Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Современные представления о возможностях применения стволовых и прогениторных клеток для восстановительного лечения поврежденных органов . 13
1.1. Стволовые и прогениторные клетки как биорезерв для развития клеточных технологий. 13
1.2. Биологическая характеристика популяционного состава клеток костного мозга . 28
Глава II. Материалы и методы исследования. 41
2.1. Общая характеристика экспериментального материала. 41
2.2. Технология получения и ведения клеточных культур. 45
2.3. Техника моделирования органов и тканей. 59
2.4. Методы исследования, используемые в организме после трансплантации клеток . 61
2.5. Методы статистической обработки. 66
Глава III. Культивирование как способ вьивления и реализации биологических и терапевтических эффектов клеток костного мозга 67
3.1. Изучение возможности предифференцировки мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга . 67
3.2. Исследование продукции цитокинов и фенотипа клеток костного мозга человека. 82
Глава IV. Использование клеток костного мозга для восстановления структуры и функции поврежденных органов и тканей в эксперименте . 85
4.1. Характеристика функционального и морфологического состояния сердца после криодеструкции и трансплантации клеток в принекротическую зону. 85
4.2. Характеристика процесса регенерации кожи после термодеструкции и трансплантации клеток на ожоговую поверхность . 91
4.3. Характеристика процесса регенерации трубчатых костей после обширных резекций и применения имплантантов с иммобилизованными мезенхимальными прогениторными клетками костного мозга. 97
4.4. Использование аллогенных клеток фетальной печени и ядросодержащей фракции клеток аутологичного костного мозга для коррекции дислипидемии и ранних стадий атеросклероза. 104
Глава V. Заключение. 117
Выводы. 128
Практические рекомендации. 129
Цитируемая литература. 130
- Биологическая характеристика популяционного состава клеток костного мозга
- Методы исследования, используемые в организме после трансплантации клеток
- Изучение возможности предифференцировки мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга
- Характеристика процесса регенерации кожи после термодеструкции и трансплантации клеток на ожоговую поверхность
Введение к работе
В последние 20-30 лет в России, также как и во всем мире стали отчетливо проявляться тревожные тенденции старения населения, неуклонного роста хронических заболеваний и инвалидизации людей трудоспособного возраста (отчет ВОЗ за 2002 год). Затраты на лечение, реабилитацию и социальную поддержку такого контингента больных ложатся тяжелым бременем на государственный бюджет и поглощают значительную часть средств, ежегодно выделяемых на здравоохранение.
Указанные обстоятельства настоятельно требуют совершенствования современной системы терапии, которая в значительной степени может быть достигнута благодаря освоению и внедрению в клиническую практику новых более эффективных и доступных методов восстановительного лечения больных.
Современное развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии сделали клетку не только главным объектом лечебного воздействия, но и средством лечения многих заболеваний. Так для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация аллогенных фетальных и неонатальных ксеногенных культур островковых клеток поджелудочной железы (В.ШПумаков, Н.Н.Скалецкий, 1998), для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение к протоку органа ксеногенных гепатоцитов и спленоцитов (Demetriou et.al. 1995, НАОнищенко и др. 1995, В.ШПумаков и др. 1998), терапия аллогенными фетальными клетками используется для лечения ожогов (Д.С.Саркисов, 1995), миодистрофии Дюшена (В.С.Репин, Г.Т.Сухих 1998) и др.
Между тем, острый дефицит фетального аллогенного материала, обладающего высокой биологической активностью, и существование биоэтических проблем его использования (Ю.М.Лопухин, 2002), призыв к ограничению использования ксеногенных источников из-за их более высокой антигенности, опасности заражения прионами и другими инфекциями, а также необходимость стандартизации используемых клеток и приготовления из них клеточных препаратов, обусловили в последние пять лет пробуждение повышенного интереса исследователей всего мира к проблемам стволовых клеток и, в частности, к проблемам использования аутологичных стволовых клеток костного мозга в медицине из-за безопасности их применения и отсутствия необходимости решения при этом этико-правовых проблем (Perm et.al. 2003; Assmus et. al.2002; Hess etal. 2002; Iversen et.al. 2000; Strauer, Kornowski 2003).
Приступив в 2000 году к изучению возможности применения стволовых клеток костного мозга в восстановительной медицине, мы убедились в том, что биологические возможности клеточной терапии стволовыми клетками остаются мало изученными и поэтому нереализованными, особенно в России, так как исследования в области клеточных биотехнологий в нашей стране тогда находились на самом начальном этапе своего развития. В частности, в литературе отсутствовали четкие представления о механизмах и путях реализации терапевтических эффектов клеточных технологий, не были отработаны методы предифференцировки мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток (МСК) в различные типы клеток (в частности в кардиомиоцитоподобные клетки) и не использовались широко тканеспецифические маркеры предифференцировки для контроля оптимизации сроков диффренцировки МСК перед трансплантацией, не была отработана техника идентификации предифференцированных прогениторных клеток в соответствующих тканях после трансплантации, а также не проводилась количественная оценка воздействия аутологичных прогениторных клеток стромального и гемопоэтического ряда на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов. Отсутствие таких данных позволило нам сформулировать следующие цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы:
Оптимизировать технологические режимы культивирования прогениторных клеток костного мозга и предифференцировки МСК в кардиомиоцито-, остеобласто- и фибробласто-подобные клетки, а также изучить влияние этих клеток на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов.
Задачи работы.
1. Отработать методику раздельного выделения из костного мозга гемопоэтических и МСК и изучить влияние процесса культивирования на функциональную активность этих клеток.
2. Отработать режимы культивирования и предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, остеобластоподобные и фибробластоподобные клетки in vitro и подтвердить состоявшуюся кардиогенную и остеогенную предифференцировку клеток.
3. Отработать методику маркирования клеток для выявления их в соответствующих мягких тканях после трансплантации.
4. Количественно оценить регенерацию поврежденных органов (сердце) и тканей (кожа, сосуды) при трансплантации в поврежденные зоны прекультивированных аутологичных прогениторных клеток костного мозга стромального и гемопоэтического ряда и сравнить эффективность лечения с результатами трансплантации аллогенных фетальных клеток в модельных опытах на животных с криодеструкцией миокарда, с глубоким ожогом кожи и с дислипидогенным гепатозом и микроангиопатией.
5. Разработать технологию восстановления целостности длинных трубчатых костей с помощью иммобилизованных аутологичных клеток костного мозга в модельных опытах с резекцией кости.
Выполнение работы осуществлялось в рамках программы «Клеточные технологии медицине» по заданию Росздрава России (регистрационные №№ 01.2.00 305441 и 01.2.00 305442).
Научная новизна.
Установлено, что в процессе культивирования гемопоэтических и МСК костного мозга активизируются функциональные потенции этих клеток, в результате чего процедуру культивирования аутологичных клеток костного мозга следует рассматривать как необходимый этап для осуществления успешной клеточной терапии. При культивировании гемопоэтической фракции клеток костного мозга это выражается изменением фенотипического состава клеток и продукции цитокинов, для фракции стромальных клеток - их дифференцировкой и продукцией цитокинов (IL-10, G-CSF и TGFp).
В опытах in vitro отработана технология направленной дифференцировки МСК в остеобластоподобные, кардиомиоцитоподобные и колониеобразующие фибробластоподобные клетки путём создания адекватного состава культуральной среды. При дифференцировке МСК в кардиомиоцитоподобные клетки к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), напоминающие миотрубочки, которые обладают способностью спонтанно и ритмично сокращаться. К 4-ой неделе культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток достигает своего максимума - 35-40% от общего количества клеток в культуре.
Проведена идентификация кардиомиоцитоподобных клеток по окраске на тропонин I, фибробластоподобных клеток - на коллаген I типа, виментин и CD133, а остеобластоподобных клеток - на коллаген I типа, на щелочную фосфатазу и остеопонтин. Глубокая дифференцировка клеток в культуре тормозит процесс пролиферации и понижает их жизнеспособность, делая их непригодными для трансплантации.
На моделях острого повреждения тканей у животных: кожи, сердца и трубчатых костей, а также при моделировании дислипидемии с хроническим повреждением стенки сосудов, установлены позитивные терапевтические эффекты применения прогениторных клеток костного мозга после культивирования. Показано, что трансплантация фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток ауто- и аллогенного костного мозга на ожоговую поверхность кожи ускоряет процесс заживления кожных ран более интенсивно, чем трансплантация фетальных фибробластов.
Было установлено, что, кардиомиоцитоподобные клетки аутологичного костного мозга, повышают систолическую функцию левого желудочка как при воздействии на него нагрузки объемом, так и при воздействии нагрузки сопротивлением.
Показано, что дополнительная иммобилизация МСК из аутологичного костного мозга на аллогенном деминерализованном костном имплантате ускоряет процесс остеогенеза и сокращает сроки репаративной регенерации длинных трубчатых костей.
Показано, что для коррекции дислипидемии и ранних проявлений атерогенеза могут использоваться как клетки аллогенной фетальной печени, так и прогениторные клетки аутологичного костного мозга; однако эффект последних более пролонгирован по коррекции показателей микроангиопатий.
Практическая значимость работы.
Отработаны технологические режимы предифференцировки мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга в колониеобразующие фибробластоподобные, кардиомиоцитоподобные и остеобластоподобные клетки. Предложено для трансплантации предифференцированных клеток использовать относительно короткие сроки предифференцировки (не более 2-х - 3-х недель для кардиомиоцито- и остеобластоподобных клеток), учитывая, что образование 75% монослоя совпадает с осуществлением начальных стадий дифференцировки в заданном направлении.
С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего LacZ-ген E.coli, внедренного в фетальные специализированные клетки (кардиомиоциты, фибробласты) и МСК костного мозга на этапе их культивирования, доказано присутствие и функционирование этих клеток в течение, по-крайней мере, 3-4 недель после трансплантации в зону повреждения.
Показана перспективность применения стволовых клеток аутологичного костного мозга для ускоренного и более эффективного восстановительного лечения поврежденных органов: при ожоговых ранах, при деструктивных процессах в миокарде, при дислипидемическом повреждении сосудов, печени и при нарушениях целостности трубчатых костей. Разработанный метод восстановления целостности трубчатых костей с помощью костных имплантатов, содержащих иммобилизованные аутологичные стволовые клетки костного мозга, внедрен в клиническую практику. На способ восстановления целостности трубчатых костей, предусматривающий дополнительную фиксацию дистальной и проксимальной зоны костного дефекта губчатым матриксом с адгезированными на нем аутологичными клетками костного мозга, получен патент РФ № 2240135 от 20 ноября 2004г «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости».
Апробация диссертации.
Основные положения диссертации доложены:
На II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам, Москва, октябрь, 2002.
На I Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в Здравоохранении», Москва, 22 мая, 2003.
На ХШ Международной конференции по проблеме "Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии", 17-18 июня 2003, Пущине
На 2-й Международной конференции "Патофизиология и современная медицина", Москва, 22-24 апреля 2004.
На Ш Российском конгрессе по патофизиологии, Москва, 9-12 ноября 2004.
На Ш Всероссийском съезде по трансплантологии и искуственным органам. Москва, 28-30 октября 2005 г.
На 12-ом Всемирном конгрессе по заболеваниям сердца (World Congress on Heart Disease «New Trends in Research Diagnosis and Treatment», to be held at the Hyatt Regency Vancouver, in Vancouver, B.C., Canada, July 16-19,2005.
Апробация работы состоялась на межлабораторной конференции ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов 3 ноября 2005 г.
По теме диссертации опубликовано 21 работа, из них 16 в центральной печати, 4 в зарубежной печати и 1 патент РФ.
Биологическая характеристика популяционного состава клеток костного мозга
Это наиболее полно охарактеризованная популяция СК, существование которых было доказано более 40 лет тому назад классическими исследованиями Till, McCulloch (1961), Becker etal. 1963; Wu et. al., 1968. Эти авторы, используя метод адоптивного переноса, установили, что популяция клоногенных клеток костного мозга способна генерировать образование миелоэритроидных колоний в селезенке летально облученных сингенных мышей и при этом не только поддерживала жизнь животных, но и обеспечивала восстановление всех форменных элементов крови. Позднее существование подобных ГСК было доказано и у человека.
ГСК обеспечивают в организме непрерывность процесса обновления клеточного состава крови, который происходит за счет пролиферации и дифференцировки этих клеток в костном мозге, а также последующей миграции их в виде более зрелых клеточных популяций из костного мозга в кровоток и вторичные лимфоидные органы (сукцессия) и обратно в костный мозг.
Все гематопоэтические клетки - лимфоидные и миелоидные - происходят из одной общей плюрипотентной стволовой клетки, способной как к непрерывному самовоспроизведению, так и к поступательной дифференцировке (То et.al. 1997; Е.Б.Владимирская, А.Г.Румянцев, 2002).
У животных выделено по крайней мере 2 класса плюрипотентных (мультипотентных) стволовых клеток: долгоживущие и короткоживущие клетки (Morrison, Weissman, 1994).
Долгоживущие ГСК пролиферируют, самообновляясь в течение всей жизни животного. У мышей, например, показано, что одна такая клетка приходится на 10-15 тысяч костномозговых клеток, причем 8-10% долгоживущих ГСК ежедневно вступает в цикл клеточного деления (Weissman, 2000). Долгоживущие ГСК имеют высокий уровень теломеразной активности, который, как известно, присущ лишь недифференцированным и часто делящимся клеткам.
Короткоживущие ГСК пролиферируют, самообновляясь в течение ограниченного срока (до нескольких месяцев), причем, по данным Guenechea et.al. (2001), эта популяция клеток у человека гетерогенна и в ней различные клетки существенно различаются по срокам самообновления и способности восполнения состава гематопоэтических клеток. Короткоживущие ГСК дифференцируются в лимфоидные или миелоидные предшественники, т.е. дифференцируются в те два класса предшественников, которые формируют две линии развития клеток крови. Лимфоидные предшественники дифференцируются в Т-клетки, В-клетки и натуральные киллеры, причем механизмы, которые ведут клетки по этому пути их дифференцировки, до сих пор исследуются (Akashi etal. 1999).
Миелоидные предшественники дифференцируются в моноциты-макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, мегакариоциты и дендритные клетки (Akashi et.al. 2000).
Развитие и дифференцировка ГСК в костном мозге регулируются специфическим клеточным микроокружением (кроветворной стромой) и гемопоэтическими ростовыми факторами, которые концентрируются в костном мозге в местах образования клеток крови с помощью экстрацеллюлярного матрикса стромальных клеток (Hunt et.al. 1987; Whitlock et.al. 1987).
Эти факторы включают (А.Г.Румянцев, А.А.Масчан, 2003): цитокины, которые оказывают преимущественное воздействие на наименее дифференцированные популяции ГСК (IL-3, Flt-3-лиганд, 8СР{с-кіі}-лиганд - фактор стволовых клеток), цитокины, которые действуют на многих уровнях гемопоэза (GM-CSF -гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, G-CSF -гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), и цитокины, которые влияют преимущественно на рост и дифференцировку более зрелых предшественников (эритропоэтин, тромбопоэтин и др.). Применение некоторых из этих цитокинов -например G-CSF - в качестве фармакологических препаратов создало предпосылки для использования периферической крови в качестве источника ГСК в клинике (Schaison et. al.1998).
Не менее важную роль для пролиферации и дифференцировки ГСК играют также взаимодействия клеток с адгезионными молекулами экстрацеллюлярного матрикса стромы костного мозга (Verfaillie 1998; Zandstra et.al. 2000). В условиях Dexter-культуры, состоящей из трех типов клеток (макрофаги 35%, гематопоэтические клетки 5% и негематопоэтические -мезенхимальные клетки 60%) было показано (Seshi etal. 2000), что плюридифференцированные мезенхимальные прогениторные клетки способны поддерживать гематопоэз, поскольку выявлялась одновременная экспрессия нескольких гематопоэтических ростовых факторов и рецепторов экстрацеллюлярного матрикса, включая G-CSF, SCFIc-kit-лиганд}, VCAM-1 {vascular cell adhesion molecule зо 1, CD-106}, ІСАМ-1 {intercellular adhesion molecule-1, CD54} и ALCAM {activated leukocyts adhesion molecule, CD-I66}).
Так как ГСК, включая прогениторные клетки или клетки - предшественники, морфологически выглядят как малые лимфоциты (менее дифференцированные клетки), а в случае более зрелых предшественников они выглядят как бластные формы лимфоцитов, то из-за отсутствия специфических морфологических признаков эти клетки стали идентифицировать путем иммунофенотипического анализа поверхностных антигенов - CD антигенов этих клеток (выявление кластеров дифференцировки) с помощью моноклональных антител. Антигены клеточной дифференцировки оказались очень важным семейством поверхностных антигенов, т.к. они характеризуют принадлежность кроветворных клеток костного мозга к тому или иному типу и стадии зрелости (Kishimoto et.al. 1997). Однако CD-антигены служат не только маркерами для характеристики различных популяций гемопоэтических клеток костного мозга: они выполняют также функцию адгезивных структур и рецепторов к линейно-специфическим гормонам (эритропоэтин, гранулоцитопоэтин и т.д.) и различным цитокинам. К настоящему времени общее число CD-антигенов, выявленных на ГСК, достигло уже 250.
Наиболее общим антигеном ГСК, пригодным для характеристики этих клеток, является молекула CD-34, которая маркирует и наименее дифференцированные стволовые клетки и более дифференцированные клетки-предшественники, но при этом отсутствует на зрелых гемопоэтических клетках.
Методы исследования, используемые в организме после трансплантации клеток
Трансплантацию клеток животным после моделирования повреждения органов обычно осуществляли под наркозом (кроме опытов с моделированием термического повреждения кожи). Животных (крысы, морские свинки, кошки) наркотизировали смесью (кетамин {препарат «Калипсол»} в дозе 50мг/кг, ксилазолина {препарат «Рометар»} в дозе 10 мг/кг и димедрола 1%). Эти препараты смешивали в одном шприце из расчета: 0,03 мл/100г - ксилазолина, 0,04 мл/100г - кетамина и 0,06 мл/100г -димедрола и вводили внутримышечно.
После моделирования повреждения миокарда у крыс клеточный материал (фетальные кардиомиоциты и предифференцированные аутологичные МСК) вводили в количестве 1-1,5 х10б клеток, ресуспендированных в 100 мкл бессывороточной среды, инъекционно в 5 точек краевой зоны некроза через 7-8 дней после криодеструкции. Животным, которым трансплантировали фетальные кардиомиоциты, дополнительно вводили циклоспорин А в дозе 5 мг/кг в сутки подкожно.
После моделирования ожоговых ран у крыс суспензию клеток (фибробластоподобные МСК и фетальные фибробласты) наносили на поверхность ожоговой раны (50 см2) с помощью пипетки в количестве 1x10 клеток на вторые сутки после моделирования ожога и иссечения образовавшегося некротического струпа. Через 30 мин. после трансплантации клеток (время необходимое для прикрепления клеток к ожоговой поверхности) ожоговую рану закрывали марлевой салфеткой, смоченной физ. раствором с гентамицином.
После резекции лучевой кости у кошек клетки (предифференцированные аутологичные МСК) применяли сразу в составе деминерализированного костного имплантата, на котором они были иммобилизованы, с плотностью посадки не менее 2-4 xl О4 клеток/см2 и ЗОхЮ4 клеток/см3.
В процессе моделирования хронической дислипидемии и ранних стадий атерогенеза в асептических условиях проводили лапаротомию, мобилизировали нижний полюс селезенки и медленно (в течение 2 мин) в паренхиму нижнего полюса селезенки вводили 1 мл суспензии клеток в физ. растворе иглой 26G. Брюшную полость ушивали послойно, наглухо. Для профилактики инфекционных осложнений, интраоперационно и последующие 2 дня назначали гентамицин - 20 мг/сут.
Суспензию клеток фетальной печени и стволовых клеток костного мозга для трансплантации готовили на физ. растворе и вводили в количестве 2x107 клеток/мл. Клетки вводили через 2 месяца содержания животных на определенном режиме питания - либо на атерогенной диете - опытные группы, либо на молочной диете -группы сравнения, без отмены установленной диеты в посттрансплантационном периоде еще в течение 4 месяцев.
Посттрансплантационный период (после введения аллогенных клеток фетальной печени) не сопровождался назначением иммуносупрессивной терапии.
Среди маркеров трансплантированных клеток наиболее популярна Р-галактозидаза из E.coli (Soonpaa et.al. 1994; Shaked et.al. 1994; Rusr et.al. 1998; Kizshenbaumetal et.al. 1993; Cepko etal. 1993; McGregor 1991; Muramatsu et.al. 1997; Goto et.al. 1999; Holtmaat et.al. 1996; Teramoto et.al. 1999). Эндогенная р-галактозидаза нетоксична для клеток, но многие клетки млекопитающих имеют собственный ген Lac Z, продуцирующий эукариотическую Р-галактозидазу, которая может давать фон, мешающий идентификации маркированных клеток. Однако бактериальная р-галактозидаза существенно отличается по свойствам от эукариотического фермента и это обстоятельство позволяет исключить фоновую окраску.(Young et al 1993).
В своей работе для контроля доставки стволовых и фетальных клеток в заданную область, а также для мониторинга активности их функционирования был использован оригинальный рекомбинантный аденовирусный вектор с бактериальным геном E.coli - LacZ (Ad-SV40-pGal).
Оригинальная рекомбинантная аденовирусная конструкция Ad-SV40p-Gal была получена А.Ю.Григорьевой и А.О.Жигулиным (НПАО «Силекс-М») путем гомологичной рекомбинации в линии клеток 293 между линеаризированной плазмидной ДНК pAdp-Gal и большим фрагментом Ad5, полученным рестрикцией данного аденовируса по Clal. Плазмида pAdpGal содержала кассету, состоящую из нуклеотидного фрагмента размером 454 п.н. 5 -концевого инвертированного повтора аденовируса, LacZ-гена под промотором SV40 и части аденовируса (3328-6241 п.н.), необходимой для гомологичной рекомбинации. Для трансфекции ДНК в клетки применяли кальций-фосфатный метод. Полученные в результате гомологичной рекомбинации вирусные бляшки отбирали и анализировали на способность к экспрессии LacZ-гена. Отобранный рекомбинантный аденовирус наращивали в линии клеток 293 (имеющих гены, недостающие дефектному аденовирусу Ad-SV40-pGal для размножения), концентрировали в градиенте плотности CsCl, подтверждали соответствие полученной конструкции рестрикционным картированием. Полученный в результате рекомбинантный вирус титровали и использовали для дальнейшей работы.
Рекомбинантный вирус по мере необходимости нарабатывли в культуре клеток линии 293 и хранили при -70С для дальнейшего использования. Для титрования инфекционной активности вируса использовали клетки Vero.
Инфицирование прогениторных и фетальных клеток рекомбинантный вирусом производили добавлением суспензии рекомбинантного аденовируса к клеткам в культуральной среде в соотношении 1:15 клеток/БОЕ. После 24 часов инкубирования при 37 С в С02-инкубаторе (метод Wakitani 1995), эффективность трансфекции клеток в
культуре, І исголоіическое определение р-галактозидазы в органах через разные сроки после введения меченных клеток производили на срезах тканей тем же стандартным методом. В ряде случаев наличие маркерной Р-галактозидазы подтверждали также методом иммуногистохимического окрашивания с мышиными моноклональными антителами к Р-галактозидазе E.coli. Антитела были любезно предоставлены В.К.Сологубом (Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения-ВНЦМДЛ). Для исключения возможности выявления эндогенной р-галактозидазы ставили параллельные контрольные опыты без введения в клетки Ad-SV40-BGal. Для выявления меченных клеток в тканях органов через определенные исследуемые сроки после их трансплантации брали биопсию в объеме 30-50 мм3 и замораживали биопсийный материал до -70С. Готовили криостатные срезы толщиной 5 мкм на криостате МК25М (завод «Технолот», СССР). Подготовленные срезы подсушивали и отмывали 2 раза холодным PBS. Затем на срезы наносили фиксирующий раствор (PBS 4680 мкл, глютаровый альдегид 25% 50 мкл, формальдегид 37% 270 мкл) на 10 мин при 4. Далее срезы отмывали 2 раза холодным PBS и на них наносили красящий раствор (PBS 4400 мкл, X-Gal 5 мг в 200 мкл диметилсульфоксида, 2М MgCb 5 мкл, 0,5М K3(Fe(CN)e) ЗОмкл, 0,5M K4(Fe(CN)6) ЗОмкл) на 12 часов при 37С. Затем срезы отмывали в PBS и заключали под покровное стекло.
Для отрицательного контроля использовали соответствующие культуры немеченных клеток, для положительного контроля - культуры меченных клеток, которые окрашивали аналогичным гистохимическим методом.
Изучение возможности предифференцировки мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга
Для исследования процессов регенерации поврежденной кожи и кости брали биоптаты из зон повреждения и готовили либо криостатные срезы, либо сначала их фиксировали в 10% формалине, а затем готовили срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином.
Морфологические изменения в печени и аорте при моделировании дислипидемии и ранних стадий атерогенеза изучали на криосрезах, окрашенных на жир по Гольдману. При окраске макропрепаратов аорты на жир использовали судан-IV. Состояние микроциркуляторного русла оценивали на тотальных пленочных препаратах брыжейки тонкой кишки, импрегнированной азотнокислым серебром (по Куприянову
B.B., 1975). Морфометрию микрососудов проводили на полуавтоматической системе анализа изображения "Leitz-ASM" (Германия).
Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием методов вариационной статистики. Статистический анализ проводился в программе EXCEL пакеты MS Office и Biostat 4.03. Для сравнения количественных показаний использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. Межгрупповые отличия считались достоверными при р 0,05. Считаю необходимым отметить, что выполнение отдельных этапов работы проводилось совместно и при непосредственном участии научных сотрудников лаборатории - биотехнологии стволовых клеток ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава (зав. лаб. - д.м.н., проф. Н. А. Онищенко): к.м.н. И. В. Потапова, к.м.н. М. Ф. Расулова, к.м.н. А. В. Берсенева, к.м.н. В. А. Зайденова; сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН (зав.лаб. - чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессор О. М. Позняков): д.м.н. Е. Д. Клименко, Л.П. Кобозева, А.Б. Мичунская и сотрудников лаборатории иммунокоррекции ФГУ НИИТиИО Росздрава - (зав. лаб. - проф. Сускова B.C.). Адекватное содержание животных в хроническом эксперименте обеспечивали сотрудники вивария ФГУ НИИТиИО Росздрава (зав. Аврамов П.В.). Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе. Культивирование как способ выявления биологических и терапевтических эффектов клеток костного мозга. Для выделения МСК нами была применена технология очистки суспензии клеток КМ от клеток эритроцитарного ряда и тромбоцитов (ресуспендирование в лизирующем растворе), далее в среде (skov s с добавками мы продолжали культивировать МСК обычно в течение 3-4 недель для наращивания клеточной массы (исходно содержание МСК в КМ не превышает 1,5-2,5 %), неприкрепляющиеся клетки удалялись при смене среды. Затем клетки пересаживали в лунки 24-луночного культуральною планшета с покровными стеклами, обработанными раствором пол и-1,-лизина и культивировали в течение 3-5 суток в той же среде. Микроскопическая картина образующегося монослоя прикрепившихся стромальных клеток представлена на рис. 8. Из рисунка видно, что через 8 недель культивирования формируется монослой распластанных клеток, на фоне которого Эти данные свидетельствуют о том, что популяция МСК в культуре растет и развивается. Присутствие в культуре 20% клеток CD133+ указывает, что наряду со зрелыми МСК (окраска на виментин) присутствует популяция молодых клеток, которая, очевидно, будет более быстро подвергаться дифференцировке в другие клеточные фенотипы при создании соответствующих условий. Таким образом, приведенные микроскопические и иммуноцитохимические исследования позволили убедиться в том, что была отработана и применена адекватная методика получения МСК в культуре. Далее мы считали важным показать, что исходно одна и та же культура МСК может стать источником для получения клеток нескольких фенотипов, при использовании адекватно подобранных культуральных сред и условий для их культивирования. Принято считать, что физиологическая и восстановительная регенерация органов происходит за счет имеющихся в этих органах регионарных стволовых, а точнее, прогениторных клеток (Salven Р, Mustjoki S, Alitalo R et. al. 2003; Stamm C, Westphal B, Kleine HD et. al. 2003). Между тем при глубокой степени повреждения паренхимы органов, когда нарушена воспринимающая, индукционная и пролиферативная активности регионарных прогениторных клеток, возникает необходимость искусственного привнесения в очаг поражения направленно предифференцированных МСК для выполнения ими функций регионарных прогениторных клеток. Необходимость предифференцировки МСК перед трансплантацией диктовалась еще и тем, что стволовым клеткам КМ присущ эффект хоминга (homing) и поэтому для удержания МСК КМ в очаге повреждения (в зоне трансплантации) эти клетки должны иметь свойства клеток соответствующего органа (ткани). Основываясь на представлениях о необходимости направленной фенотипической индукции процессов регенерации в поврежденном органе для восстановления его функции нами была проведена работа по отработке режимов предифференцировки МСК в кардиомиоцитоподобные, фиброблхтоподобные, остеобластоподобные и адипоцитоподобные клетки.
Характеристика процесса регенерации кожи после термодеструкции и трансплантации клеток на ожоговую поверхность
Примечательно, что после предварительного маркирования ФКМЦ и ПМСК в культуре рекомбинантным аденовирусным вектором с бактериальным геном E.coli - LacZ (Ad-SV40-(3Gal) и трансплантации этих клеток в принекротическую зону, методом гистохимичиского окрашивания на р-галактозидазу было установлено, что, по крайней мере, через 3 недели после трансплантации сохраняется присутствие ФКМЦ и ПМСК в принекротической зоне (Рис. 24). Эти данные позволяют связать все описанные выше эффекты клеточной терапии с присутствием в сердечной мышце жизнеспособных ФКМЦ и ПМСК.
Проведенные эксперименты позволяют заключить: 1) Исследование насосной функции изолированных интактных и поврежденных сердец на стендовой установке в условиях применения дозированных пред - и постнагрузок на ЛЖ позволяет выявить признаки скрытой левожелудочковой недостаточности в криоповрежденных сердцах и признаки ослабления повреждения миокарда при трансплантации в него ФКМЦ и ПМСК КМ. 2) Через 3 недели после трансплантации ФКМЦ и МСК КМ (группы 3 и 4) некоторые показатели насосной функции ЛЖ либо не отличались от аналогичных показателей у интактных сердец (1-я группа), либо были достоверно выше чем в контроле (группа 2). 3) ФКМЦ и ПМСК КМ, трансплантированные в миокард, повышают систолическую функцию ЛЖ в режиме последовательного повышения преднагрузок. Трансплантация ПМСК КМ повышает устойчивость миокарда и к воздействию постнагрузок. 4) Повышение функционального состояния поврежденного сердца после трансплантации клеток, связано с длительным присутствием в миокарде (по крайней мере в течение 3 недель) жизнеспособных аллогенных ФКМЦ и аутологичных ПМСК костного мозга (по окраске на Р-галактозидазу). В настоящем разделе работы была поставлена задача изучить особенности регенерации глубоких ожоговых ран под влиянием трансплантации на их поверхность алло- и аутогенных фибробластоподобных мезенхимальных стромальных (прогениторных) ККМ (ФМСК), а также обосновать возможность использования этих клеток в качестве доступного и пригодного донорского материала для лечения ожоговых больных. Важность такого исследования определялась тем, что предыдущими исследованиями (В.П. Туманов и др. 1990; Д.С. Саркисов и др. 1996; Г.З.Саидгалин и др. 2000) была установлена способность фетальных фибробластов (ФФ) стимулировать заживление ожоговых ран и снижать летальность среди больных с ожоговой травмой, однако законодательные запреты на получение и использование фетальных тканей для лечения больных не позволяют использовать ФФ в клинической практике. Опыты были выполнены на 40 крысах-самцах линии Вистар, у которых моделировали глубокий ожог кожи размером 18-20 % от общей поверхности кожи крыс (см. Глава II). Животные были разделены на 4 группы: 1) крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аллогенных ФФ (10 крыс); 2) крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аллогенных ФМСК (10 крыс); 3) крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аутогенных ФМСК (10 крыс -группа сравнения); 4) крысы с глубоким термическим ожогом без применения клеточной терапии (10 крыс, контрольная группа). Суспензию ФМСК и ФФ (получение клеток см. главу II) наносили на поверхность ожоговых ран с помощью пипетки в количестве 2x10 клеток на вторые сутки после моделирования ожога и иссечения образовавшегося некротического струпа. После трансплантации клеток, через 30 минут (время необходимое для прикрепления клеток к ожоговой поверхности), ожоговую рану закрывали марлевой салфеткой, смоченной физиологическим раствором с гентамицином. Контроль эффективности клеточной терапии осуществляли визуально, планиметрическим и морфологическим методами на 1,3,7,15 и 30 сутки после трансплантации клеток на ожоговую поверхность. Наши исследования показали, что в результате динамического визуального планиметрического и гистологического контроля состояния ожоговой раны уже на 3-е сутки после трансплантации клеток в выделенных группах выявлялись различия в течении раннего процесса. Особенно отчетливой эта разница становилась на 7 сутки после трансплантации клеток. Так у животных II и III группы, которым были трансплантированы ФМСК, рана приобретала равномерно розовую интенсивную окраску, грануляционная ткань разрасталась на всей площади раны до уровня эпидермиса, а ожоговая поверхность начинала значительно сокращаться в размерах. Несколько истончалась образовавшаяся на поверхности раны коллагеновая пленка, но она продолжала покрывать всю ожоговую площадь. У животных I группы, которым были трансплантированы ФФ, грануляционная ткань приподнималась до уровня эпидермиса краев раны, но лишь местами, в то же время плазморрея из раны была более выражена, чем в II и III группе, а первоначально образовавшаяся коллагеновая пленка практически исчезала. В IV группе - контрольной, без проведения клеточной терапии, на 7 сутки ожоговая рана представляла собой бледную, изрытую, неживую ткань, покрытую фибрином, плазморрея имела место по всей ожоговой поверхности.
