Введение к работе
Актуальность проблемі!. Изучение кроветворного и лиыфоидного шюокружения является одной из актуальных проблем современной ллунологии. Кроветворение и лдафопоэз, т.о. размножение и диффе-знцировка геьюпоэтических и иммуяокомпетентных клеток, происхо-п* только в определенных органах, ко территории которых действу-? строиальное микроокружение, обеспечивающее условия для созра-эния кроветворных и ли.чфоидных клеток.
Исследования гемопоэткческого а иммунологического шкроокру-зкия, интенсивно проводимые в последние годы, выявили новые йе-знизш взаимодействия строиальшх и кроветворных клеток, указы-згащіе на то, что через строгальное микроокружение могут быть їуцзствленк направленные воздействия на иммунитет и кроЕОТВоро-іе /ФриденштеЗн А.Я. и др., I968-IS92; Чертков И.Л., Фриденш-5йн А.Я., 1370,1977; Старостин В.И., Мичурина Т.В.,-1977; Черт-)В И.Л., Гуревич О.А., 1984; Curri J. et al. , 1957; Bernstsia 3, 370; Trentin J. , IS70; Wolf N. , І973-Ї979; Bentley S. , IS32, 534; Dexter T. , I976-I99I; Whitlock et al. , IS34, IS87).
Основу микроокружения ооставлявт многие категории клеток: дотелЕа-чышо, рєтикуляріше, фібробласти и макрофагальнне оле-знти. Важным компонентом структурной организация строгального псроокружокия являотся вкеглеточннЯ мзтрпкс, синтезируемый, Ї, доеном, стромэлъшии клетками, через которой они опосредуют зое действие на кроветворный гл'зтки-предаеотЕенники /iiingueli, зхйу , 1939; Dorshkind et al. , I9S0/. Он представлен различиы-i типами кодлагега, фнброксктннсм, протеогликанамп, гаишная го~ аран-сульфат, хондроитпк-сульфзт и глгакурокоьую кислоту. Уста->влено, что один из' классов иротеогликашв, а именно гепзрак- . гльфат, мояот селективно ежзывагь гемодозтзческяе факторы рос-з и предъявлять их гемапоэтпческии їиегкгм-предЕестЕвіпикам.По-ззако, что фиброноктиксвый компонент матрпкеа :.шет регулировать ізревание эритровдннх клетсх, а гемонвктин участвует в спзцмфи-гском СЕЯЗывгнии гранулоцЕтарпзк прздшесїЕзгаккдв /zuckerman , icha , 1983; Patel, Lodish , 1986; Gordon ot al. , 1987,1988;. ouloabel et al.', 1980; Ecberts et al. , I9S8; Ruoaiathi ,1389; 'orok-Storb , Ї923; Anklosaria at al. , IS32/.
Іїрпведешх-с дзшшо свидетельствуют об активном учг'-тия стро-зльисго микроокр^еяия и продуцируешх им факторов в регуляции змопоззз. Половися регуляция, основанная на їуккциоїшровянии
2. многих факторов стромалького микроокружения, обеспечивает в органах кроветворения и иммунитета интенсивно протекающие процессы пролиферации я дифференоировки, с быстрым сдвигом з составе клеточных популяций в момент повышенного запроса. Действие их направлено на ксммитированные клетки-предшественники и распространяется на все территории кроветворной ткани Altus, Bernstein ',1971; Harigaja, Haada ,1985; Song et al. ,1985; Rennick et al. ,1987/.
Эпигеномнкз фактори, воздействующие на стволовые кроветвор-. кые клетки (СКК) в момент выбора ими направленая дифференцировкк, носят локальный, короткодистантный характер и связаны с жизнедеятельностью гемопоэтической стромы кроветворных органов или всей системы, объединяемой понятием кроветворного микроокрухения.
Дисяримеитный иммунологический анализ гетеротошшх трансплантатов костного мозга и кроветворной ткани радиохимер показал,что клетки, переносящие микроокружешш, имеют происхождение, гистоге-нетячзски.отличное от стволовых кроветворных клеток / Фридевштейн А.Я. и др.,1968-1971; Куралесова А.И.,1971/.
-Это явилось обоснованием поиска клеток, переносящих микроокружение, не среди кроветворных, и лимфоидных клеток, а среди стро-калышх элементов органов гемо- и лиілфопозза. Необходимость данной работы определялась отсутствием сведений о клеточном состава и функциональных возмоаностях отдельных категорий клеток, объеди--ненкых понятием "стромалькое мккроокружение". Получокие этих данных обеспечило бы выявление клеток, ответственных за перенос и организацию специфического кикроокруяения в органах гемопоэза и иммунитета, их идентификацию, анализ нх пролиферативных и диффе-рекцировочных потенций, что способствовало бы реыекито одной из актуальных проблем иммунологии и созданию концепции кроветворного и лиыфоидыого ыикройкрукения.
Долг» и задачи исследования. Цель настоящего исследования состоит з определении, какие именно клетки в кроветворных н ликвидных органах способны обеспечить создание специфического шкро-окруяєкяя и выяснить, поддерживаются ли зо взрослом организме строгальные клеточнчо линии, разработать методы" их культивирования и ргтраноплзктацал э. организм, обеспечивающие образование ко бух кроветворных и лямфоидных органов.
В соответствии о этим решались следующие задачи:
I. РяЗ'пягЬтят;. vfi-iw; ^ЛЬТИГТПХІДЯИЧЯ' гтроиj.tt^wx клеток крорч—
порчей і' лигезидпои: ткякк, ответственных за организацию сне-
3.
цифического микроокружения.. '
, Выяснить пролиферативные потенции стромальшх колониеобразую-щих клеток костного мозга и селезенки к возможность получения в культурах диплоидных штаммов этих клеток. Определить кинетику роста и условия, влияющие на увеличение численности клеток в таких штаммах. , Изучить, происходит ли при развитии штаммов стромальных фибро-бластов в культура нарастание численности клеток, переносящих кроветворное и лимфоидное микроокруяение. Разработать метод обратной трансплантации в организм штаммов стромальных флбробластов кровэтворных и лимфеидных органов, ' который обеспечивал бы их приживление и формирование новых органов кроветворения и иммунитета.
Исследовать структуру кроветворных и ликйидшх органов, которые формируются при трансплантации штаммов стромальных фибро-бластов, в том числе характер дифференцировхи в этих органах кроветворішх и лимфоидных клеток.
Путем анализа моноклональных штаммов, полученных из.индивидуальных клеток, образующих колонии фиброоластов (КОКф), определить, существует ли внутриорганная мозаичкость КОКф по диффє-ренцировочным потегсдош и способности создавать юткроокруЕопие для разішх направлений дифференцировки кроветворных и ликвидных меток. Новизна полученных результатов. Результаты, полученные в данії работе, явились определявшими в развитии нового направления следований - изучения микроокругекия в органах гемо- и лимфопо-а. Работа выполнена пэ впервые выявленной категории стромальных етох-предаествеїшиков, ответственных за организацию микроокру-ІШЯ в отих органах.
Разработана модель избирательного клоїшровзняя в монослойкых ль турах стромальных клеток-прєдлізствентаїков, позволяющая кзу-ть их численность, свойства, втелнферзтивше и двфферзнцировоч-о потенции.
Епергые установлено, что потомки стромальных клеток-предге-ЕЄИКИК0В, вырастающие в таких культурах, могут бить рззмнокенц виде диплоидных ктаммов стромальных фибрсбластов, и что обрат-я трансплантация этих итоммов обеспечивает формлроваї-е новых га но б кроветвореігля я им."у!г.'.тета.
Иго веденный кариологическиіі анализ стромалышх и кроветгор-
4.
них клеток з гетерогопных трансплантатах костного мозга показал, что строыалькыб фибробласты представляют самостоятельную линию клеток, гистогенетически независимую от стволовых кроветворных клеток.
Впервые показано, что строыальные клетки костного мозга, обладающие остеогеккыми свойствами, имеют высокий нролиферативкый потенциал, а их остеогенные потенции не теряются в процессе культивирования. Пройдя s культурах более 30 удвоений, оне сохраняют способность к построении ретикулярной; костной и хряцевой тканей, причем масса костной ткани, которую они могут построить, в десятки тысяч раз превышает еэ содернакке в костномозговых органах.
Получены шноклоналыше по стреме костномозговые органы и изучена даЬререлцировка кроветворных клеток в таких органах. На основании клональкогэ анализа среда стромэльяых клеток-предшественников костного мозга впервые выявлена категория бипотенциаль-пых клеток, потомки которых могут формировать как костнуз, так и хрящевую ткань. Зги данные впервые доказывают, что костная и хрящевая ткани в организме имеют общего предшественника, и что стро-малыше клетки-предшественники костного мозга являются претендентами ка роль стеолоьых клеток сгромзлькой ткани.
Впервые доказана зозмокность получения в культурах штаммов стромальных клеток лтфоидных органов и способность их при обрат-'ной трансплантации в организм формировать строму лимроидкых органов. Заселяющие вновь образовакные лимфоадные органы В-лимфощ:ты при активировании антигеном проходят.весь путь дифференцкровки вплоть до антитело-образующих клеток.
Изучена реакция стромалъной ткани на процесс регенерации костного мозга. Показано, что регенерация кроветворного микреокру-кёния при механической травме костного мозга сопровождается не только перестройкой строки в поррэгденной области, по и'меет wec-то системный стеєт.стромалъной-ткани органов гемс— к лкм&опоаза-
Еатчу.о-исак'птчгок-гп значимость габоты. Используя разработанный метод ко послойного культивирования клеток органов кроветворения и иммунитета, впервые удалось виявить новую категорию строгальных клсіїог.-ііре/дсстЕ&нкиков, ответственных за органнззата и поддержание іфоветлоркого и лимфоидного кчкреог.рут.енкк, установить ісдональкуа породу образуемых ими колоний фибрсблаетсБ, и доказать, --тто строта^.^;-; ;U' """,:-:?.-.-: "^-тшки гкетогепитапес-ки независим от сг^олоъих :iu.j:::^.:.jt к.'.с-ток. Полнены д-.ііілс-
5«
ие штаммы стромальных фибробластов, сохраняющие после длитель-о культивирования свои дифференцировочные.потенции. Показано,
не только диплоидные штаммы, образованные десятками КОКф, но втомки одной стромальной клетки-предшественника способны пере-ить специфическое микроокружение и формировать новые кроветво-е органы, моноклональные по строие. Впервые установлено, что тная и хрящевая ткани происходят во взрослом организме от об-о предшественника. Результаты исследования позволяют считать,
в популяции стромальных клеток-предшественников присутствует егория клеток, которые по своим пролиферативным и дкфференци-очным потенциям являются претендентами на роль стволовых кле-
стромэльной ткани и обеспечивают при обратной трансплантации рганизк образование костной и хрящевой, а также ретикулярной ни, пригодной для заселения кроветворными и иммунокоыпетбнтны-клетками. Стромалькыв клеточные линии поддерживаптся во взрос-
организме, что позволяет моделировать в эксперименте генез
эпоэтичэского и иммунологического микроокружекия и анэлизиро-
f. его клеточные и молекулярные, механизму. Это открывает, путь к
умственному созданию у взрослых млекопитающих кроветворных и
їюйдкнх органов заданного состава. .
Высокий пролиферативный потенциал и выраяепные остеогенные внции костномозговых стромальных фибробластов,. которые сохра-тся при длительном культивировании, позволили совместно с ЇИТО разработать и внедрить в практику здравоохранения "Способ ения дефектов костей" (авторское свидетельство й I4006I6 от 3.88 г.), который предусматривает аутотракспланташвд в область гного дефекта вырзщенгах и размноженных з культурах остеоген-
стромалышх клеток костного мозга. Метод п-лучил широкое принце, был представлен на ВДНХ СССР и удостоен серебряной медали зтановлекие от 25.09.88 № 959-Н). Разработанный метод культи-звания стромэльннх клеток-предшественников кроветворных и лим-цных органов широко используется как в экспериментальной рабо-
так и в практическом здравоохранении (в Гематологическом на-эи центре РАМН, Центральном институте травматологии и ортопе-
им.ПриороЕа РАМН, Ереванском НИИ травматологии и ортопедии ?А, Институте медицинской радиологии МЗ РФ, Киевском институте эпедии ЬВ РУ, а такне в ряде зарубежных стран - США, Англия, аиль и др.). Материалы диссертации включены в отечественные к зарубежные
6.
монографии ("Руководство во гематологии" под ред. А.И.Воробьева, М., 1987 г.; "Гистология" А.Хэм, Д.Кормах, М.,"Мир", 1983 г.; Фри-девштейк А.Я., Лалыкпна К.С, "Индукция костной ткани и остеоген-ные клетки-предшественники", М.,"Медицина",1973 г.; И.ЛЛертков, А.Я.Фридекштёйн "Клеточные основы кроветворения", М.,"Медицина",. 1Э77 г.; А.Я.Фридекштейн, Е.А.Лурия "Клеточные основы кроЕетвор-. . ного микроокрукеняя", М.,"Медицина",, 1980 г.), а также в курс лекций го иммуноморфологии в МГУ им.М.В.Ломовосова и ЦИУВ г.Москва.
лттроизция диссертации. ДйССьрїаЦйя айрйикроьаиа на конференции отдела иммунологии ШИЭ1! им.Н.Ф.Гамалеи РАМН II гадя 1990 г. . Основные полокения диссертационной работы доложены и обсувдены на международных, всесоюзных съездах, конференциях и симпозиумах, заседаниях, научных обществ, перечень которых приведен в конце автореферата.
Публикация. Основные поло&ения диссертации опубликованы в 42 научных работах.
Структура и объем диссертации. Работа написана по традиционному алану к включает следующие разделы: "Введение", "Обзор лите-ратуры"(3 главы), "Материалы и методы", "Собственные исследова-ния"(6 глав), "Обсуждение", "Вывода" и "Список литературы (446 источников). FaclOTa иллюстрирована 37 рисунками и 25 таблицами. Общий объем диссертации 263 страницы.
