Введение к работе
Актуальность темы.
Болезни сердечно-сосудистой системы являются одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира, так как количество таких больных не только достаточно велико, но и продолжает увеличиваться. Так, в Государственном докладе о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2001 году указано, что общая заболеваемость взрослого населения РФ болезнями системы кровообращения составила 18312.4 на 100 000 населения, что на 5% выше, чем в 2000 году, а впервые выявленная заболеваемость по сравнению с 2000 годом возросла на 5.2%.
Для лечения болезней сердца в настоящее время используют широкий спектр лекарственных препаратов и немедикаментозных методов, таких как коронарное шунтирование, кардиомиопластика, искусственное сердце, трансплантация сердца и др. (В.И. Шумаков, 2002). Однако, частота развития и распространенность сердечной недостаточности в человеческой популяции продолжает расти. Именно поэтому существует необходимость в разработке принципиально новых, доступных и эффективных методов коррекции сердечной недостаточности.
Современное развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии сделало клетку не только главным объектом воздействий, но и средством лечения многих заболеваний. Так, для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы (В.И. Шумаков, 1998), для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение донорских гепатоцитов и спленоцитов (Demetriou, 1995), клеточная терапия используется для лечения ожогов (Д.С. Саркисов, 1995), миодистрофии Дюшенна (В.С. Репин, 1998) и т.д. Однако, возможности клеточных технологий в кардиологии остаются малоизученными и нереализованными.
В последние годы было показано положительное влияние трансплантации клеток различных фенотипов при экспериментальных моделях некроза миокарда или кардиомиопатии. Материалом для пересадки служили аллогенные фетальные кардиомиоциты (Koh, 1995; Li, 1996), фибробласты (Salvatori, 1995), аутологичные скелетные миобласты (Chiu, 1995; Reinecke, 2000), мезенхимальные стволовые клетки (МСК) (Wang, 2000), гладкомышечные клетки (Yoo, 2000), ген-трансфецированные клетки (Soonpaa, 1994; Toma, 1999). Показано, что пересаженные в миокард клетки образуют контакты с КМЦ хозяина (Matsushita, 1999; Yoon, 1995), могут дифференцироваться в фенотип КМЦ in vivo (Chiu, 1995; Wang, 2000), стимулируют ангионеогенез (Tomita, 1999; Li, 1996) и переживают после трансплантации до 6 месяцев (Li, 1997).
Эти исследования позволили начать изучение эффективности метода клеточной трансплантации в клинике. Недавно появились сообщения о положительном влиянии пересадки аутологичных клеток костного мозга в инфаркт-связанную артерию (Assmus, 2002; Strouer, 2002).
Исследования в области клеточных биотехнологий и особенно клеточной терапии находятся на начальном этапе своего развития; в литературе нами не найдено данных о сравнительном анализе влияния трансплантации клеток различного фенотипа на сократительную способность поврежденного миокарда. В частности, нет данных о сравнении эффективности трансплантации фетальных кардиомиоцитов, использование которых сталкивается с труднопреодолимыми юридическими и этическими проблемами, и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые сравнительно доступны, но для которых еще убедительно не показана способность дифференцироваться в клетки мышечного типа и влиять на сократительные свойства поврежденного миокарда. Не проведена также количественная оценка изменений показателей насосной функции сердца после применения методов клеточной трансплантации в условиях последовательного применения нагрузочных режимов и отсутствует сопоставление этих данных с изменениями ультраструктуры поврежденного миокарда.
Отсутствие этих данных позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы
Изучить и количественно оценить эффективность интрамиокардиальной трансплантации аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга для коррекции сердечной недостаточности в экспериментах на животных.
Задачи работы
-
Воспроизвести модель сердечной недостаточности путем создания стандартно одинаковой зоны повреждения миокарда методом криодеструкции.
-
Отработать технологию выделения и получить культуру фетальных кардиомиоцитов для интрамиокардиальной аллотрансплантации.
-
Отработать технику выделения мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток из костного мозга и осуществить их дифференцировку в кардиомиоцитоподобные клетки для интрамиокардиальной аутотрансплантации.
-
Дать количественную оценку изменений сократительной функции миокарда после криодеструкции, а также после трансплантации в принекротическую зону миокарда фетальных кардиомиоцитов и предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
-
Установить связь изменений, возникающих в сократительной функции функции поврежденного миокарда, с сохранением функциональной активности клеток, трансплантированных в миокард.
-
Сравнить электронно-микроскопическую характеристику принекротической зоны без и после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и предиференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
Научная новизна
Впервые в России воспроизведена методика получения мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток из костного мозга и показана возможность их направленной дифференцировки в кардиомиоцитоподобные клетки (гистохимическое окрашивание на кардиоспецифический белок – тропонин I) путем культивирования в питательной среде с временным добавлением 5-азацитидина и постоянным присутствием с ней фактора роста фибробластов b. Новым является то, что по мере увеличения срока культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток в культуре увеличивается и достигает к 4-й неделе 40-45% от общего количества клеток в культуре, что больше, чем у зарубежных авторов (Makino, 1999). Впервые в России нами установлено, что к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), напоминающие миотрубочки, которые обладают способностью спонтанно и ритмично сокращаться; электронно-микроскопически кардиомиоцитоподобные клетки идентифицированы как клетки миобластоидного ряда.
На стендовой установке по Neely на изолированных сердцах нами впервые проведена количественная оценка состояния насосной функции сердца после криодеструкции миокарда, а также после трансплантации в принекротическую зону аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга. Оригинальными являются разработанные нами режимы применения нагрузочных тестов (последовательное повышение дозированных пред- и постнагрузок на левый желудочек) в стендовых условиях, которые использованы для выявления возникающей левожелудочковой недостаточности в криоповрежденных сердцах и констатации повышения устойчивости этих сердец к воздействию этих нагрузок через 3 недели после трансплантации аллогенных фетальных кардиомиоцитов и аутологичных предифференцированных мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга.
Впервые нами установлено, что фетальные кардиомиоциты и мезенхимальные стволовые клетки повышают систолическую функцию левого желудочка при повышении преднагрузок; трансплантация мезенхимальных стволовых клеток повышает устойчивость миокарда и к воздействию постнагрузок. Высказано предположение, что сниженная толерантность сердец к постнагрузкам после трансплантации фетальных кардиомиоцитов обусловлена цитотоксическим действием на миокард длительно используемого циклоспорина А.
С помощью рекомбинантного адновирусного вектора (содержащего Lac-Z-ген E.Coli), внедренного в фетальные кардиомиоциты и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга на этапе их культивирования, доказано присутствие и функционирование трансплантированных клеток в принекротической зоне в сроках не менее 3 недель; этого в отечественных работах ранее показано не было.
Впервые получены электронно-микроскопические доказательства сужения зоны принекротического повреждения миокарда при трансплантации обоих типов клеточных культур.
Практическая значимость работы
Отработаны режимы предифференцировки мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцитоподобные клетки. Предложено для трансплантации в миокард использовать короткие (не более 2-х недель) сроки предифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (после предварительной обработки их 5-азацитидином и культивировании в присутствии фактора роста фибробластов) для осуществления этими клетками морфорегулирующей функций в условиях адекватного микроокружения после трансплантации.
Показано, что клетки, введенные в миокард, продолжают оставаться в нем и функционировать по крайней мере в течение 3-х недель. Доказано положительное влияние трансплантации фетальных кардиомиоцитов и предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на насосную функцию сердца после моделирования сердечной недостаточности методом криодеструкции.
Апробация диссертации
Апробация работы состоялась 20 июня 2003 года на межлабораторной конференции в ГУ НИИ Трансплантологии и Искусственных органов МЗ РФ.
Основные положения работы доложены и обсуждены: на конференции "Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)" (Москва, июнь 2002 г.), на II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002 г.), на конференции "Клеточные технологии – медицине" (Москва, май 2003 г.).
По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 в центральной печати, 1 работа опубликована за рубежом.
Структура и объем диссертации
