Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о патогенезе сахарного диабета 2 типа и способах его коррекции 15
1.1. К патогенезу инсулиннезависимого сахарного диабета и его осложнений 16
1.2. Современные методы медикаментозной терапии инсулиннезависемого сахарного диабета 27
1.3. Клеточные технологии в коррекции клинических проявлений сахарного диабета 32
1.3.1. Терапия фетальными, неонатальными и взрослыми островковыми клетками поджелудочной железы 33
1.3.2. Коррекция стволовыми клетками 37
Глава II. Материалы и методы исследования 50
2.1. Характеристика экспериментального материала 50
2.2.Технология проведения культуральных исследований 56
2.2.1. Получение и ведение культур гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции) 56
2.2.2. Получение и ведение культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 58
2.2.3. Получение первичной смешанной культуры клеток костного мозга1 (без фракционирования и культивирования) 61
2.2.4. Подготовка клеточного материала для трансплантации 62
2.3. Методы исследования 63
2.3.1. Методы биохимического исследования крови 63
2.3.2. Методы морфологического исследования органов 65
2.3.3. Метод исследования гистосовместимости доноров и реципиентов...69
2.4. Методы статистической обработки 70
Глава III. Мутантные мыши линии C57BL/KsJYLeprdb/+ - генетическая модель сахарного диабета 2 типа 70
3.1. Клиническая и биохимическая характеристика генетической модели сахарного диабета 2 типа у мутантных мышей линии B/Ks-Leprdb/+ 70
3.2. Морфологические изменения в паренхиме внутренних органов при сахарном диабете 2 типа у мутантных мышей линии B/Ks-Lepr /+ 75
Глава IV. Трансплантация клеток костного мозга при сахарном диабете 2 типа на стадии выраженных патогенетических нарушений в организме (введение ККМ на 3 и 4 месяце после рождения) 84
4.1. Динамика показателей клинического состояния животных с сахарным диабетом 2 типа после введения аллогенных клеток костного мозга 84
4.1.1. Результаты однократного введения аллогенных клеток костного мозга черезЗмесяца после их рождения 84
4.1.2 Результаты многократного введения аллогенных клеток костного мозга мышам с сахарным диабетом.через 4 месяца после их рождения 89
4.2. Динамика показателей клинического состояния животных с сахарным-диабетом 2 типа после введения изогенных клеток костного мозга 95
4.3. Влияние клеток- костного мозга на коррекцию морфологических изменений в паренхиме внутренних органов у мышей с генетической моделью сахарным диабетом 2 типа 102
Глава V. Трансплантация клеток костного мозга при сахарном диабете 2 типа на начальной стадии формирования патогенетических нарушений в организме (введение клеток костного мозга на 30-35 день после рождения) 126
5.1. Динамика показателей клинического состояния животных с генетической моделью сахарным диабетом 2 типа 126
5.2. Морфологическая характеристика- паренхимы, внутренних органов у мышей с генетической моделью сахарным диабетом 2 типа на фоне раннего введения алло- или изогенных клеток костного мозга (через 30-35 суток после рождения) 134
Глава VI. Обсуждение полученных результатов 144
Выводы 156
Практические рекомендации 158
Литература 159
- Современные методы медикаментозной терапии инсулиннезависемого сахарного диабета
- Получение и ведение культур гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции)
- Морфологические изменения в паренхиме внутренних органов при сахарном диабете 2 типа у мутантных мышей линии B/Ks-Lepr /+
- Динамика показателей клинического состояния животных с сахарным-диабетом 2 типа после введения изогенных клеток костного мозга
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Успехи клеточной биологии последних десятилетий создали
научные и практические предпосылки для развития новой области
медицины - клеточной трансплантации. С разработкой учения о стволовых
клетках появилась надежда на возможность более эффективной регуляции
процессов восстановительной регенерации поврежденных органов и
тканей [Pittenger et.al., 1999; Jaiswal et.al., 2000;B.A. Отеллин, 1999; И.В.
Потапов и др., 2001; М.Ф. Расулов, 2004],а также восстановления
липидного, углеводного и белкового обменов [А.В. Берсенев, 2003; Hess et
al., 2003; Ende et al., 2002] в организме с помощью аутологичных или
аллогенных стволовых клеток костного мозга (ККМ). Особенно значимой
возможность осуществления восстановительной регенерации могла бы
быть для повышения эффективности лечения сахарного диабета (СД),
который является одним из наиболее распространенных хронических
заболеваний, приводящих к глубокой инвалидизации и гибели людей
трудоспособного возраста во всех странах мира [King Н. et al., 1998;
Mainous et al., 2004; И.И. Дедов и др., 2005]. Полагают, что особенно
выраженный рост заболеваемости СД в наступающем тысячелетии будет
иметь СД 2 типа в связи с прогрессирующим эпидемическим
распространением в человеческой популяции факторов,
предрасполагающих к его развитию: атеросклероза, проатерогенных метаболических синдромов и эндокринных нарушений [М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова и др., 2000; А.А. Александров, 2001; И.И. Дедов, М.В. Шестакова, 2003; Я.А. Александровский, 2005; И.Н. Бокарев и др., 2006]. Продолжающийся рост заболеваемости СД, несмотря на определенные достижения последних лет, свидетельствует о том, что ни профилактические мероприятия, ни современная медикаментозная терапия не способны надежно препятствовать возникновению и прогрессированию
7 клинических проявлений СД и его осложнений. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается актуальной проблемой современной медицины.
Приступая к своим исследованиям, мы полагали, что применение стволовых и прогениторных клеток костного мозга может оказаться особенно перспективными для лечения СД 2 типа, при котором инсулинорезистентная гипергликемия является первично мембранной патологией клеток и обусловлена конформационным изменением структуры мембран клеток в условиях развития* дислипидемии и эндокринных расстройств. [М.И. Балаболкин, 1994; А.Ш. Зайчик, Л.П. Гурилов, 2001; И.Н. Бокарев, _Б.К. Беликов и др., 2006]. Мы полагали также, что для- лечения СД 2 типа наиболее перспективным может оказаться использование, как стромальной, так и мононуклеарной-(гемопоэтической) фракций ККМ, которые содержат значительное количество стволовых и прогениторных клеток и поэтому способны индуцировать в*паренхиме поврежденных органовшроцессы репаративной регенерации, выделяя в процессе своей жизнедеятельности регуляторные пептиды, которые восполняют дефицит адекватных информационных и адаптационных сигналов регенерации [Н.А. Онищенко, 2004; Kinnaird et al., 2004].Однако исследований по коррекции ККМ нарушений при СД 2 типа ни в клинике, ни в эксперименте мы не обнаружили. Только в одной из работ [Ende et al.,2004] приводятся сведения об однократном введении ретроорбитально большой дозы ксеногенных ККМ' мышам без изучения влияния различных доз и типов ККМ, а также стадии развития болезни на результаты клеточной терапии. Одной из причин отсутствия в России исследований терапии СД 2 типа с помощью клеточных технологий, является отсутствие в« нашей стране охарактеризованной модели СД 2 типа, развивающейся у мутантных мышей линии C57BL/KsJYLepr /+. Отсутствие патофизиологической характеристики течения СД 2 типа у мутантных мышей этой линии и отсутствие данных об изменениях
клинических: проявлений? СД 2 типа у таких мышей под влиянием аллогенных или изогенных ККМ позволило нам сформулировать цели; и задачи настоящего исследования:
, .' '
Целью . настоящего исследования явилось изучение целесообразности использования: мутантных мышей линии G57BE/KsJYLeprdb/+ в качестве модели при проведении экспериментальных работ по коррекции сахарного: диабета Т типа методом трансплантации: клеток костного мозга.
Для достижения: указанной цели нами- были поставлены» следующие задачи:
1. Изучить динамику возникновения* клинических и морфологических нарушений^ присущих СД 2 типа, у мутантных, . мышей; линии; C57Bb/KsJYEepi\ /+ июбосновать пригодность использования ?их в «качестве экспериментальной^ модели? СД; 2 типа для оценки; терапевтической эффективности клеток костного мозга
2; Отработать методы выделения- - культивирования- или* трансплантации гемопоэтическоши стромальной фракций клеток костного мозга- для. выбора эффективного' способа коррекции? патогенетических нарушений при СД 2 типа.
Зі Оценить эффективность и безопасность трансплантации аллогенного и изогенного костного мозга пршкоррекции: метаболических нарушений у животных с СД 2 типа.
Установить сроки применения клеток костного мозга в зависимости от стадии развития болезни, а также дозу и кратность их введения для пролонгированной коррекции клинических: и метаболических (биохимических) нарушений, развивающихся при:СД;2 типа.
Установить значение фенотипа клеток костного мозга (гемопоэтическош или стромальной; фракций клеток), а также их гистосовместимости (изогенные и аллогенные клетки от здоровых
''.." 9
животных) для индукции;процессов,репаративной регенерации внутренних органов- (островковая ткань; поджелудочной железы, печень, почкщ лимфоидная ткань), участвующих в патогенезе ЄД 2 типа.
6. Выявить наличие функционально активных трансплантированных
клеток костного мозга (маркёр- GFP) * ві органах животных с ЄД12 типа на
длительных сроках наблюдениям(120 дней) и установить,связьприсутствия*
жизнеспособных клеток с восстановлением функции; поврежденных
органов; ,
Выполнение работы < осуществлялась в рамках государственного контракта № 021435:11.3019 от «02»сентября 2005г. «Использование, стволовых: клеток костного мозга: для? поддержания; функции сердца и поджелудочной? железы»;,; по> заказу Минздравсоцразвитияї РФ (регистрационный; номер* 0120Ю800280), а также в- рамках отраслевой; программы. «Новыеу клеточные технологии* - медицине» (01.07.2002-01.07.2010гг.)і утвержденнойс29і05102г.назаседании?президиума?РМк1Ні
Научная- новизна работы;
Впервые: была изучена и охарактеризована патофизиологическими методами генетическая;^ модель, ЄД 2 типа на' мутантных мышах линии C57BE/KsJLeprdb/+, пригодная для изучения; терапевтических эффектов клеток костного мозга: Полученная модель СД 2 типа в настоящее время поддерживается в ГУ НЦБМТ РАМН:
Было установлено, что развитие патологического процесса у этих мышей проходит 3; стадии: 1-я стадия (1-2 месяц со дня рождения) характеризуется! гипергликемией на фоне: гипертрофии и: гиперплазии островковЛангерганса в.поджелудочной железе (инсулинрезистентная); 2г я; стадиям (3-4 месяца^ со; дшг рождения) — характеризуется; нарушением; липидного? (ожирение) и; углеводного (гипергликемия) обменов и протекает на фоне снижения количества функционирующих р-клеток в
і і,
10 островках Лангерганса. На этой стадии возникают выраженные метаболические нарушения, сопровождающиеся структурными изменения внутренних органов. 3-я стадия (5-6 месяцы после рождения) СД 2 типа сопровождается кахексией, функциональными нарушениями во внутренних органах, которые прогрессируют и приводят к гибели животного.
Доказано, что эффективность коррекции патофизиологических нарушений у животных с СД 2 типа при трансплантации клеток костного мозга, находится в прямой зависимости введенных клеток от суммарной дозы и стадии развития патологического процесса в организме, но не зависит от использованного фенотипа клеток и их гистосовместимости.
Показана целесообразность трансплантации клеток костного мозга на? поздней стадии развития СД 2 для снижения темпов прогрессирования патоморфологических изменений во внутренних органах и пролонгирования сроков жизни животных.
Более выраженная эффективность от трансплантации клеток костного мозга показана на ранней стадии развития СД 2 типа, когда лучше сохранены, резервы адаптации островковых клеток поджелудочной железы, выраженность которых регулируется введенными клетками костного мозга от здоровых животных.
Показано, что нормализация углеводного обмена при использовании клеток костного мозга на ранних сроках СД происходит на фоне активации процессов адаптации и регенерации островковой ткани поджелудочной железы, что подтверждено иммуногитохимически по окраске хромогранином-А на присутствие нейроэндокринных клеток в островках и по окраске на антитела Ki-67 - маркер репликации ДНК (пролиферативной активности клеток), а также по результатам гистологических и морфологических исследованиям (гипертрофия, гиперплазия).
Доказано, что предварительное культивирование
трансплантируемых клеток костного мозга достоверно повышает
: її ' "'' ' '
эффективность коррекции метаболических и структурных нарушении изменений во внутренних органах у.животных с СД 2 типа.-
Показано, что аллогенные донорские клетки костного мозга линии мышей B10;GFP,. длительно сохраняют свою жизнеспособность в; организме реципиента (линия? C57BE/KJsXYLeprdb/+)i по.крайне мере: в течение 120 дней после трансплантации: и могут участвовать г в регуляции; восстановительного морфогенеза внутренних органовV (печень* почки, поджелудочная железа, лимфоиднаялтсань).
Практическая значимость работы.
Патофизиологические характеристики мышей мутантной линии. C57BIi/KsJYLeprdbAb, полученной, в* ГУ НЩБМТ РАМН; пригодны; для; изучения; патологических процессов; возникающих при развитии ЄД2 типа;
Было доказано, что данные животные (G57BE/KsJLeprdb/+) могут быть, использованы в; качестве экспериментальной модели- приїпроведении исследований с целью коррекции метаболических нарушенийіпригЄД 2 типах методами-клеточной терапии.
Трансплантация:аллогенных илишзогенных клеток костного мозгапри. коррекции метаболических нарушений; сопровождающих развитие СД 2 типа, является безопасной процедурой, ослабляющей клинические и морфологические проявления СД 2 типа, выраженность которых зависит от дозы используемых клеток и стадии их применения;
Показано, что Г стадия развития СД 2 типа является предпочтительной для применения клеток костного мозга, т.к. при этом имеет место максимально выраженный эффект коррекции клинических, биохимических и морфологических нарушений в« организме животных с ЄДІ 2 типа. Предпочтительно также применять, клетки? костного мозга либо * на- 1-ой* стадии СД; 2: (на 3-4 .неделе стабильной^ гликемии) однократно .в максимально; высокой- дозе (100млн;)> и/или, многократно^ (до 7 раз;, в суммарной дозе до 27,5 млн. клеток).
.. .12 '
Показано, что и на 2 стадии развития СД. 2 типа введение клеток костного мозга является целесообразным, т.к. ослабляет темпы развития необратимых нарушений в органах-и пролонгирует срокнжизни животных.
Обнаружение трансплантируемых клеток костного мозга, содержащих ген- GFP)'..Bi тканях реципиента (G57BIs/bCsJYbeprdb/+) в; течение длительного времени: (до 120 суток) позволяет предложить метод трансплантации клеток мышейлинииВШ.ОРР'для? контролирования процессов восстановительного морфогенеза,у животных с ЄД;2"типа.
ПОЛОЖЕНИЯ; ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
Предложенная генетическая модель сахарного диабета,мышей линит C57BE/KsJEeprd,7+ является; адекватной' моделью ЄД .2 типа;: так как она воспроизводит стадии нарушения; углеводного обмена, развитие дисфункции- островков> Лангерганса: в поджелудочной* железе, а: также патоморфологические: нарушения* во* внутренних органах, клинический, биохимический и морфологический: контроль, которых: может быть использован; для;поиска и оценки новых эффективных способов- лечения* этого заболевания; в том числе трансплантации клеток костного мозга.
Эффективность трансплантации: стволовых и прогениторных клеток костного мозга при СД 2' типа зависит от стадии клинических проявлений заболевания і (тяжести заболевания), количества используемых клеток и, степени их биорегуляторной; активности. Наиболее выраженный клинический эффект наступает при использовании высоких доз культивируемых клеток костного мозга от здоровых животных, трансплантируемых или однократно (ЮОмлн. клеток), или дробно многократно (27,5 млн. клеток).
На стадии выраженных клинических и патоморфологических нарушений? внутренних органов трансплантация клеток костного мозга.не1 нормализует: показатели углеводного обмена, но способствует замедлению-темпов развития: необратимого» повреждения в органах и увеличивает
13 сроки жизни животных с СД 2 типа (до 447 дней вместо 199 дней в контроле - СД 2 типа).
Введение клеток костного мозга на ранней стадии развития СД 2 типа длительно нормализует показатели углеводного обмена и стабилизирует массу тела за счет индукции процессов адаптации и их восстановительной регенерации (гипертрофия, гиперплазия) в островках Лангерганса, что отодвигает развитие необратимых повреждений внутренних органов и существенно, увеличивает сроки жизни животных (до 537±17,1 дней вместо 199 дней в контроле).
Клетки костного мозга после трансплантации сохраняются в организме реципиента в течение длительного времени (до 120 дней) и индуцируют процессы восстановительного морфогенеза внутренних органов.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены
на:
1. Научной конференции «Биомоделирование и биомедицина»
Москва-Столбовая, 25 мая 2006г.
Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 24-25 мая 2006г.
Научно-практической конференции «Проблемы клинической фармакологии и моделирования в фармакологии и биомедицине» Ростов - на - Дону, 19-20 сентября 2006г.
Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 30-31 мая 2007г.
Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 29 мая 2008г.
IV Всероссийском съезде трасплантологов, посвященный памяти акад. В.И. Шумакова, Москва, 9-10 ноября 2008г.
Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехногий 13 марта 2009г.
ПУБЛИКАЦИИ.
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 в центральном рецензируемом журнале.
Современные методы медикаментозной терапии инсулиннезависемого сахарного диабета
Лечение неосложненных форм ИНСД часто оказывается эффективным-, при соблюдении диеты с ограничением углеводов и жиров и режима физической нагрузки. Если не удаётся этими мерами поддерживать нормальные значения глюкозы в крови, назначают лекарственные препараты -пероральные сахаропонижающие средства, имеющие химическую различную структуру [Buse, 2000; М.И. Балаболкин, Е. М. Клебанова, 2001; А.С. Аметов, 2003; И.Н. Бокарев, Б.К. Беликов, 2006; Б.Л. Ємолянский, ВТ. Лифлянский, 2008]. Сегодня медицина располагает широким спектром лекарственных препаратов гипогликемизирующего действия среди них различают следующие: - бигуаниды; - тиазолидиндионовые препараты; -ингибиторы а-гликозидаз; - прандиальные (при приеме пищи) регуляторы гликемии (производные бензойной кислоты); - препараты сульфонилмочевины. Механизм действия препаратов,, указанных классов, различен, но в целом действие их направлено на устранение трех основных метаболических нарушений, приводящих к гипергликемии: - нарушений секреции И ПЖ, т.е. периферической инсулинорезистентности; - избыточной-продукции Г печенью. Кроме того, указанные классы препаратов - замедляют всасывание F в тонком кишечнике и за счет этого происходит уменьшение постпрандиального подъема гликемии.
Бигуаниды — один из наиболее распространенных классов- преоральных сахароснижающих препаратов- (метформин - препараты глюкофаг, сиофор; динормет и т.д.). Действие метформина [Bailey, Turner, 1996] связано с его специфическим влиянием на синтез и пул глюкозных транспортеров в клетке. Количество Г транспортеров (ГЛЮТ-1, ГЛЮТ-3 и ГЛЮТ-4) увеличивается под воздействием бигуанидов в плазматической мембране как адипатоцитов, так и моноцитов, что проявляется в улучшении транспорта Г через мембрану клетки (повышается транспорт Г в эндотелии и гладких мышцах сосудов, а также в мышце сердца). Именно этим эффектом объясняется потенцирующее влияние бигудинов на действие не только эндогенного, но и экзогенного И. Способность метформина усиливатьанаэробный гликолиз ВІ тонком кишечнике (диарею, диспепсические явления; снижение аппетита, вплоть до отвращения-к пище), сочетается с подавлением гликогенолиза в печени [De Fronzo, Goodman , 1995; В.И. Шумаков, Н.Н. Скалецкий, 1998]. При дистрофических и инфекционно-аллергических заболеваниях печени возможно токсическое влияние бигуанидов на печеночную паренхиму, что выражается в возникновении холестаза. Кроме того, при заболеваниях почек, бигуаниды приводят к снижению клубочковой фильтрации, к ретенции азотистых шлаков и тяжелой анемии.
Тиазолидиндионовые препараты - относятся к новому классу антидиабетических препаратов (троглитазон, пиоглитазон, розиглитазон). Данные препараты не стимулируют секрецию И но повышают чувствительность к нему периферических тканей, т.е. выступают в роле агонистов ядерных PPAR-y рецепторов (peroxisome proliferators-activated receptor). Активация PPAR-y рецепторов модулирует транскрипцию ряда генов, связанных с передачей эффектов И , и способствует проникновению Г и липидов в клетки. Помимо снижения уровня гликемии, эти препараты влияют на липидный- профиль (повышается уровень ЛПВП и снижается содержание ТрГ) [Дж. А. Колуэлл, 2007]. Из побочных эффектов указывают на возможность появления отеков, а также прибавку веса. Противопоказания: СД 1 типа; кетоацидоз; беременность; превышение нормы аланиновой трансферазы в 3 раза; острые, токсические и хронически активные гепатиты. Ингибиторы а-гликозидаз относятся к группе пероральных сахароснижающих препаратов - (акарбоза - глюкобай,, миглитол - диастобол). Эти препараты применяются с целью снижения всасывания углеводов из кишечника за счет угнетения активности ферментов, участвующих в переваривании углеводов [Lebovitz, 1998, 2001]. Помимо основного действия - ингибирования гликозидаз, ингибиторы а-гликозидаз улучшают периферическое использование глюкозы посредством увеличения экспрессии гена ГЛЮТ-4. Эта группа препаратов замедляет процессы последовательного ферментирования и всасывания углеводов по всему тонкому кишечнику, что приводит к снижению уровня пищевой (постпрандиальной) гипергликемии и облегчает достижение компенсации- углеводного обмена, то есть препараты этой группы являются антигипергликемическими, а не сахароснижающими [М.И. Балаболкин и др., 2002]. Основными побочными эффектами ингибиторов а-гликозидаз являются метеоризм и диарея. В связи с этим они противопоказаны пациентам с заболеваниями кишечника, проявляющимися синдромом мальдигестии и мальабсорбции, а также больным с дивертикулами, синдромом раздраженной кишки, язвенным колитом, болезнью Крона,, спаечной болезнью, грыжами брюшины различной локализации. Не применяют эту группу препаратов при беременности и лактации.
Производные бензойной кислоты - репаглинид (новором) - первый препарат этой группы. Препарат стимулирует секрецию И [Lebovitz, 1999], связываясь со своим собственным специфичным участком (молекулярная 36 кДа), являющимся частью АТФ-зависимого К-канала. Репаглинид in vitro (в отличие от препаратов сульфонилмочевины) не стимулирует секрецию И р-клетками при отсутствии в среде Г [Ни et al., 2000], но при концентрации Г выше 5ммоль/л оказывается в несколько раз более активный, чем препараты сульфонилмочевины. Другой особенностью репаглинида является скорость его действия. Его действие имитирует выработку И, стимулированную приемом пищи. Препарат быстро всасывается, что позволяет лучше регулировать уровень постпрандиальной гликемии [Keilson et al., 2000]. К положительным свойствам репаглинида можно отнести также то, что он не вызывает прямого экзоцитоза и не подавляет биосинтез И в Р-клетках. Все это ведет к значительно более медленному истощению р-клеток. Препарат инактивируется в печени, 90% выводится с желчью, у него нет кумулятивного эффекта. Применение производных бензойной кислоты противопоказано при СД I типа, кетоацидозе, беременности и кормлении грудью.
Получение и ведение культур гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции)
Забор( клеток костного мозга проводили у мышей-доноров под эфирным наркозом. Стерильно иссекали кости предплечья плеча, голени и бедра вместе с суставами и отделяли их от мышц. Далее кости обрабатывали в 70% спирте, стерильно ножницами отсекали суставы и с помощью шприца (1мл. и 2мл.), вымывали ККМ раствором Хенкса (без Са+ и Mg+") из костномозгового канала. Полученную суспензию клетками центрифугировали вместе с Ficoll-P (удельная плотность 1,077г/см ) для градиентного разделения в течение 5 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре 0=(22С). Затем надосадочную фазу удаляли путем отсасывания. Отмытую полученную интерфазу клеток мононуклеарной- фракции ресуспендировали в питательной ростовой среде DMEM (ПанЭко), содержащей 25мМ HEPES, 0,58 г/л глютамина, 100мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA), 5 мкг/л инсулина. Клетки культивировали во флаконах при +37С в ССЬ-инкубаторе, атмосфере с 5% ССЬ и 95% влажности в течение 4-х и 5-ти суток. Через 4-5 суток культура ККМ мышей содержала до 50% свободно плавающих в суспензии с питательной средой, округлых неприкрепившихся гемопоэтических клеток на разных сроках дифференцировки (гемопоэтические клетки, лимфоциты, моноциты) (рис. 3) и до 50% прикрепившихся к пластику распластанных фибробласто подобных клеток ММСК КМ. Неприкрепившиесяк пластику клетки отбирали и их затем использовали в опытах на животных для трансплантации как очищенную от стромальных (пластикадгезивных) клеток
Отдельные популяции гемопоэтических стволовых и прогениторных ККМ выявляли на проточном цитофлуориметре FC-500 (USA) с использованием комбинации крысиных моноклональных антител (МАТ) к дифференцировочным и активационным маркерам (CD34-Nab8158; CD45-Nab3088; фирма Abeam, США), меченных FITC и фикоэритрином (РЕ). Полученный клеточный состав ГПККМ, указан в таблице 6.
У животных под эфирным наркозом, получали клеточный аспират из костномозгового канала трубчатых костей путем вымывания из полости раствором Хенкса (без Са+2 и Mg+2) выше описанном способом (см. раздел 2.2.1.). Суспензию клеток центрифугировали 5 мин. при 1500 об/мин; осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе (114 mM NH4CI; 7,5 тМ КНСОз; ЮО мкМ EDTA) из расчета 1:1 при комнатной температуре t=(22 С) в течение 1 мин. и центрифугировали 3 мин. при 1500 об/мин, добиваясь полного лизиса эритроцитов. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий МНК и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) ресуспендировали в ростовой среде DMEM (ПанЭко), с добавлением 25мМ HEPES, 0,58 г/л глютамина, 100мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA), 5 мкг/л инсулина. Через 3-5 суток неприкрепившиеся клетки отбирали, а к- оставшимся пластикадгезивным клеткам в ростовую среду добавляли основной фактор роста фибробластов (bFGF) (Sigma, USA) 20 нг/мл. Культивировали ММСК КМ для наращивания клеточной массы в течение 14 суток с постоянной заменой ростовой среды через каждые 3 дня. Через 2 недели клеточный материал, представлявший собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки (стромальные стволовые клетки), был готов для трансплантации (рис. 4).
Использовали иммуногистохимический метод выявления коллагена I типа [Лейси А., 1992].
Иммуногистохимическое определение коллагена I типа, проводили в ММСК КМ (фибробластоподобные клетки). последовательной обработкой свежеприготовленными растворами: 3% перекиси водорода (10 мин), 2,28% periodic acid (5 мин), и 0,02% боргидрата натрия [borhydride] (5 мин). Затем клетки инкубировали в 3% растворе нормальной лошадиной сыворотки (в 0,005М Tris-HCl; 0,15М NaCl; рН=7.6) в течение 30 мин и далее инкубировали 36-48 часов при 4С с первичной антисывороткой. Эту антисыворотку готовили рутинным способом в концентрации 1:10.000. Козью антисыворотку разбавляли до нужной концентрации 1%-м раствором нормальной лошадиной сыворотки в Tris-буфере. После инкубации с первичной антисывороткой, препараты инкубировали при комнатной температуре 30 мин с кроличьими антикозьими у-глобулинами (1:100), затем с кролик-пероксидаза-антипероксидаза (1:50) 30 мин. Обе антисыворотки были разбавлены в 1%-м растворе нормальной козьей сыворотки в Tris-буфере. Полученные срезы тканей далее проявляли обработкой 0,05% -м раствором diaminobenzidine-4HCl в 0,1М PBS при рН=5,8 в течение 5 мин. Коричневое окрашивание клеток на коллаген I типа (рис.5) наблюдали в световом микроскопе и фотографировали с помощью цифровой фотокамеры фирмы "OLYMPUS" (Япония) на компьютере с программным обеспечением. При окрашивании на остеопонтин и кальцитонин специфического окрашивания не наблюдали, что свидетельствовало об отсутствии остеобластной дифференцировки.
Морфологические изменения в паренхиме внутренних органов при сахарном диабете 2 типа у мутантных мышей линии B/Ks-Lepr /+
Гистологически у мышей этой линии гомозиготов - db/db были выявлены нарушения в структуре ПЖ, печени, почек и селезенки, типичные для СД 2-го типа. Поджелудочная железа Наши исследования показали, что ко 2-му месяцу жизни островковый аппарат ПЖ у мышей db/db характеризовался отчетливо выраженными адаптационными перестройками. ОЛ в ПЖ умеренно гипертрофировались, увеличивались по площади (99269,5±1250) и количеству в них клеток (294±27) по сравнению с группами контрольных здоровых животных (таблица 10), причем в ОЛ мышей db/db доминировали базофильные Р-клетки (рис. 10 А), что позволяло предполагать достаточно высокий уровень выработки ими инсулина. Однако к 4 и особенно к 6 месяцу количество ОЛ и их размеры достоверно уменьшались, контуры ОЛ становились размытыми, снижались площадь ОЛ и количество в них клеток, в том числе базофильных (рис. 10 Б). К 6 месяцам жизни у db/db животных отмечалось выраженное и достоверное уменьшение площади ОЛ (9910,6±634), а также снижение содержания в них клеток (75±19) (рис. 10), по сравнению с контролями (таблица 12). В ПЖ у 4-6-и месячных животных, страдающих СД 2 типа, нами отмечались явления выраженного перидуктального и интралобулярного склероза с атрофией паренхимы железы, а так же интра- и перилобулярного липоматоза. В некоторых наблюдениях между прослойками соединительной и жировой ткани определялись очень мелкие замурованные атрофичные панкреатические островки, представленные скоплением небольшого количества базофильных клеток (от 9 до 15 в группе). Макро- и микроскопические изменения печени у мышей db/db становились резко выраженными к 4-6 месяцам жизни, хотя уже у 2-х месячных животных (рис.11 Б) мы отмечали прогрессирующее снижение накопления гликогена в гепатоцитах по сравнению с контролями и появление на периферии долек признаков средне-крупнокапельной жировой дистрофии.
Печень у 4-6-и месячных животных была дряблой консистенции, желтовато-красного цвета, с жирным налетом. Количество гликогена в гепатоцитах значительно уменьшалось, иногда определялось в следовых количествах или полностью отсутствовало (рис.11 Г, Д). Одновременно развивалась выраженная жировая дистрофия печени. Гепатоциты всех отделов дольки находились в состоянии мелко-крупнокапельной жировой дистрофии (рис. НЕ). Таким образом, обнаруженные нами изменения в печени у мышей, страдающих СД 2 типа, подтверждают данные литературы [Kahn et al., 1978; Bierman et al., 1985; Brown et al., 1985; Г. Уильямз, Дж. Пикап, 2003] об снижении интенсивности гликолиза и синтеза гликогена, с усилением глюконеогенеза, что подтверждается избыточным отложением жира, связаным с инфильтрацией печени липидами на фоне прогрессирующей дислипидемии и холестеринемии. У мышей db/db были также выявлены выраженные изменения в иммунокомпетентных органах - селезенке и региональном лимфатическом узле ПЖ.
Селезенка у этих мышей подвергалась прогрессирующей гипоплазии, начиная с 4 месяца. К 6-ому месяцу масса её (0,036±0,02) была почти в 2,5-2,8 раза меньше, чем в контрольных группах (таблица 10). Лимфоидные фолликулы селезенки были также с явлениями гипоплазии и атрофии (рис. 12), в большинстве наблюдений рисунок строения был стерт, фолликулы без центров размножения. Площадь лимфоидных фолликулов как в селезенке (26123,9±320), так и региональном лимфатическом узле были уменьшены более чем в 2 раза по сравнению с контрольными группами (65404,2±405 и 54669,6±398). Сопоставление веса селезенки с морфометрическими исследованиями площади фолликулов в селезенке, а также в лимфатическом узле подтверждает (таблица 10), что в группе db/db на поздних сроках развития болезни возникают отчетливые признаки развития иммунного дисбаланса (иммунодифицитного состояния) в организме, что также является обязательным сопутствующим признаком развития СД 2 типа. Помимо оценки морфологических изменений, возникающих в ПЖ, печени и селезенке, мы попытались оценить изменения происходящие в почках у контрольных мышей и у мышей с СД 2 типа. В группе мышей с СД 2 типа, т.е. мышей db/db, почки к 4-6 месяцем претерпевали изменения, которые можно было охарактеризовать как диабетическая микроангиопатия. Морфологически это проявлялось утолщением базальной мембраны эндотелиальной выстилки капилляров за счет накопления в ней PAS- положительных субстанций (липогиалин), а в некоторых участках отмечалось диффузное утолщение мезангиального матрикса и умеренная пролиферация мезангиальных клеток (рис. 13 В), местами гиалиновые массы были локализованы в центре мезангия и были окружены капиллярными петлями. Гиалиновые массы в виде диффузных и узелковых отложений окрашивались в малиновый цвет (PAS- положительны). В части препаратов отмечался, слабо-выраженный интрагломерулярный и перигломерулярный склероз и спадение капиллярных петель. Эпителий дистальных и проксимальных канальцев местами был с явлениями атрофии (рис. 13), местами с признаками белковой и жировой дистрофии, просветы канальцев несколько расширены, заполнены гомогенными эозинофильными массами — (PAS- положительными), вероятнее всего сахаросодержащими веществами, такими как гликопротеины и гликолипиды; аналогичные включения наблюдались в просвете канальцев, мозгового вещества почки (собирательные трубочки). Гистологические признаки белковой и жировой дистрофии подтверждают наличие- умеренной протеинурии у мышей db/db, однако» при окраске PAS- реакцией часть эозинофильных масс, а также содержимое канальцев вблизи апикальных поверхностей эпителиальных канальцев окрасились в сиреневый цвет, что не исключает наличия в содержимом углеводов. Таким образом, проведенное нами исследование показало, что генетическая модель СД на мутантных мышах линии B/Ks-Leprdb/+ у db/db (гомозиготы) воспроизводит клинические, биохимические и морфологические нарушения в организме, характерные для СД 2 типа. Мы показали,зто у мышей db/db имеет место ранее и прогрессирующее повышение в крови содержания глюкозы и HbAlc, полифагия, полидипсия, полиурия и нарастающее ожирение. СД 2 типа проходит отчетливые стадии в своем развитии, которые характеризируются отчетливыми клиническими и морфологическими признаками. I стадия — ранняя (до 1-2 мес. после рождения); II — стадия развернутых клинических и морфологических изменений (3-4 мес. после рождения); III стадия - стадия декомпенсации функциональных систем (5-6 мес. после рождения). прогрессирующая гипоплазия ткани селезенки и лимфатического узла, свидетельствуют о развитии иммунной дизрегуляции в организме. Полученные результаты позволяют признать изученную нами генетическую модель СД адекватной моделью СД 2 типа, которая пригодна для поиска и оценки новых эффективных способов лечения этого заболевания в эксперименте, в том числе для изучения терапевтических эффектов, аллогеных или изогенных гемопоэтических (мононуклеарная фракция) и стромальных (фибробластоподобных) ККМ, используемых в качестве средства патогенетической терапии СД 2 типа. Это модель воспроизводит характерные признаки стадийности развития СД 2 типа: на ранних сроках (1-2 мес.) развивается резистентность тканей к инсулину, которая компенсируется гипертрофией ОК; на сроке 3-4 мес. развивается стадия истиной инсулиновои недостаточности, как и при СД 1 типа; на сроке 5-6 мес. развивается терминальная стадия СД, которая приводит к глубокому нарушению метаболизма, кахексии и гибели животных.
Динамика показателей клинического состояния животных с сахарным-диабетом 2 типа после введения изогенных клеток костного мозга
Динамика показателей углеводного обмена и массы тела у мышей с СД 2 типа Нами исследовалось влияние изогенных ККМ, полученных от гетерозиготных доноров мышей - db/+, при внутрибрюшинном введении в 3-х сериях опытов: III. 2.1. при трехкратном введении - 24-39 млн. культивированных ГПККМ; III. 2.2. при трехкратном введении - 24-30 млн. культивированных ММСК КМ; III. 2.3. при однократном введении - 100 млн. культивированных ГПККМ. Введение клеток осуществляли через 3 месяца после рождения мышей db/db, срок наблюдения после введения ККМсоставил 120 дней. После введения фракций культивированных изогенных ККМ реципиентам от гетерозиготных db/+ доноров, установлено (таблица, 18), что в серии Ш. 2.1. уровень, глюкозы в крови колебался и максимально снизился к 96 дню наблюдений с 20,6 ммоль/л до 13.0 ммоль/л (рис. 21), но с 109 дня наблюдения уровень глюкозы вновь повысился и удерживался до конца эксперимента на уровне 23,4±3,46 ммоль/л.; в серии Ш. 2.2. максимальное снижение показателя глюкозы наблюдалось к 83 дню с 20 ммоль/л до= 13,3 ммоль/л; с 96 дня наблюдений уровень глюкозы, повышался и к концу эксперимента уже составлял 22,4±3,71 ммоль/л.; в серии Ш. 2.3. максимальное снижение наблюдали на 55 день- с 20,3 ммоль/л до 7,2 ммоль/л и также к 89 дню наблюдений уровень глюкозы оставался в пределах 11,1±1,41 ммоль/л, а концу эксперимента! (120 дней) уровень глюкозы уже составлял 18,6±2,78 ммоль/л по сравнению с.контрольной серией, в которой уровень глюкозы повышался с 20,9 ммоль/л до 28,3 ммоль/л (109 день), а к 199 дню после рождения в контроле погибали все животные.
В серии III. 2.1. после 3-х кратного введения культивированных изогенных ГГЖКМ уровень был HbAlc достоверно ниже к 53 дню по сравнению с исходным уровнем — 6,4% вместо 7,4%; в тоже время в контроле, уровень HbAlc увеличивался с 7,2% до 8,9% к 109 дню наблюдений (рис. 22, таблица 18). У животных в серии Ш. 2.2. с 3-х кратном введением культивированных изогенных ММСК КМ выявлено достоверное снижение уровня HbAlc к 68 дню с 7,3% до 6,6% по сравнению с контролем (рис. 22), но среднее значение этого показателя были выше по сравнению с аналогичным показателем в серии III. 2.3. (таблица 18). 3. В серии III. 2.3., где была введена однократная доза культивированных изогенных ГПККМ в количестве 100 млн. после введения клеток наблюдали наиболее выраженное и достоверное снижение уровня HbAlc: на протяжении 120 дней этот показатель стабильно удерживался на одном уровне и составлял в среднем 6,7±0,49 % (таблица 18), по сравнению с контролем СД без введения-ККМ:
Из рисунка 23 видно, что в сериях. ПІ. 2Л., III. 2.2. после введения-культивированных изогенных ККМ масса тела у животных снижалась к 27 дню наблюдений, а затем масса тела несколько увеличивалась в этих сериях, однако с 103 дня наблюдений в сериях III. 2.1., III. 2.2. масса тела стала, не резко снижаться. Возможно, введенные дозы ККМ были недостаточными для удержания массы тела на одном уровне, но значения.массы тела во всех сериях были достоверно больше, чем в контроле, где мы наблюдали вслед за подъемом массы тела последующее резкое снижение веса в связи с переходом болезни в терминальную стадию.
В серии III. 2.3. масса тела животных была наиболее стабильной и достоверно удерживалась на одном уровне 34,1±0,91 г (таблица 18) на протяжении 120 дней контролируемого наблюдения (рис. 23). По результатам наших исследований после введения изогенных ККМ был получен выраженный регресс клинических проявлений СД у мышей db/db в сериях 111.2.1 ., Ш.2.2.. и Ш.2.З.: в ходе экспериментов мы не наблюдали явлений мацерации кожных покровов у животных в сериях с введением ККМ, когда как. в контрольной группе мацерация возникала у животных в возрасте 120-150 дней после рождения и оставалась у них до самой гибели.
