Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Восстановление биорегуляции репаративных процессов в паренхиме печени - новая современная стратегия лечения тяжелых форм печеночной недостаточности (обзор литературы). Стр. 14
1.1. Современные представления о регуляции восстановительного роста паренхимы печени в норме и при ее патологии. Стр. 18
1.1.1. О механизмах индукции митотической активности гепатоцитов. Стр. 22
1.1.2. Характеристика гуморальных факторов регуляции митотической активности гепатоцитов. Стр. 30
1.2. Методы восстановления биорегуляции репаративных процессов в паренхиме печени при лечении печеночной недостаточности. Стр. 37
1.2.1. Применение методов клеточной терапии. Стр.38
1.2.2. Применение регуляторных пептидов - новый этап восстановительного лечения поврежденных органов. Стр. 43
Глава II. Материалы и методы исследований. Стр. 48
2.1. Общая характеристика проведенной работы. Стр. 48
2.2. Техника получения и инкубации изолированных гепатоцитов в модельных опытах in vitro. Стр. 50
2.2.1. Метод выделения и инкубации гепатоцитов. Стр. 50
2.2.2. Методика получения кондиционированных сред. Стр. 52
2.3. Характеристика пептидов, выделенных из ткани селезенки свиней, печени неонатальных кроликов и печени взрослых свиней. Стр. 53
2.4. Метод моделирования токсического гепатита крыс. Стр. 55
2.5. Методы исследования. Стр. 55
2.5.1. Метод определения состояния жизнеспособности изолированных гепатоцитов. Стр. 55
2.5.2. Методы исследования функциональной активности изолированных гепатоцитов в опытах in vitro. Стр. 56
2.5.3. Метод исследования функциональной активности гранулоцитов (нейтрофилов). Стр. 56
2.5.4. Методы исследования важнейших функций печени в опытах in vivo. Стр. 57
2.5.5. Морфологические методы исследования. Стр. 57
2.6. Статистическая обработка результатов. Стр. 58
Глава III. Влияние сред, кондиционированных пептидными комплексами, полученными из ткани печени (неонатальных и взрослых животных) и селезенки, на состояние токсически поврежденных изолированных гепатоцитов . Стр. 60
3.1. Жизнеспособность и функциональная активность поврежденных гепатоцитов при инкубации в средах, кондиционированных фрагментами ткани интактной печени и селезенки (модель клеточной терапии),- контрольное исследование. Стр. 60
3.2. Влияние полипептидного комплекса, выделенного из ткани селезенки (препарат Спленопид), на состояние токсически поврежденных гепатоцитов . Стр. 66
3.3. Влияние полипептидного комплекса, выделенного из неонатальной печени и печени взрослых животных, на состояние токсически поврежденных гепатоцитов. Стр. 73
3.4. Сравнительная оценка влияния пептидов из ткани селезенки и неонатальной печени на активацию клеток макрофагально-моноцитарного ряда. Стр. 80
Глава IV. Влияние пептидных экстрактов, полученных из ткани селезенки, неонатальной печени и печени взрослого животного, на восстановительные процессы в токсически поврежденной печени . Стр. 83
4.1. Изучение спонтанной регенерации токсически поврежденной печени. Стр. 84
4.2. Влияние имплантации фрагментов ткани донорской печени и селезенки на восстановительные процессы в токсически поврежденной печени . Стр. 93
4.3. Влияние пептидов селезенки (препарат Спленопид) на восстановительные процессы в поврежденной печени. Стр. 98
4.4. Влияние пептидов неонатальной печени и печени взрослых животных на восстановительные процессы в поврежденной печени. Стр. 107
Глава V. Обсуждение полученных результатов. Стр. 118
Заключение. Стр. 133
Выводы. Стр. 135
Список цитированной литературы. Стр. 137
- Методы восстановления биорегуляции репаративных процессов в паренхиме печени при лечении печеночной недостаточности.
- Техника получения и инкубации изолированных гепатоцитов в модельных опытах in vitro.
- Влияние полипептидного комплекса, выделенного из ткани селезенки (препарат Спленопид), на состояние токсически поврежденных гепатоцитов
- Влияние имплантации фрагментов ткани донорской печени и селезенки на восстановительные процессы в токсически поврежденной печени
Введение к работе
Актуальность проблемы
Разработка новых более эффективных и доступных методов лечения острой и хронической печеночной недостаточности (ПН) по-прежнему остается одной из актуальных проблем современной медицины, так как смертность и нетрудоспособность при заболеваниях печени (П) занимает одно из первых мест и не имеет тенденции к снижению.
По данным ВОЗ за 1994 г. среди причин летальности ПН занимает пятое место в мире среди других патологий и восьмое место среди причин нетрудоспособности. Смертность от острой ПН, сопровождающейся обширным некрозом паренхимы, по-прежнему колеблется от 50 до 70-80% и более (В.И. Шумаков, Н.А. Онищенко, 1994; С.А. Лепехова и др., 1998; Damen, Reesing, 1995). Анализ показателей смертности в России при заболеваниях органов пищеварения за период 1988-1992 гг. показал, что смертность при заболеваниях П занимает второе место среди заболеваний других органов этой системы и из года в год увеличивается (А.И. Хазанов и др., 1996). Клинический опыт показывает, что медикаментозная терапия (Б.П. Солопаев, 1990; О.Ю. Абакумова и др. 1996; А.Г. Глоба и др. 1996; Lieber et al., 1994) и аппаратные эфферентные методы не утратили своего значения при лечении ПН (Л.А. Андрейман, 1988; Н.А. Лопаткин, Ю.М. Лопухин, 1989). Однако этим методам отводится лишь вспомогательная роль при крайне тяжелых поражениях П. В то же время, трансплантация П, которая признана одним из самых эффективных методов лечения необратимо тяжелых поражений П, имеет существенные ограничения для использования в широкой клинической практике, и это связано, главным образом, с возрастающей во всем мире нехваткой донорских органов.
В последние 10-15 лет во всем мире стали разрабатываться новые методы лечения ПН, основанные на применении современных клеточных
технологий. Эти новые биотехнологии ставят своей задачей не "лечение" старых тяжело поврежденных клеток в органе, а своевременное их обновление либо путем трансплантации пула изолированных донорских гепатоцитов (Г) (Strom, 1997), либо путем стимуляции собственного резерва регенерации поврежденной П с помощью систем биоискусственной поддержки П (БПП), в экстракорпоральном контуре которых производится культивация донорских Г (М.С. Маргулис и др., 1987; В.И. Шумаков и др., 1990; И.И. Шиманко, С.Г. Мусселиус 1993; В.И. Шумаков, Н.А. Онищенко, 1994; Ю.Н. Лебедева, 1996; Г.И. Строжаков и др., 1997; Н.А. Онищенко и др. 1999; Hoffman et al., 1994; Demetriou et al., 1995; Chen et al, 1996; Patzer et al, 1999). Развитие лечебного эффекта от применения этих новых клеточных технологий связывают (Г.Т. Сухих, 1998; B.C. Репин, 1998; Nakamura et al., 1999) с осуществлением доставки к клеткам поврежденной П необходимого спектра регенерационных факторов, которые продуцируют донорские Г, наделенные высокой митотической активностью (используют Г, выделенные из фетальной, неонатальной П или П молодых доноров).
Между тем, определенные организационные и технологические проблемы, связанные с заготовкой, хранением и применением аллогенных и ксеногенных изолированных Г (ИГ), оказались тормозом на пути внедрения клеточных технологий в широкую клиническую практику. Эти ограничения стимулировали разработку другого, более доступного метода биорегуляции П с помощью факторов пептидной и белковой природы, выделенных из донорской П и других органов, системно с ней связанных (селезенка).
К настоящему времени в литературе уже имеются единичные работы по изучению свойств регуляторных пептидов П телят с молекулярной массой до 10-12 кД (СВ. Оковитный, 1995; В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон, 1996). Между тем, известно (Н.Г. Арцимович и др., 1991), что наиболее выраженной пролиферативной активностью обладают пептиды П с молекулярной массой более 15 кД. Однако пептиды П с такой молекулярной
массой для стимуляции восстановительных процессов в П не применялись. В литературе также полностью отсутствуют сведения о возможности более эффективной регуляции восстановительных процессов в П с помощью биологически активных пептидов селезенки - органа, который сам по себе, но особенно в сочетании с донорскими Г, усиливает восстановительные процессы в паренхиме П (Т.Р. Мамхегова, 1998; Э.И. Первакова, 1998). Кроме того, для обоснования эффективности и целесообразности применения регуляторных пептидов для лечения ПН необходим сравнительный анализ результатов применения выделенных тканевых пептидов и методов клеточной терапии. Однако таких исследований проведено не было.
Отсутствие в доступной нам литературе ответов на вопросы, связанных с совершенствованием методов пептидной биорегуляции восстановительных процессов в пораженной П, явилось основанием для проведения настоящего исследования.
Целью настоящего исследования явилось:
обоснование эффективности и целесообразности использования пептидных препаратов из ткани донорской печени и селезенки с молекулярной массой более 10-12 кД для расширения возможностей применения клеточных биотехнологий при лечении печеночной недостаточности.
Для достижения поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:
Разработать модель для изучения динамики восстановительных процессов в гепатоцитах токсически поврежденной печени при их инкубации в опытах in vitro.
Изучить динамику восстановительных процессов в токсически поврежденных гепатоцитах, используя очищенные регуляторные пептиды
из ткани нативной печени животных различных возрастных групп и селезенки.
Сравнить эффективность регулирующего воздействия на поврежденные гепатоциты питательных сред, содержащих регуляторные пептиды печени и селезенки, а также питательных сред, предварительно кондиционированных фрагментами ткани донорской печени и селезенки (модель клеточной терапии).
Сравнить степень активации гранулоцитов (клеток моноцитарно-макрофагальной системы) - стромальных участников регенераторного процесса в паренхиме печени - при использовании сред, содержащих очищенные регуляторные пептиды печени и селезенки.
Изучить возможность повышения регуляторной активности пептидов печени взрослых животных путем предварительной стимуляции этих животных пептидами селезенки.
В опытах на животных с моделью токсического гепатита изучить особенность стимуляции восстановительных процессов в печени при однократном внутрибрюшинном введении фрагментов ткани печени и селезенки взрослого животного, а также очищенных регуляторных пептидов, выделенных из такого же количества ткани соответствующего органа.
Научная новизна.
Создана модель для изучения в опытах in vitro эффективности различных гуморальных регуляторных воздействий на жизнеспособность и функциональную активность Г поврежденной П в процессе их инкубации. При насыщении среды инкубации регуляторными пептидами путем добавления в нее лиофилизированных очищенных экстрактов тканевых полипептидных комплексов (препарат Спленопид, с молекулярной массой до 40 кД; экстракт неонатальной П с молекулярной массой до 27 кД; экстракт П
взрослого животного с молекулярной массой до 12 кД) или путем предварительного кондиционирования ее фрагментами ткани П и селезенки было установлено, что используемые тканевые факторы пролонгируют жизнеспособность и повышают функциональную активность Г, но выраженность этих эффектов у разных биоматериалов различная. Наиболее выраженный регуляторный эффект оказался присущ фрагментам ткани селезенки, препарату Спленопид и пептидам из неонатальной П; у фрагментов ткани П и экстракта пептидов, приготовленных из П взрослых животных, регуляторная активность была слабовыраженной. Было показано, что биорегуляторные пептиды селезенки оказывают стимулирующее воздействие лишь на поврежденные (но не на интактные) Г и при непосредственном контакте с ними. Было подтверждено, что для приготовления экстрактов биорегуляторных пептидов следует использовать органы, клетки которых обладают высокой пролиферативной активностью: ткань селезенки взрослого животного и ткань П неонатальных (или растущих) животных. В опытах на крысах с токсическим гепатитом подтверждено, что введение фрагментов селезенки, а также пептидов из ткани селезенки (Спленопид) и неонатальной П, обеспечивает более выраженную стимуляцию восстановительных процессов в пораженной П. Морфологически активация процессов внутриклеточной регенерации Г выражалась в более быстром снижении количества Г с признаками жировой дистрофии цитоплазмы, в более резком первоначальном снижении и в более быстром темпе последующего восстановления количества двуядерных Г, в более быстром темпе нарастания и снижения количества полиплоидных Г, а также в более быстром темпе повышения и снижения количества Г с внутриядерными липидными включениями. Кроме того, под влиянием регуляторных пептидов наступала выраженная гиперплазия эндоплазматического ретикулума и гипертрофия митохондрий; функционально это выражалось в более быстром темпе восстановления
детоксицирующей функции (уровень билирубина) П и более быстром темпе снижения показателей цитолиза (АлАт и АсАт).
Было показано, что полипептидные комплексы оказывают регуляторное воздействие не только на Г, но и на клетки макрофагально-моноцитарного ряда стромы П, которые являются непременными участниками регенераторного процесса в поврежденной П.
Было высказано предположение, что стимуляция восстановительных процессов в токсически поврежденной П наступает в результате не только митогенетического, но и трофического влияния регуляторных пептидов селезенки и неонатальной П на процессы внутриклеточной регенерации Г.
Практическая значимость работы:
Предложена модель инкубации Г, выделенных из поврежденной П, для изучения гуморальной регуляции восстановительных процессов в них путем подбора адекватных корригирующих факторов. Показано, что для стимуляции процессов регенерации паренхимы П наряду с имплантацией клеток П и селезенки целесообразно осуществлять введение в организм очищенных полипептидных комплексов, полученных из тканей тех же органов. Показано, что, используя пептидные экстракты с молекулярной массой более 10 кД (Спленопид - до 40 кД, пептиды неонатальной П - до 27 кД), можно достигнуть эффекта биорегуляции, аналогичного воздействию трансплантированных клеточных взвесей (фрагменты ткани селезенки и П).
Показано, что пептидные комплексы, полученные из органов с высокой пролиферативной активностью (селезенка, неонатальная П), представляют собой наилучший биоматериал для выделения пептидов с высокой биорегулирующей активностью. Установлено, что П взрослых животных не следует использовать для выделения регуляторных пептидов, так как П взрослых животных имеет крайне низкий уровень митотической активности
(митотической пролиферации и митотической полиплоидизации) и низкий уровень продукции ростовых факторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Полипептидные экстракты из ткани неонатальной П и селезенки взрослых животных (препарат Спленопид), подобно фрагментам ткани селезенки, обладают способностью к стимуляции восстановительных процессов в поврежденной П. Пептиды, выделенные из П взрослых животных, такими свойствами не обладают.
Для приготовления препаратов с высокой биорегуляторной активностью должны использоваться ткани селезенки и неонатальной П, которые стимулируют восстановительные процессы в Г, а также активизируют клетки макрофагально-моноцитарного ряда, инфильтрирующих строму П при повреждении.
П взрослых животных не пригодна для получения активных биорегуляторных пептидов даже после предварительного воздействия на нее пептидов селезенки (препарат Спленопид).
Пептиды с высокой биорегуляторной активностью сокращают период прогрессирования ПН за счет ускорения адаптации, а также стимуляции процессов репаративной регенерации Г.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на XXXIII Международном Конгрессе по физиологическим наукам (г. Санкт-Петербург, 1997); на XXIII Европейском Конгрессе по искусственным органам (г. Варшава, 1996); на XXIV Европейском Конгрессе по искусственным органам (г. Будапешт, 1997); на 218 заседании общества трансплантологов г. Москвы и Московской
области, ноябрь 1997; на 17 Всероссийском конгрессе физиологов (г. Ростов-на-Дону, сентябрь 1998).
Публикации
Материалы выполненных исследований отражены в 8 публикациях и 1 методических рекомендациях.
Методы восстановления биорегуляции репаративных процессов в паренхиме печени при лечении печеночной недостаточности.
Среди методов, используемых для восстановления репаративных процессов в паренхиме П - медикаментозные средства остаются наиболее доступными для широкого применения. Были предложены и используются в клинической практике такие медикаментозные препараты как пиримидиновые производные (дигидротимин, тимин, метацил, пентоксил), гормоны (тироксин, преднизолон, пролактин, хориогонин, инсулин, глюкагон, соматотропный гормон, кортикостероиды, простагландини), препарат „регенератор", у - глобулин, АТФ, фосфолипиды типа эссенциале, фосфатидилхолина и др. (СР. Карагюлян, Н.Л. Сванадзе, 1985; Б.П. Солопаев, 1990; О.Ю. Абакумова и др. 1996). Показано, что наиболее выраженной способностью стимулировать регенерацию П в опытах с поражением П четыреххлористым углеродом с обширными зонами некроза и дистрофии Г обладали хориогонин, пентоксил и „регенератор"; в клинике применение хориогонина в комплексе с препаратом „регенератор" для лечения персистирующего гепатита у детей дало выраженный клинический эффект. По данным А. А. Косых (1992) хорионический гонад отропин способствует нормализации структуры П путем нормализации взаимоотношения ее паренхиматозных и стромальных элементов за счет восстановления биоритма их деятельности.
В последние десятилетия при разработке методов восстановления функции пораженной П все большее внимание стали уделять методам, позволяющим увеличить массу действующей паренхимы П в организме, так как возникающие нарушения регенерации П связывали со снижением массы П ниже критического уровня. Это привело к разработке и внедрению в клиническую практику метода экстракорпоральной культивации донорских Г в системах биоискусственной поддержки П (БПП) - так называемой "гибридной печени" (М.С. Маргулис и др., 1987; А.В. Бельков, А. А. Писаревский, 1991; Ф.Х. Базиева, 1992; А.В. Бельков, 1992, И.И. Шиманко, С.Г. Мусселиус, 1993; Нахаев, 1995; Н.А. Онищенко и др., 1995; В.И. Ю.Н. Лебедева, 1996; Rozga et al, 1993; Sussman, Kelly, 1993, 1994; Demetriou et al., 1995) и метода трансплантации аллогенных донорских Г (Matas et al., 1976; Demetriou et al, 1991; Gupta et al., 1992; Mito, Kusano, 1993; Habibullah et al, 1994; Strom et al, 1997).
Расшифровка механизмов лечебного эффекта этих методов в литературе практически отсутствует, и авторы лишь ограничиваются констатацией благоприятной динамики важнейших биохимических показателей. Так при использовании систем БПП большинство исследователей связывают обнаруживаемые эффекты с детоксицирующей функцией донорских Г, которые культивируются в потоке плазмы или крови больных. Между тем, проведение вышеуказанных исследований в отсутствие адекватного контроля (на беспеченочных больных) - не может, по нашему мнению, служить доказательством возмещения культивируемыми Г детоксикационных функций П больного. Можно думать, что клинический эффект в этих наблюдениях связан со стимуляцией процессов репаративной регенерации в пораженной П больных теми факторами регенерации, которые выделяют донорские Г в процессе культивации. В пользу этой точки зрения говорят многие факты. В частности, детоксикационный эффект возникал при использовании как больших (150 - 200 мл густой взвеси Г), так и малых объемов (50-70 мл густой взвеси Г) клеток П (Н.Ю. Корухов, 1989; А.В. Бельков, 1992; Ф.Х. Базиева, 1992), при использовании коротких сеансов детоксикации - 45-60 мин. (Ю.Н. Лебедева, 1996); кроме того клинический эффект мог наступить не в момент перфузии, а через 1-2 суток (Ф.Х. Базиева, 1992; В.И. Нахаев, 1995). Ряд авторов (Ф.Х. Базиева, 1992; Н.А. Онищенко и др., 1995; И.В. Журавлев, 1995) отмечали возникновение детоксикационного эффекта при использовании не только Г, но и клеток других органов - селезенки и плаценты.
Техника получения и инкубации изолированных гепатоцитов в модельных опытах in vitro.
Гепатоциты выделяли из П интактных животных, а также из П животных с экспериментальным токсическим гепатитом.
Для получения суспензии ИГ использовали методику ферментативной обработки П in situ по Berry and Friend (1969) в модификации Seglen et al. (1976). Для этого крысу, находящуюся под наркозом (тиопентал в дозе 60-80 мг/кг), фиксировали на хирургическом столике и открывали брюшную стенку. Затем столик вместе с крысой переносили под ламинарный шкаф и производили вскрытие брюшной полости. Схема выделения ИГ предусматривала 4 этапа: 1. Нерециркуляторная перфузия печени ЭДТА-содержащим раствором. 2. Рециркуляторная перфузия печени ферментсодержащим раствором (0,08% раствор коллагеназы). 3. Мягкое механическое диспергирование печени. 4. Фильтрование через нейлоновые фильтры с размерами пор 70 и 210 мкм. 5. Трехкратная отмывка ИГ солевым раствором с центрифугированием. 6. Выделение жизнеспособных гепатоцитов в перколловом градиенте. Последние два этапа проводили при t=4C. Растворы, используемые для перфузии термостатировали (37С) и непрерывно барботировали 4% карбогеном. Перфузию П проводили через канюлю, введенную в портальную вену. Первый этап перфузии проводили ЭДТА-содержащим раствором со скоростью 40 мл/мин в течение 10 мин. Сразу после канюлирования пересекали нижнюю полую вену для предотвращения набухания П. В результате, на первом этапе происходило вымывание крови и частично Са из межклеточной ткани П. Затем резервуар установки заполняли 50 мл 0,08% раствором коллагеназы, содержащим 5 мМ СаСЬ- Оптимальная скорость подачи перфузата составляла 25-30 мл/мин. В течение первых 7 минут П значительно набухала, а затем уменьшалась в размерах. Резкое уменьшение размеров органа, легкость, с которой отделялась капсула П, являлись критерием достаточного разрушения соединительно-тканного матрикса органа. После этого П помещали в охлажденный раствор Хенкса и мягко диспергировали. Полученную клеточную суспензию дважды фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 70 мкм и 210 мкм, соответственно, и трижды отмывали в охлажденной среде Хенкса с добавлением перколла. В этих условиях выход гепатоцитов составил 1 108 клеток/г ткани печени. Жизнеспособность, определяемая по прижизненной окраске ядер трипановым синим, составляла не менее 85%.
Культивацию ИГ проводили в среде 199 из расчета 2 мл среды на 106 клеток с добавлением гентамицина - 10 мкг/мл, инсулина - 125 ЕД/л, преднизолона - 0,075 мкг/мл при 37С и оксигенации 4% карбогеном в стерильных условиях бокса при постоянном перемешивании со скоростью 25 об/мин. Такой режим позволял избежать образования конгломератов Г, а также способствовал лучшей оксигенации клеток и ускоренному поступлению питательных веществ.
При проведении опытов in vitro, пептиды неонатальной П или селезенки добавляли в среду культивации, в количестве, соответствующему содержанию пептидов в 0,4-0,5 г ткани соответствующего органа на 10,0 мл среды.
Для получения кондиционированных сред, предназначенных для опытов с инкубацией в них поврежденных Г, нами проводилась предварительная инкубация фрагментов ткани П или фрагментов ткани селезенки в культуральной среде 199, которая в процессе инкубации этих тканей обогащалась соответствующими биорегуляторными пептидами. Для приготовления сред, кондиционированных соответствующими органами, мы использовали интактных взрослых крыс. При приготовлении тканевых фрагментов, указанные органы предварительно отмывали от крови, затем механически измельчали на фрагменты размером 0,5-1,0 мм и затем вновь трехкратно отмывали раствором Хэнкса. Культивирование тканевых фрагментов проводили в течение 7-9 часов, - по данным О.Ю. Абакумовой и соавт. (1989) это время является достаточным для обогащения питательной среды биорегуляторными пептидами. Соотношение срезов тканей к среде культивации составляло 0,5 г тканевой взвеси на 10,0 мл питательной среды.
По окончании инкубирования фрагментов кондиционированную среду сливали и хранили в стерильном виде при температуре холодильника (4-6С). Кондиционированную среду обычно использовали на следующие сутки для изучения активности влияния пептидных факторов П и селезенки на состояние Г поврежденной П в опытах in vitro.
Для усиления регуляторной роли пептидов П взрослых животных нами изучалась возможность активации их путем однократного внутрибрюшинного введения животному - донору П - пептидов селезенки (препарат Спленопид) в количестве, соответствующему содержанию их в 0,4-0,5 г ткани селезенки. Через 24 ч П иссекали и использовали для приготовления кондиционированной среды по методу, описанному выше. Полученная среда использовалась в дальнейшем для инкубации токсически поврежденных Г.
Влияние полипептидного комплекса, выделенного из ткани селезенки (препарат Спленопид), на состояние токсически поврежденных гепатоцитов
Для изучения биорегуляторной способности полипептидного комплекса селезенки восстанавливать функциональную активность и пролонгировать жизнеспособность поврежденных Г было проведено 2 группы опытов. В первой группе экспериментов при инкубации поврежденных Г в питательной среде, добавляли препарат Спленопид в количестве, соответствующему 0,4-0,5 г ткани селезенки на 10 мл среды. Таким образом, в первой группе опытов мы оценивали непосредственное влияние пептидов селезенки на состояние поврежденных Г.
Во второй группе опытов поврежденные Г инкубировали в среде, кондиционированной фрагментами ткани П, которая предварительно (за 24 часа) была стимулирована в организме донора препаратом Спленопид. В этой группе опытов мы пытались установить возможность повышения биорегуляторной активности П взрослых животных, воздействуя на них пептидами селезенки.
Результаты проведенных экспериментов показали, что фрагменты ткани П взрослых животных даже после предварительной стимуляции их препаратом Спленопид активировали восстановительные процессы в поврежденных Г в той же степени, что и не стимулированные фрагменты ткани П. Это выражалось в том, что состояние жизнеспособности поврежденных Г в этой серии опытов достоверно улучшалось только к 7 ч наблюдения, как и в контроле. При оценке скорости синтеза мочевины, различия с контролем были достоверными только к 5 ч наблюдения (23,2±1,2 мг/2 106кл/60мин против 18,9±0,1 мг/2 106кл/60мин в контроле, Р 0,05); при детоксикационном тесте различия с контролем были достоверны на 3-4 и 7 ч инкубации (табл. 4, рис. 5).
Проведя сравнительное исследование влияния фрагментов ткани П взрослых животных и фрагментов ткани П взрослых животных, стимулированных препаратом Спленопид, мы пришли к заключению, что дополнительная активация регуляторными пептидами не приводит к значительному повышению эффективности фрагментов ткани П взрослых животных. Это выражалось в том, что в течение всего времени наблюдения мы не обнаружили достоверных различий между этими группами опытов. Эти результаты позволили нам заключить, что с помощью биорегуляторных пептидов препарата Спленопид нельзя рассчитывать на дополнительное усиление выработки биологически активных пептидов в клетках интактной П.
Поскольку тканевые пептиды селезенки способны проявлять свое биорегуляторное воздействие не на интактные, а на поврежденные Г, мы сочли целесообразным далее сравнить активность непосредственного воздействия на поврежденные Г пептидов селезенки, а также сред, кондиционированных фрагментами ткани П и селезенки. Результаты этих исследований представлены в табл. 5, рис. 6. Из таблицы 5 видно, что инкубация Г в питательной среде с добавлением Спленопида более выражено пролонгирует жизнеспособность и повышает функциональную активность поврежденных Г, чем инкубация в средах, кондиционированных фрагментами ткани П и селезенки. Примечательно, что регулирующая роль среды, кондиционированной фрагментами П, была наименее выраженной.
Так, при оценке синтетической функции поврежденных Г при добавлении препарата Спленопид, по сравнению со средами, кондиционированными фрагментами ткани П и селезенки, наблюдалась тенденция к активации синтеза мочевины, хотя достоверных различий мы не выявили. При оценке детоксикационной функции поврежденных Г, использование препарата Спленопид способствует достоверному снижению концентрации антипирина по сравнению с контролем во все сроки наблюдения, а по сравнению со средой, кондиционированной фрагментами ткани П и селезенки, начиная с 5 ч наблюдения (к 7 ч наблюдения эти различия составили 1,3±0,12 против 1,82±0,21 мкг/мл при использовании
Влияние имплантации фрагментов ткани донорской печени и селезенки на восстановительные процессы в токсически поврежденной печени
Наши результаты показали, что при внутрибрюшинном введении фрагментов ткани П и селезенки восстановление структуры поврежденной П идет более интенсивно, чем в группе животных, со спонтанной регенерацией П. Причем, при применении фрагментов ткани селезенки восстановительные процессы протекали быстрее, чем при применении фрагментов ткани П (табл. 11, 12, рис. 17, 18).
Мы нашли, что снижение количества двуядерных Г и повышение количества полиплоидных Г прекращалось к 14 суткам наблюдения, а к 21 суткам либо происходила (при использовании фрагментов ткани селезенки), либо отмечалась тенденция к изменению этих показателей в противоположном направлении. Так содержание двуядерных Г к 21 суткам наблюдения в контроле было 27,7±2,6%о (у интактных животных -54,8±7,2%о), при использовании фрагментов ткани П - 32,7±3,2%о, а при использовании фрагментов ткани селезенки - 39,3±2,5%о, и это различие было достоверным по отношению к контролю (Р 0,05). При изучении динамики изменения количества полиплоидных Г мы отметили тенденцию к более резкому повышению содержания таких клеток к 14 суткам наблюдения и более резкое, хотя и недостоверное снижение к 21 суткам по отношению к контролю. В то же время при подсчете содержания Г с внутриядерными липидными включениями мы отметили достоверное снижение содержания их при использовании фрагментов ткани селезенки на 14 и 21 сутки по сравнению с контролем, а при использовании фрагментов ткани П - только к 14 суткам наблюдения (табл. 11).
При сравнении этих морфологических показателей с показателями у интактных животных мы нашли, что количество двуядерных и полиплоидных Г, а также количество Г с внутриядерными липидными включениями указывало на незавершенность восстановительного процесса в П, хотя показатели функции П достигли или приблизились к контрольным значениям.
Подтверждением более выраженного регулирующего воздействия фрагментов ткани селезенки по сравнению с фрагментами ткани П служат данные о достоверно более высоком уровне активности АлАт в сыворотке крови крыс, получавших лечение фрагментами ткани П к 21 суткам наблюдения: 0,69±0,01 против 0,4±0,02 мккат/л и более высоком уровне активности АсАт к 5 и 14 суткам наблюдения: 0,8±0,03 против 0,6±0,02 мккат/л к 14 суткам (Р 0,05) (табл. 12).
Таким образом, опыты по применению фрагментов ткани П и селезенки показали, что клеточно-тканевая терапия ускоряет процесс регенерации П по сравнению со спонтанной регенерацией, однако, ткань селезенки обладает боле выраженным регулирующим воздействием по сравнению с применением фрагментов ткани П взрослых животных.
При внутрибрюшинном введении препарата Спленопид через 1 день после прекращения затравки крыс выявляется жировая дистрофия П. Характер распределения очагов липидной дистрофии аналогичен распределению в группе со спонтанной регенерацией (контроль): наибольшему повреждению подвергаются участки печеночной дольки, располагающиеся вблизи портального тракта. Ближе к центру долек обнаруживаются участки, занятые Г, находящихся в процессе мелкокапельной жировой дистрофии. К 5 суткам после завершения затравки выявляются мелкие единичные очаги жирового перерождения Г, а также обширные очаги лимфогистиоцитарной инфильтрации ткани П, расположенные по ходу портального тракта в междольковой соединительной ткани (рис. 19). На более поздних сроках наблюдения (21 сутки) структура П выглядит практически восстановленной (рис. 20). Восстанавливается балочная структура П; форма печеночных долек приближается к классической норме.
При изучении морфологических показателей регенерации П под влиянием препарата Спленопид мы нашли, что подобно опытам с применением фрагментов ткани селезенки, при использовании препарата Спленопид, начиная с 14 суток происходило увеличение количества двуядерных Г, которое оказывалось достоверным по сравнению с контролем к 21 суткам наблюдения (табл. 13, рис. 21): 44,5±5,8%о вместо 27,7±2,6%о (Р 0,05). При подсчете количества полиплоидных Г динамика фазного изменения этого показателя при использовании Спленопида была более выраженной, чем при использовании фрагментов ткани П и селезенки. На 5 сутки наблюдения под влиянием Спленопида происходило достоверно более резкое повышение содержания полиплоидных Г, чем в других опытных группах и это повышение было достоверным по сравнению с контролем: 81,5±4,6%о вместо 64,5±4,6%о (Р 0,05). Примечательно, что резко выраженные различия в размерах ядер Г к 5 суткам наблюдения (рис. 22) совпадала со значительным усилением лимфогистиоцитарной инфильтрации П, которая, по современным представлениям обеспечивает интеграцию и координацию внутритканевых (печеночных) взаимодействий, а сами активированные лимфоциты и гистиоциты принимают участие в восстановительных процессах Г (И.В. Попова, 1975; Д.С. Саркисов, 1977; А.Г. Бабаева, 1985, 1989).
К 21 суткам наблюдения количество полиплоидных Г под влиянием Спленопида оказывается на достоверно более низком уровне, чем в контроле: 54,0±3,7%о против 67,5±4,1%о (Р 0,05). При использовании фрагментов ткани селезенки и П, хотя и имело место снижение количества полиплоидных Г к 21 суткам наблюдения, однако, это снижение было не достоверным.
Мы отметили также, что к 14 и 21 суткам наблюдения под влиянием пептидов селезенки происходило более резкое снижение содержания Г с внутриядерными липидными включениями по сравнению с контролем, подобно тому, как это имело место при использовании фрагментов ткани селезенки. На рис. 23 представлено электронно-микроскопическое исследование, подтверждающее липидную природу обнаруженных нами внутриядерных включений.
При оценке функционального состояния П крыс с токсическим гепатитом под влиянием препарата Спленопид (табл. 13, рис. 24) мы отметили ускоренное восстановление детоксикационной функции и более быструю нормализацию показателей цитолиза по сравнению с методом, основанным на трансплантации фрагментов ткани П и селезенки: восстановление функций происходило уже на 14 день наблюдения.
Более высокую регулирующую активность пептидов селезенки не только по сравнению с фрагментами ткани П, но и с фрагментами ткани селезенки мы объясняли тем, что технология изготовления пептидного комплекса включает разрушение мембранных структур клеток и экстракцию из них тех пептидов и белков, которые в норме не диффундируют через клеточные мембраны; в высвободившемся состоянии эти белки и пептиды, очевидно, и осуществляют более выраженный регуляторный эффект.
