯБ в ГУ ГКБ им. П.Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы.
Апробация диссертации. Апробация работы состоялась 7 октября 2008 года на межлабораторной конференции в ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи.
Основные положения работы доложены и обсуждены: на Международной конференции «Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов» (Казахстан, г. Астана, ноябрь 2005г.); на Усъезде Научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, март 2007г.); на Научной конференции «Клеточные технологии в травматологии и ортопедии» (г.
Москва, апрель 2007); на Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (г. Москва, май 2007); на 8 съезде Научного общества гастроэнтерологов России (г.Москва, март 2008); на 15 Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, апрель 2008); на Ежегодной Всероссийской и мелсдународной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (г.Москва, май 2008); на Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (г.Москва, июнь 2008); на Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященной 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ (г.Самара, июнь 2008); на 4 Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И.Шумакова (г. Москва, 9-10 ноября 2008); на 9 съезде Научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, 2-5 марта 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 работ, в том числе 10 работ в центральной печати и 2 главы в монографии. По теме диссертации получены решения о выдаче патента на 2 изобретения: № 2007128128 от
11.11.2008г. Способ моделирования аутоиммунного гастрита; № 2007128125/14 (030614) от 09.02.2009г. Способ моделирования аутоиммунной язвы желудка.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 251 странице компьютерного текста. Состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы (492 источника, из них 277 - отечественных и 215 - зарубежных). Работа иллюстрирована 61 рисунком и 17 таблицами.
Регуляторные пептиды в комплексном лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки
Так как иммунная система ответственна за поддержание структурного гомеостаза и процессы восстановительной регенерации в организме [Бабаева А.Г., 1985, 1995, 1998, 1999, 2001; Онищенко Н.А., 1999, 2000], то это дает основание полагать, что иммунный дисбаланс подавляет механизмы восстановительной регенерации, ингибируют процессы синтеза структурных белков в различных тканях организма, в том числе в слизистой оболочке желудка.
Индикаторами ингибирования восстановительных процессов в зоне язвенного дефекта могут служить цитотоксический эффект лимфоцитов, повышенный апоптоз лимфоцитов и нарушение микроциркуляции в зоне язвенного дефекта, цитокиновый дисбаланс в организме [Хавинсон В.Х и др., 2003, Ковальчук Л.В. и др., 1997, 2003], а также известные сведения о том, что стрессорное повреждение (острое и хроническое) и дизадаптация организма всегда ведут к ингибированию процессов синтеза структурных белков в функционально зависимых системах организма [Пшенникова М.Г. 2002, Gobert et al. 2002; Menaker et al. 2004; Galgani et al. 2004].
В этих условиях (хроническое стрессорное повреждение), когда ингибированы синтетические и репаративные процессы устранение иммунного и цитокинового дисбаланса, может быть достигнуто либо путем введения в организм готовых информационных молекул - биорегуляторных пептидов иммунной системы, либо путем трансплантации молодых клеток с высокой пролиферирующей активностью из органов, гомологичных поврежденным или из органов непосредственно участвующих в их регенерации [Онищенко Н.А. и др. 2006].
Только молодые развивающиеся клетки, находящиеся на ранних стадиях своего онтогенеза, способны - с одной стороны за счет присущего им хоминга - встроиться в гомологичную поврежденную ткань, а с другой - за счет вырабатываемого ими комплекса цитокинов (интерлейкины, хемокины, тканеспецифические пептиды, факторы роста и др.) информационно индуцировать процессы межклеточного взаимодействия и обновления имеющихся клеток, способны изменить программу их клеточного цикла, ингибируя механизмы клеточного апоптоза [Онищенко Н.А., Цыпин А.Б. 2001; Хавинсон В.Х. и др. 2003; Репин B.C. 2004; Онищенко Н.А. и др. 2006].
Такой подход к пониманию механизмов пептидной биорегуляции восстановительных процессов в поврежденных органах позволил разработать и получить иммуномодуляторы пептидной природы из костного мозга (Миелопид) [Михайлова А.А., Петров Р.В., 1998] и ткани селезенки (препарат «Спленопид») [Цыпин А.Б., Онищенко Н.А., Мануйлов Б.М. и др., 1995], а также изучить и отметить эффективное влияние последнего на восстановительные процессы в поврежденных органах, в том числе при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Васильченков А.В., 2006].
Эффективность использования селезенки и пептидов из него в комплексном лечении многих заболеваний [Цыпин А.Б., 1984, 1998, 2000; Мануйлов Б.М., 1986; Стяжкина С.Н. и др., 1991; Чаплинский Р.П., 1991; Бельков А.В. и др., 1992; Черных Е.Р. и др., 1994, 2000; Шумаков В.И. и др., 1995; Верхнев А.В., 1996; Наймушина Е.С., 1999; Андрукович Ф.Ф., 2000; Онищенко Н.А., 1999, 2000; Стяжкина С.Н. и др., 2004; Васильченков А.В., 2006] обосновывалось тем, что, будучи важным органом иммуногенеза, селезенка подобно плодным тканям и клеткам костного мозга, даже во взрослом организме, содержит стволовые клетки и сохраняет достаточно высокий уровень обновления своего клеточного состава [Онищенко Н.А., 1999]. Именно поэтому селезенка является мощным источником цитокинов и ростовых факторов - индукторов восстановительных процессов в клетках паренхиматозных органов. Кроме того, было показано, что Т-лимфоциты, которые служат в организме переносчиками регенерационной информации паренхиматозным клеткам нелимфоидных органов [Бабаева А.Г., 1972, 1985, 1987, 1988, 1995, 1998, 1999, 2001, 2003; Онищенко Н.А., 1999], завершают свое превращение в иммунокомпетентную клетку в селезенке, становясь способными к кооперативному взаимодействию с В-лимфоцитами при клеточно-опосредованном гуморальном иммунном ответе. Это обстоятельство и предопределило тот факт, что на протяжении последних 20 лет спленотерапия животными тканями стала интегральной частью комплексного лечения острой и хронической недостаточности функций жизненно важных органов, формирование которых всегда развивалось на фоне выраженного иммунодефицита [Онищенко Н.А., 1995, 1999, 2000, 2001, 2006].
В исследовании А.В.Васильченкова (2006) при курсовом применении пептидов из донорской селезенки свиньи в комплексном лечении язвенной болезни желудка и 12 перстной кишки было констатировано, что пептиды донорской селезенки более чем в 2 раза сокращают сроки исчезновения болевого и диспептического синдромов, более чем в 2 раза сокращают сроки рубцевания язв и существенно снижают частоту возникновения рецидивов. После проведения спленотерапии рецидивы ЯБ снизились в течение 1 -го года до 3,6%, в течение 2-х лет до 17,3%о, а в течение 3-х лет - до 22,4%), тогда как в контрольной группе рецидивы составили 31,7%), 84,3% и 86,8% соответственно. Местное применение пептидов селезенки (препарат Спленопид) путем обкалывания язв способствует ускоренному снижению воспалительно - клеточной инфильтрации слизистой, стимулирует переход деструктивной фазы воспаления в репаративную, увеличивает число клеточных митозов, улучшает трофические процессы и способствует эрадикации Нр в 92,7% наблюдений (в контроле 84,6%).
Технология получения, культивирования и подготовки для трансплантации мононуклеарной фракции клеток костного мозга
Мононуклеарную фракцию клеток получали из аспирата костного мозга животных. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала болыпеберцовых костей получали клетки костного мозга путем промывания полости этих костей фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин 3-5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NH4C1, 7,5 мМ КНСОз, 100 мкМ EDTA) в течение 5 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде IMDM (Gibco, USA), содержащей 10% бычью эмбриональную сыворотку («HyClone», USA), инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гентамицина.
Эти клетки, представляли собой первичную культуру, преимущественно мононуклеарных клеток КМ, которые затем высаживали в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл на чашки Петри при 37С в С02-инкубаторе, в атмосфере воздуха с 5% С02 и 95% влажности для культивирования с целью очистки и повышения функциональной и биорегуляторной активности этих клеток.
На 3-сутки инкубации среду полностью заменяли на среду IMDM (Gibo, USA), содержащую 10% бычьей сыворотки («HyClone», USA), инсулин 0,4 мкМ/л, дексаметазон 10 нМ/л, а также основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20нг/мл («Sigma», USA), а на 5-6 сутки культивирования освобождались от пластикадгезивных клеток, относящихся к фракции стромальных клеток. В результате очищенная культура мононуклеарных клеток была готова для трансплантации животному с ДНЯЖ и применялась для обкалывания язв в количестве 6 млн. клеток в 0,5 мл физиологического раствора.
Получение аспирата клеток костного мозга, его обработку лизирующим раствором, отмывание, центрифугирование и посев на культуральный пластик в ростовой среде IMDM описано выше (см. раздел 2.2.1). На 3-4 сутки инкубации среду полностью заменяли на среду IMDM (Gibo, USA), содержащую кроме 10% бычьей сыворотки («HyClone», USA), инсулина 0,4 мкМ/л, также дексаметазои 10 нМ/л, и основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20нг/мл («Sigma», USA), для стимуляции пролиферативной активности ММСК, содержащихся в суммарной фракции ККМ. В результате на 6-1 сутки культивирования ММСК КМ формировали на дне чашки Петри адгезированные колонии мезенхимальных клеток. Поскольку в культуре содержалось также большое количество ошаренных неприкрепившихся клеток (в основном гемопоэтические мононуклеарные клетки), их элиминировали во время смены среды. Смену среды проводили каждые 3-е суток.
На 12-14 сутки культивирования на чашках Петри возникали колонии ММСК (рис. 2), образующих примерно 80-90% монослой с фибробластоподобной морфологией. Эти клетки смывали после трипсинизации, идентифицировали и количественно стандартизировали. Полученная культура ММСК КМ была готова для трансплантации животному с ДНЯЖ и применялась для обкалывания язв в количестве 4 млн. клеток в 0,5 мл физиологического раствора.
Перед моделированием ДНЯЖ проводили забор материала (ткань желудка) и готовили из него водно - солевой антиген. Для этого:
Животных, отобранных для забора и приготовления водно - солевого антигена (из ткани желудка) в течение 10 час. содержали в условиях прекращения доступа к пище; затем после обработки операционного поля по Филончикову-Гроссиху производили операцию - лапаротомию и гастрэктомию.
Материал (желудок) переносили в стерильную чашку Петри. Затем вскрывали желудок по большой кривизне, после чего дважды его аккуратно промывали в стерильном физиологическом растворе. Желудок переносили в другую стерильную чашку Петри, где скальпелем проводили забор слизистой оболочки желудка (путем соскабливания).
Готовили гомогенат слизистой оболочки желудка, который смешивали с физиологическим раствором в соотношении 1:4 и пропускали через фильтр с целью удаления крупнодисперсных частиц ткани желудка. Полученный водно - солевой антиген в соотношении 1:2 смешивали с полным адъювантом Фрейнда и ресуспендировали до достижения однородной массы. Полученный гомогенат хранили при температуре 4-6С до его применения. Перед использованием водно - солевого антигена в обязательном порядке в течение 1 минуты проводили ресуспендирование для эффективного смешивания с адъювантом Фрейнда и достижения однородной массы, и в этом виде доставляли в операционную для введения (иммунизации). Перед моделированием длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка проводили профилактический осмотр отобранных животных с целью исключения у них различных сопутствующих заболеваний. Моделирование ДНЯЖ, равно как и забор материала для приготовления водно - солевого антигена осуществляли у крыс под ингаляционным эфирным наркозом, из расчета 50 мг/кг; при этом животные находились на спонтанном дыхании, частота которого составляла 70±9 дыхательных циклов в минуту (хирургическая стадия наркоза).
Культивирование как способ восстановления функциональной активности клеток аутологичного костного мозга у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами
Известно, что функциональное состояние клеток КМ (ККМ) находится под контролем факторов внутренней среды организма, которые при патологических состояниях ингибируют функциональную активность ККМ [Гольдберг Е. Д. и др., 2006; Дыгай и др., 2007]. Другими словами, в организме больного аутологичные ККМ либо существенно ослабевают, либо даже утрачивают свои терапевтические регулирующие функции.
Для восстановления гомеостаз - регулирующих функций ККМ, а также для восстановления силы и качества регенераторных сигналов, посылаемых этими клетками в очаги повреждения (восстановление миграционной и репопуляционной активности), мы считали необходимым, прежде всего, вывести ККМ из-под воздействия ингибирующих и токсических факторов, циркулирующих в крови больного, и оздоровить их, подвергнув культивированию ex vivo (или in vitro) в культуральных питательных средах.
Это связано с тем, что при моделировании патологических состояний возникает не только запланированное хроническое повреждение органов-мишеней, но и одновременно токсическое или стрессорное повреждение ККМ, что исключает возможность непосредственного использования таких клеток для регенерационной терапии. В работе В.И.Шумакова и Н.А.Онищенко (2003) установлено, что прекультивирование мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга является обязательным условием восстановления их функциональной активности. И этот срок равен 5-7 суткам культивирования (оценивали по изменению фенотипического состава лимфоидных клеток). Основываясь на эти данные, мы также считали, что срок 5-7 суток культивирования является достаточным для восстановления функциональной и биорегуляторной активности этих клеток.
Наше исследование было посвящено определению оптимальных сроков культивирования ММСК из аутологичного костного мозга, полученных от животных с ДНЯЖ для восстановления их функциональной и биорегуляторной активности.
О восстановлении исходно сниженной биорегуляторной активности ММСК костного мозга в процессе культивирования судили по изменению популяционной активности этих клеток (по скорости образования монослоя клеток в культуре), используя в качестве базовой культуральной среды среду Iscov s (DMEM), содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки; 0,4 мкМ инсулина; 0,05 мкг/мл этаноламина; 25 мМ HEPES; 10 мкМ 2-меркаптоэтанола; 50 мкг/мл гентамицина. На рис. 7 представлена динамика изменения популяционной активности пластикадгезивных клеток, полученных из смешанной культуры ККМ животных (крыс) с длительно незаживающими аутоиммунными язвами желудка. Из этого рисунка видно, что период формирования монослоя ММСК, полученных от животных с язвенной болезнью был пролонгирован во времени и даже на 12 — 13 сутки не достигал 100%) монослоя по сравнению с периодом формирования 100% монослоя ММСК у интактных крыс (9 суток).
Микроскопически оценивали также состояние клеточных культур и подсчитывали популяционную активность: выживаемость и жизнеспособность по окраске клеток трипановым синим. Результаты этих исследовании представлены на рис. 8.
По морфологии клеток на микрофотографиях отчетливо видно, что ККМ от животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами желудка вначале ингибированы и пролиферация этих клеток по сравнению с контрольными культурами резко заторможена.
Однако, начиная с 9-10 суток культивирования, при постоянной смене среды (каждые 3 дня) в культурах клеток костного мозга от животных с ДНЯЖ наблюдается высокая пролиферативная активность и к 13-14 суткам формируется почти 90-95% монослой ММСК (рис.9).
Эти результаты свидетельствуют о том, что культивирование клеток костного мозга является важным этапом подготовки клеток, необходимым для устранения предсуществующих стрессорных изменений и восстановления их функциональной активности. Прекультивированные клетки считались нами нормализованными и становились пригодными для стимуляции процессов репаративной регенерации при лечении ДНЯЖ.
Поскольку одним из факторов восстановления биорегуляторной активности ККМ должно быть восстановление баланса продукции этими клетками про- и противовоспалительных цитокинов, то мы считали, что динамический контроль накопления в культуральной среде исследуемых цитокинов позволит судить о степени восстановления этими клетками биорегуляторной активности. Измеряя в динамике накопление про- (IFNy, TNFa, IL-ip) и противовоспалительных (TGFJ3, IL-4,IL-10) цитокинов в среде культивирования СККМ крыс с хронической аутоиммунной язвой желудка мы отметили (рис.10), что начиная с 6 суток культивирования, судя по измеряемым показателям, ММСК освобождаются от влияния системного воспаления, которое имело место в организме, а уже к 12 суткам (когда развивается клеточный монослой) формируется нормальное соотношение
Апоптоз эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка как индикатор хронического течения аутоиммунных язв желудка
У животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами желудка нами были отмечены дистрофические процессы в слизистой оболочке желудка раличной степени выраженности. Уровень экспрессии маркера апоптоза - каспазы 9 в эпителиоцитах слизистой оболочки желудка животных с аутоиммунной язвой желудка оказался высоким. Соответственно имел место высокий индекс апоптоза эпителиоцитов в трех компартментах (покровно-ямочном эпителий, перешеечная зона и основание желез) (табл.8). Таблица 8. Индекс апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка животных (М±т) на 40 сутки моделирования язвы желудка
Гистологически эпителий был резко уплощен, разрыхлен. На множественных участках эпителиальные клетки отслаивались от базальной мембраны и были резко апоптозно изменены (рис.12А). Процессы апоптоза наблюдались как в эпителии, так и в подслизистой основе, в ямках, железах и клетках, участвующих в деструктивном язвенном процессе, что отмечалось по интенсивной окраске ядер и наличию множества апоптозных телец (рис.12Б). В собственной пластинке слизистой оболочки желудка также определяются апоптозные тельца фундальных желез (рис. 12В).
Таким образом, мы убедительно показали, что при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка имеет место дизрегуляция процессов программируемой гибели эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка, что свидетельствует о глубоком рассогласовании процессов аутоиммунного воспаления, апоптоза и регенерации, в результате чего аутоиммунные язвы приобретают хроническое течение, без признаков заживления. Наши исследования показали, что возникновение аутоиммунной язвы желудка связано не только с непосредственным повреждением слизистой и подслизистой слоев стенки желудка, но и с вторичными нарушениями в ней микроциркуляции.
Так, проведенная нами электронная микроскопия экспериментальной аутоиммунной язвы желудка выявила в дне и краях язв выраженные изменения кровеносных сосудов. В зоне некроза в артериях наблюдаются воспалительные изменения стенок, фибринозный некроз и тромбоз сосудов. Отмечаются участки, где повреждены все слои стенки сосудов, значительное утолщение их интимы и облитерация их просвета. Выявлены изменения артерий, соответствующие картине продуктивного эндартериита. В венах выявлен выраженный склероз стенок, гиперэластоз и сужение просвета.
Проведенное исследование микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка в зоне язвенного дефекта методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) показало, что язвы желудка характеризуются снижением микроциркуляции в зоне язвенного дефекта. Показатель микроциркуляции (ПМ) был снижен во всех исследуемых нами зонах язвенного дефекта (табл. 9). Как видно из таблицы 9 показатели микроциркуляции при язве желудка были резко снижены.
Наряду с резко сниженными показателями микроциркуляции при хронической язве желудка методом ЛДФ выявляется также и резкое снижение амплитудных характеристик микроциркуляции (рис. 13). Таким образом, мы установили, что формирование хронических аутоиммунных язв желудка сопровождается нарушением микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка, что способствует нарушению трофики ткани и торможению процессов репаративной регенерации. Одним из наиболее важных элементов защиты слизистой оболочки являются эндогенные простагландины (ПГ), цитопротективный эффект которых связан с мобилизацией защитных факторов и реализуется при непосредственном участии регуляторов внутриклеточной адаптации -циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ) [Федоров Н.А. и др., 1990; Robert A. etal., 1991]. Наши исследования показали, что формирование деструктивно - язвенного процесса в слизистой оболочке желудка при моделировании хронических язв желудка сопровождается снижением уровня циклических нуклеотидов в слизистой оболочке желудка на 40 сутки моделирования (в пмоль/г) (рис.14).
