Введение к работе
Актуальность темы
Смертность от острой печеночной недостаточности (ПН) достигает 70-80 % и
даже 90 %. Хроническая ПН занимает 8 место среди причин временной
нетрудоспособности и 7 место среди причин первичного выхода на инвалидность
[Тарабарко Н.В. 1997]. Известно, что средний срок жизни при первичном
билиарном циррозе не превышает 5,5 лет от времени установления диагноза, а
смертность при хронически активном гепатите составляет более 50 % в течение 6
лет от момента постановки диагноза; первичный склерозирующий холангит ведет
к смерти в течение 5-7 лет. Высокая смертность и недостаточная эффективность
существующих терапевтических методов лечения предопределили тот факт, что в
последние 20-25 лет при необратимых поражениях печени стали осуществлять
полную замену этого органа, путем трансплантации донорской печени. Резкое
расширение списка заболеваний, при которых показано выполнение
трансплантации печени, обусловило дальнейшее развитие
гепатотрансплантологии, а также предопределило медицинскую и социально-экономическую значимость этого вида операций. В результате число пересадок печени в развитых странах мира стало из года в год увеличиваться. По данным международного регистрационного центра к концу 1992 г. в мире было выполнено 19268 трансплантаций печени, к началу 1995 г. уже выполнено 32000 пересадок, а за период с 1990 по 2000 г. - 86379, а в 2002 г. только за 1 год выполнено более 11500 трансплантаций трупной печени. [Dousset 1992, International figures on organ donation and transplantation 2000]. Существенно улучшились результаты этих операций, особенно в 80-90 годы прошлого столетия, благодаря разработке новых типов консервирующих растворов, созданию и использованию новых эффективных иммуносупресантов, а также разработке новых схем иммуносупрессии. В результате годичная выживаемость печеночных трансплантатов превышает 80% [Тарабарко Н.В. 1997].
Полагают, что важнейшим фактором, определяющим успех пересадки печени, является использование для трансплантации исходно полноценного донорского органа [Belzer F.O. 1988, Blankenstein J.D.1991. Gubematis G., 1989 Jamiesson N.V.
рос. ^-- - ^я
F.' ., . \
2 1987]. Между тем после воздействия гипоксии в организме донора, операционной травмы на этапе изъятия и трансплантации, а также воздействия холодовой ишемии на этапе консервации и транспортировки - донорская печень часто оказывается не в состоянии адекватно и немедленно функционировать после трансплантации. Наличие неблагоприятного функционально-метаболического фона в организме реципиента лишь усугубляет опасность пересадки первично ^функционирующего трансплантата.
Отсутствие достоверных экспресс методов, позволяющих объективно оценить функциональное состояние печеночного трансплантата до пересадки, вынуждает хирургов жестко ограничивать круг потенциальных доноров, совершенствовать технику изъятия органов и преднамеренно сокращать сроки консервации. Такие вынужденные меры еще больше обостряют существующую повсеместно нехватку донорских органов. В результате до 50 % потенциальных реципиентов умирают, не дождавшись подходящего донорского органа [Шумаков В.И. 1994].
Изложенные обстоятельства обусловили необходимость продолжения поиска путей и методов повышения противоишемической резистентности донорской печени на этапе ее консервации, так и в реперфузионном периоде [Belzer F.O. 1993, Jamieson 1993, Bilzer М. 2000, Clavien Р.А. 2000].
В работах, специально посвященных проблеме противоишемической защиты трансплантата [Онищенко Н.А. 1987, Шумаков В.И. 1998], отмечается, что одним из ведущих патогенетических механизмов ишемического повреждения органов -является активация процессов перекисного окисления липидов клеточных мембран. Между тем, отсутствие водорастворимых медикаментозных препаратов липидной природы с антиоксидантным механизмом действия долгое время тормозило исследования по использованию таких препаратов для повышения качества противоишемической защиты трансплантатов.
Отсутствие данных о целесообразности использования новых водорастворимых мембранстабилизирующих препаратов липидной природы с антиоксидантными свойствами в составах консервирующих растворов и реперфузионных сред для повышения противоишемической резистентности печени позволило нам сформулировать цели и задачи исследования.
Цели и задачи исследования
Цель работы: повышение надежности противоишемической защиты донорской печени путем дополнительного включения в составы консервирующих и реперфузионных сред «Липина» - водорастворимого препарата липидной природы.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:
-
создать стенд для выполнения в стандартных условиях - отмывки печени, заполнения ее консервантом и осуществления реперфузии;
-
провести комплексное изучение характера гистологических, цитологических и биохимических изменений в печени во время консервации в стандартном растворе НТК - гистидин-триптофан-кетоглютарат в зависимости от сроков хранения и последующей реперфузии;
-
изучить эффективность использования «Липина» - водорастворимого препарата липидной природы в составе НТК при консервации в зависимости от сроков хранения и длительности реперфузии печени;
-
изучить эффективность дополнительного включения препарата Липин в состав реперфузионного раствора для повышения надежности защиты печени от реперфузионного повреждения.
Научная новизна полученных результатов
Впервые проведено комплексное гистологическое, цитологическое и биохимическое исследование последовательности и взаимосвязи развития деструктивных изменений в изолированной печени:
-
при консервации (до 18 - 22 часов) при t=4-6 С в стандартном растворе НТК и в растворе НТК, модифицированном включением в него «Липина» препарата липидной природы.
-
при реперфузии стандартным раствором Кребс-Хензиляйт (КНВ) при t=37 С, а также раствором КНВ, модифицированном включением в него «Липина» - водорастворимого препарата липидной природы.
Использование метода комплексной динамической морфометрии отдельных структурных элементов печеночной ткани (клеток, ядер) позволило установить,
что наиболее информативным показателем тяжести ишемического повреждения печени при консервации и реперфузии, а также наиболее значимой характеристикой защитных свойств консервирующих растворов служит степень выраженности полиморфизма ядер гепатоцитов. Показано, что увеличение количества малых «голых» ядер и увеличение количества гепатоцитов со светлой цитоплазмой в цитограммах служит объективной мерой тяжести деструктивных изменений в печени при консервации в растворе НТК как без, так и с введением в их состав Липина.
По морфометрическим критериям предложено использовать значения энтропии и коэффициента относительной организации системы, рассчитанные по площади и оптической плотности ядер для количественной характеристики степени тяжести ядерного полиморфизма.
Впервые при консервации и реперфузии печени проведено комплексное исследование нарушений липидного обмена в печени, включающее исследование интенсивности процессов ПОЛ, оценку количественного содержания фосфолипидов, жирных кислот (насыщенных и ненасыщенных) и холестерола, а также показателей адекватности энергетического обмена - содержание адениннуклеотидов и их дериватов, глутатиона и ферментов цитолиза (трансаминаз). Выявленные изменения липидного обмена - активация процессов ПОЛ, повышение уровня некоторых фосфолипидов (лизофосфатидилхолина, фосфатидилинозитола), а также некоторых жирных кислот (С 15:0, С 16:0, С 16:1, С 18:0, С 18:1, С 22:0) на фоне уменьшения других жирных кислот (С 18:2, С 19:0, С 20:0, С 20:3, С 20:4w6) и холестерола - рассматриваются как результат сочетанного воздействия при консервации и реперфузии печени повреждающих (развитие энергодефицита и 02 - парадокса) и адаптационных факторов (фармако-холодовое хранение) на клетки печени.
Впервые показано, что, добавляя в состав консервирующего раствора (НТК) препарат Липин можно повысить противоишемическую резистентность печени и ослабить ее повреждение во время реперфузии по исследуемым показателям. Повышение противоишемической резистентности печени выражалось в ослаблении процессов ПОЛ, в повышении содержания лизофосфатидилхолина, в повышении содержания холестерола и концентрации адениннуклеотидов, а также в снижении выхода ферментов цитолиза (АЛАТ, АСАТ, ЛДГ) в перфузат при
реперфузии. Гистологически повышение противоишемической резистентности характеризовалось достоверным уменьшением площади дистрофически измененных зон в печени, снижением количества патологически измененных ядер, т.е. появлением достоверно большего количества клеток, повреждение которых обратимо.
При добавлении Липина к раствору Кребс-Хензиляйт при реперфузии печени удалось существенно уменьшить выраженность реперфузионного повреждения, уменьшить мозаичность рисунка печени, уменьшить полиморфизм ядер гепатоцитов, а дискомплексацию печеночных балок наблюдать в виде мелких и одиночных очагов.
Практическая значимость работы
Предложенные морфологические (морфометрические) критерии для оценки состояния паренхимы печении и определения степени тяжести дистрофических изменений в ней позволяют проследить динамику развития деструктивных процессов при длительном воздействии консервирующих растворов и при реперфузии.
Доказана возможность усиления противоишемической защиты печени растворам НТК и пролонгирования сроков консервации за счет дополнительного включения в их состав водорастворимого антиоксиданта Липин.
Разработан стенд для проведения пролонгированной перфузии донорской печени с использованием миниатюрного оксигенатора. Стенд позволяет оптимизировать режимы отмывки и заполнения печени консервантом, а также режимы реперфузии печени после консервации, т.е. позволяет стандартизировать экспериментальное исследование влияния консервирующих растворов и новых медикаментозных препаратов на печень крыс.
Доказана возможность дополнительного усиления противоишемической резистентности печени после консервации в растворе НТК за счет реперфузии ее перфузатом, в состав которого включен Липин.
Апробация результатов диссертации
Апробация работы состоялась 22 октября 2003 года на меж лабораторной конференции в ГУ НИИ Трансплантологии и Искусственных органов МЗ РФ. Основные положения и результаты диссертации были доложены на 1-м съезде трансплантологов Украины (Запорожье, 1995), на 2-м съезде трансплантологов Украины (Киев, 2000), на съезде трансплантологов Австрии: Austrotransplant-Kongress 1994 (Retz, 1994), на 12 th Annual Meeting and International Conference of the Academy of Surgical Research (Мюнстер, Германия, 1996), на XXXII съезде Европейской ассоциации хирургических исследований (Корфу, Греция, 1997), на съезде трансплантологов Австрии Austrotransplant-Kongress 1999 (St. Wolfgang, 1999), на международном симпозиуме: Falk Symposium 117 (Мюнхен, Германия, 2000).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, из их 12 статей в ведущих профессиональных изданиях (5 публикаций на русском языке) и 15 тезисов докладов в материалах Украинских и международных конгрессов и конференций. Получено 2 патента Украины на изобретения: №31297-А от 15.12.2000 года «Способ консервации печени» и №1771-111 от 1.06.2000 года «Способ диагностики гидропической дистрофии печени».
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы; главы, характеризующей материал работы и использованные в ней методы; 3 глав по результатам собственных исследований; заключения; выводов и практических рекомендаций; списка литературы содержащего 36 на русском и украинском языке и 255 западноевропейских и американских источников. Диссертация содержит 19 таблиц и 16 рисунков.
