Введение к работе
Актуальность темы
Несмотря на определенные достижения медикаментозной терапии последних лет, сахарный диабет (СД) и его тяжелые сосудистые осложнения - по-прежнему остаются одной из ведущих причин ранней инвалидизации и гибели людей во всех странах мира [Gillespie K.M., 2006]. По современным представлениям СД I типа является тяжелым прогрессирующим аутоиммунным заболеванием, в основе которого лежит глубокая дизрегуляция иммунной системы, при которой имеет место повышенный апоптоз и гибель островковых клеток поджелудочной железы на фоне ингибирования их восстановительной регенерации.
В последние годы во всем мире стали активно изучаться возможности применения клеточных технологий, в частности трансплантации стволовых/прогениторных клеток костного мозга (ККМ), для индукции восстановительных процессов в поврежденных органах. Была показана эффективность применения этих клеток при моделировании на животных заболеваний сердечно-сосудистой системы [Pittenger M.F., Martin B.J., 2004; Iso Y. et al., 2007], опорно-двигательного аппарата [De Kok I.J. et al., 2003; Awad H.A. et al., 2003; Murphy J.M. et al., 2003], неврологических нарушений [Iihoshi S. et al., 2004; Zappia E. et al., 2005; Zhang J. et al., 2005], повреждений легких, печени, почек [Ortiz L.A. et al., 2003; Fang B. et al., 2004; Togel F. et al., 2005]; в клинической практике ККМ использовали для восстановления функции сердца [Perin E.C. et al., 2003; Stamm C. et al., 2004; Rosenzweig A., 2006], регенерации костной ткани [Arthur A. et al., 2009] и ингибирования «реакции трансплантат против хозяина» [Ringden O. et al., 2006].
Показана терапевтическая эффективность ККМ (мононуклеарной и стромальной фракций) и на экспериментальных моделях некоторых аутоиммунных заболеваний [van Bekkum D.W., 2004; Zappia E. et al., 2005; Zhang J. et al., 2005; Augello A. et al., 2007], которая, как полагают, связана с коррекцией популяционного состава иммунорегуляторных клеток [Herrmann M.M. et al., 2005; de Kleer I. et al., 2006] и достигается устранением цитокинового дисбаланса в организме [Aggarwal S., Pittenger M.F., 2005].
Приступая к своим исследованиям, мы полагали, что применение стволовых/прогениторных ККМ при СД I типа, при котором роль аутоиммунных механизмов повреждения островковых клеток патогенетически значима, может оказаться весьма перспективным способом коррекции клинических проявлений СД I типа. Однако исследований по коррекции ККМ аутоиммунного СД I типа мы не обнаружили. Только в работе Hasegawa et al. (2007) были приведены результаты коррекции аутоиммунного СД I типа ККМ. Но в этой работе были использованы животные, генетически предрасположенные к развитию СД I типа, и результаты, полученные в этих опытах, дают искаженное представление о возможностях реагирования адаптивных систем организма и потому генетическая модель не может быть использована для оценки эффективности восстановительных процессов в островковых клетках поджелудочной железы у животных с аутоиммунным СД I типа без генетических дефектов развития их иммунной системы.
Обычно используемые экспериментальные модели СД I типа – аллоксановая и стрептозотоциновая являются цитотоксическими, избирательно повреждают -клетки поджелудочной железы, и сопровождаются фиброзирующей регенерацией поджелудочной железы без сопутствующего развития в ней аутоиммунного повреждения [Nir T. et al., 2007].
Отсутствие адекватной модели аутоиммунного СД I типа на генетически не предрасположенных животных и отсутствие данных об эффективности коррекции патогенетических нарушений СД I типа на такой экспериментальной модели путем трансплантации аутологичных ККМ позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось изучение эффективности трансплантации аутологичных клеток костного мозга для коррекции патогенетических нарушений на модели аутоиммунного СД I типа.
Для достижения указанной цели нами были поставлены следующие задачи:
-
Создать адекватную модель аутоиммунного СД I типа и оценить ее пригодность для изучения иммунных механизмов развития аутоиммунного СД I типа и эффективности клеточной терапии при этом заболевании.
-
Оценить целесообразность предварительного культивирования аутологичных клеток костного мозга от животных с аутоиммунным СД I для восстановления функциональной и биорегуляторной активности этих клеток.
-
Выявить наличие функционально активных трансплантированных клеток костного мозга (маркер - GFP) в органах животных с аутоиммунным СД I типа при длительных сроках наблюдения (60 суток) и установить связь присутствия жизнеспособных клеток с восстановлением функции поврежденных органов.
-
Сравнить эффективность коррекции клинических, морфологических и иммунных нарушений при СД I типа в зависимости от дозы (кратности введения) аутологичных клеток костного мозга.
-
Сравнить эффективность коррекции клинических, морфологических и иммунных нарушений при СД I типа в зависимости от стадии (тяжести) развития заболевания.
-
Связать терапевтическую роль клеток костного мозга с восстановлением структуры и функции органов иммуногенеза, устранением иммунной дизрегуляции в организме и индукцией иммунной толерантности для коррекции клинических проявлений, развивающихся при аутоиммунном СД I типа.
Выполнение работы осуществлялось в рамках темы: «Разработка методов лечения сахарного диабета I типа аутологичными клетками костного мозга» по заданию Минздравсоцразвития РФ на 2007-2010 гг (Регистрационный номер 0120.0800280 от 04.12.07).
Научная новизна
Впервые для изучения патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа и их коррекции методами клеточной терапии разработана и охарактеризована иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа у генетически не предрасположенных животных. Новизна модели подтверждена выдачей патента на изобретение №2400822 «Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс» от 27.09.2010. Гистологическими и морфометрическими методами показано, что при моделировании СД I типа имеет место уменьшение площади островков Лангерганса (ОЛ) поджелудочной железы (ПЖ), снижение количества -клеток в них, а также наличие выраженной воспалительной инфильтрации в ОЛ ПЖ. Установлено, что развитие аутоиммунного СД I типа сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов в организме на фоне гипоплазии ткани селезенки. Показано, что среди клеток воспалительного инфильтрата находятся различные популяции Т-клеток, с присутствием которых связано поддержание аутоиммунного воспаления в ОЛ ПЖ. Аутоиммунный механизм повреждения инсулярного аппарата островковой ткани ПЖ подтвержден выполнением адоптивного переноса СД интактным животным путем трансплантации спленоцитов от животных с аутоиммунным СД I типа.
Показано, что при использовании аутологичных ККМ для лечения аутоиммунного СД I типа необходимо проводить предварительное культивирование этих клеток для восстановления их биорегуляторной активности, ингибированной хроническим заболеванием (стрессом).
Установлено, что эффективность коррекции патогенетических нарушений у животных с аутоиммунным СД I типа при трансплантации аутологичных ККМ, находится в непосредственной зависимости от суммарной дозы (кратности введения) клеток, а также от стадии развития заболевания. При этом более выраженный эффект был отмечен при многократной трансплантации ККМ на начальной стадии заболевания, что характеризовалось наиболее выраженным снижением уровня глюкозы по сравнению с другими экспериментальными сериями, достоверно более значительным повышением площади ОЛ ПЖ и количества -клеток в них, а также снижением выраженности воспалительной инфильтрации ОЛ ПЖ. Показано, что многократная трансплантация ККМ на начальной стадии заболевания сопровождается также новообразованием островков вблизи протоков ПЖ.
Показано, что аутологичные ККМ нормализуют углеводный обмен на фоне устранения иммунной дизрегуляции в организме и восстановления морфофункциональных компартментов органов иммуногенеза (тимус и селезенка), дисфункция которых развивается при аутоиммунном СД I типа, а также на фоне снижения уровня провоспалительных цитокинов. При пилотном исследовании содержания Т-регуляторных клеток установлено, что ККМ тормозят процессы активации иммунной реактивности при СД I типа и это происходит за счет повышения содержания клеток с супрессивными свойствами. Впервые высказано предположение, что корригирующий эффект клеточной терапии аутологичными ККМ является результатом коррекции и восстановления иммунного баланса в организме за счет восстановления морфофункциональной активности центральных органов иммуногенеза и активации процессов как центральной, так и периферической толерантности.
Практическая значимость работы
Разработана иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа у крыс, на которой были изучены иммунные механизмы развития данного заболевания; показана связь их развития с торможением процессов репаративной регенерации органов иммуногенеза, а также изучены условия и показана возможность коррекции нарушений, возникающих при аутоиммунном СД I типа, методами клеточной терапии.
Показано, что для осуществления эффективной терапии СД I типа необходимо осуществить иммунокоррекцию в организме с помощью тканевых регуляторных пептидов, выделяемых ККМ для индукции иммунной толерантности и активации процессов репаративной регенерации поврежденных органов. Установлено, что клеточную терапию культивированными аутологичными ККМ целесообразно использовать как на начальной стадии, так и на стадии развернутых клинических проявлений СД I типа, но особенно клеточная терапия показана на начальной стадии заболевания, то есть на этапе сохранения в организме резервов восстановительной регенерации как островкового аппарата, так и органов иммуногенеза, способствующих поддержанию процессов толерантности.
Установлена необходимость предварительного культивирования аутологичных ККМ для восстановления их исходно нарушенной биорегуляторной (иммунорегуляторной) активности. Показано, что эффективность трансплантации ККМ для коррекции патогенетических нарушений при СД I типа зависит от суммарной дозы (кратности введения) клеток. а также от стадии развития заболевания.
Показано, что наиболее выраженный эффект коррекции клинических, иммунологических и морфологических нарушений в организме животных с аутоиммунным СД I типа наблюдается при многократной трансплантации ККМ на начальной стадии развития заболевания. Однократная трансплантация ККМ как на начальной стадии, так и на стадии развернутых клинических проявлений СД I типа и многократная трансплантация ККМ на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа снижают темпы развития необратимых нарушений во внутренних органах и потому являются целесообразной процедурой в комплексной терапии аутоиммунного СД I типа.
Положения выносимые на защиту
-
Разработанная иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа является адекватной экспериментальной моделью, так как воспроизводит клинические, иммунологические и морфологические нарушения в организме, свойственные данному заболеванию. Эта модель может быть использована для оценки эффективности новых способов коррекции патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа, в том числе при трансплантации аутологичных ККМ.
-
Предварительное культивирование мононуклеарных и стромальных клеток аутологичного костного мозга in vitro является важным этапом подготовки их к проведению клеточной терапии аутоиммунного СД I типа, так как позволяет устранить иммунодизрегуляторное влияние на них хронического патологического (аутоиммунного) процесса и восстановить их биорегуляторную активность.
-
Эффективность коррекции патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа путем трансплантации аутологичных ККМ зависит от суммарной дозы (кратности введения) клеток, а также от стадии развития заболевания.
-
Наиболее выраженный клинический эффект, характеризующийся длительной нормализацией уровня гликемии, устранением иммунной дизрегуляции в организме и активацией процессов репаративной регенерации в островковой ткани поджелудочной железы и других органах наступает при многократной трансплантации аутологичных ККМ на начальной стадии развития аутоиммунного СД I типа.
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась 29 сентября 2010г. на заседании объединённой межлабораторной научной конференции ФГУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.
Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IX Съезде научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, 2-5 марта 2009 г.); на Конференции «Клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии» (г. Москва, 2009 г.); на Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (г. Тула, 9-10 ноября 2009 г.); на V Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 8-10 октября 2010 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 в центральных рецензируемых журналах. По теме диссертации получен патент на изобретение №2400822 «Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс» от 27.09.2010.
Объем и структура работы
