Введение к работе
і.
Актуальность проблемы. Изучение кроветворного и лимфоидного микроокружения является одной из актуальных проблем современной иммунологии. В органах гемо- и лимфопоэза поддерживается пролиферация и дифференцировка гемопоэтических и ишунокомпетентных клеток. Популяция лимфоидных и кроветворных клеток гетерогенна. Известно, сколь несхожи между собой Г-лимфоциты, различающиеся по специфичности рецепторов, а стало быть и выполняемым функциям (Тк, Ts, Гн, Там), и неоднородная популяция В-клеток, мозаичных по классам и идиотипам синтезируемых иммуноглобулинов. Вместе с макрофагами они осуществляют главнейшие типы иммунологического реагирования. Кроветворные клетки эритроидного, миелоидного, ме-гакариоцитарного рядов дифференцировки поддеряивают пос оянство внутренней- среды организма (содержание Og, субстратов метаболизма, эндокринная регуляция, функционирование иммунологических механизмов и др.). Жизненный цикл всех перечисленных клеток значительно короче срока аизни организма, и поэтому в кроветворной и лимфоидной тканях постоянно поддерживаются процессы обновления этих клеточных популяций за счет пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток и коммитированных предшественников из костного мозга (Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980. Чертков И,Л.,Фриденштейн А.Я., 1977). Эти клетки, попадая в кровоток, оседают и дифференцируются только в органах кроветворения и иммунитета. Колонизация происходит постоянно и в физиологических условиях взрослого организма, а не является экспериментальным артефактом или привилегией раннего этапа онтогенеза. Миграция происходит не только меаду одноименными органами (меяду лимфатическими узлами, и различными участками костного мозга). Известно, что предшественники костномозгового происхождения колонизируют тимус, а затем из тимуса репопулирувт в лимфатические узлы и селезенку. ' В каждом из органов существуют свои местные специфические условия, определяющие пролиферацию и дифференцировку попавших в них клеток - предшественников. И хотя дифференцировка стволовых клеток определяется их геномом, какие именно из диффе-ренцировочных генов будут экспрессироваш на поверхности этих клеток, зависит от внешних для клеток эпигеноыных факторов. Сово- купность этих факторов создает специфическое для клеток кроветворное и лимфоидное микроокрукение. Интерес к проблеме микроокружения велик, так как это часть общей проблемы межклеточных взаимоотношений в процессе дифференцировки, роли генома и микроскру-
жения в определении фенотипических свойств индивидуальных клеток (Фриденштейн А.Я. и др. ,1983). Есть основания полагать, что влияние со стороны микроокружения связано непосредственно с развитием вторичкоЯ пострадиационной аплазии костного мозга и, . вероятно, с патогенезом некоторых иммунодефицитных состояний (Knospe W.H. ,et al.. 1966-1968. И.Н.Беляков, Ярилин А.А. и др... 1992). Микроокру-яение - это результат активности многих категорий клеток: эндотелия сосудов, ыеханоцитов (остеогенных, ретикулярных клеток, фиб-робластов). макрофагальных. дендритических клеток цензов размножения лшфоидных фолликулов, межпальцевых клеток Т-областей лим-фоидных органов, а также межклеточных компонентов: коллагеновых волокон, внеклеточного матрикса, через который стромальные клетки опосредуют свое влияние на кроветворные клетки - предиественники (2uckermaa Vlicha, 1983: Patel, Lodish, 1986; Gordon et al.,1987, 1988; Couloabell et ah. 1983; Robert' et al.. 1988; Ruoslathl, 1989: Toroc-Storb. 1988; Anklesaria et al.. 1992). Отсутствие сведений о роли каздого из этих компонентов в организации микро-окруаения обусловило необходимость проведения данной работы.
Цель настоящего исследования состояла в определении клеточной популяции, ответственной за перенос кроветворного и лимфоид-ного микроокруасения, выяснении ее гистогенетических отношений с линией кроветворных клеток, изучении факторов, влияющих на форми- рование строыальных структур, обеспечивающих гемо- и лимфопоэз.
Основные задачи исследования:
-
Выяснить, каким образом может быть перенесено кроветворное и лимфоидное микроокружение; разработать методы оценки переноса специфического микроокрукения; определить, какие клетки кроветворной и лиыфоидной ткани ответственны за перенос микроокружения.
-
Проанализировать гистргенетические отнс-эния клеток, переносящих кроветворное и лимфоидное микроокружение, со стволовыми кроветворными клетками и их потомками.
-
Изучить закономерности формирования гетерото'пных костномозговых и лимфоидных органов в организме нормального и облученного реципиента.
-
Исследовать степень самоподдержания клеток, переносящих кроветворное микроокрухение. и возмолгюсть их репопуляции во
.взрослом организме.
5. Изучить влияние ионизирующего облучения на транспланта-
бельность (перенос) специфического микроокружения, на способность стромального микроокружения поддерживать размножение и дифферен-цировку репопулирующих гемопоэтических клеток. Определить радиочувствительность процесса переноса кроветворного микроокружения. Получить индукцию кроветворного микроокружения у облученных животных и радиохимер.
-
Проанализировать закономерности образования смешанных лимфо-кроветворных органов, экспериментально создаваемых при трансплантации смеси фрагментов и суспензий клеток кроветзорных и лиыфоидных органов.
-
Выяснить возможность переноса специфического микроокружения, обеспечивающего гистогенез IgA-продуцентов, при трансплантации вторичных лимфойдных органов, ответственных за местный иммунитет.
Новизна полученных результатов. Совокупность экспериментальных данных, полученных в представленной работе,явилась основой для создания концепции специфического кроветворного микроокрукения.
Впервые в органах гемо- и лимфопоэза выявлена линия стро-мальных клеток, ответственных за перенос кроветворного и лимфоид-ного микроокружения.
Впервые разработан и применен метод дискриментного анализа кроветворной и лимфоидной ткани, позволяющий, используя различия между донором и реципиентом по Н-2 локусу, определить гистогене-тическую принадлежность стромальных клеток и кроветворных, лимфойдных элементов.
Впервые доказано, что строиальная линия клеток гистогенети-чески независима от стволовых кроветворных клеток. Это означает, что в костном мозге и лимфойдных органах параллельно существуют: 1- Стволовые кроветворные клетки и их потомки и 2-стромальные клетки-предшественники,обеспечивающие дифференцировку стромальных элементов: остеогенных - в костном мозге, ретикулярных - в лимфойдных органах.
Впервые продемонстрировано, что именно приживление стромы
обеспечивает создание на месте трансплантации органа аналогичного
исходному. Длительно существующие гетеротопные трансплантаты кро
ветворной и 'лимфоидной ткани являются химерными структурами.в ко
торых кроветворная ткань принадлежит реципиенту, а стромальная -
донору.
Показано, что при гетеротопнсй пересадке костного мозга ке
происходит индукции кости из окружающих трансплантат тканей.
Впервые установлено, что продолжительность самоподдеркания строыальной линии клеток в трансплантатах соизмерима со сроком жизни животного. При серийных . гетеротопных . трансплантациях в условиях стимулирования стромальных клеток к образованию новой костной ткани линия стромальных элементов первичного донора успешно самоподдерживается в ходе 3-4 пассажей, что аналогично продолжительности самоподдержания стволовых кроветворных клеток в условиях пассирования через организм облученных животных.
Впервые доказано при трансплантации костного мозга от облученных, толерантных, иммунизированных по секс-антигенам животных, радиохимер, что стромальные элементы не способны к репопуляции и восстановление пула этих клеток происходит за счет местных стромальных элементов, но не за счет стволовых стромальных клеток, введенных внутривенно или мигрирующих из неповрежденных участков кроветворной ткани.
Выяснено, что формирование гетеротопного костномозгового органа при трансплантации костного мозга в виде фрагментов или суспензий в желатиновых губках - не перенос готовых стромальных структур, а процесс образования их de novo, при этом воспроизводятся онтогенетические особенности развития кроветворной ткани. Величина сформированного кроветворного органа меняется пропорционально исходной клеточной плотности, поверхности трансплантата. Эта зависимость многофакторная.
Установлена радиочувствительность процесса переноса кроветворного микроокруаения при гетеротопной трансплантации костного мозга. Do=l.7 Gy при п=2.6 (при трансплантации 1/4 содержимого бедренной кости).
Впервые показано, что восстановление способности к переносу кроветворного микроокружения костного мозга радиационных химер происходит за счет детерминированных .ютеогенных клеток стромы реципиента не ранее 26 дня после облучения.
Динамика пострадиационных изменений микроокружения костного мозга после локального облучения бедренных костей в дозах 10,0 -50,0 Gy показывает, что клеточные элементы стромы, обеспечивающие поддержание пролиферации и дифЛеренцировки репопулирующих на эту строму стволовых кроветворных клеток, имеют длительный жизненный цикл. Нарушение функций стромы по поддержанию гемопоэза происходит между 2-4 неделями после облучения, что соответствует срокам
развития феномена вторичной аплазии.
Впервые при имплантации декальцинированного костного матрик-са получена индукция кроветворного микроокружения у реципиентов, облученных в дозе 4,5 Gy, и у радиационных хи:лер.
Показано, что при трансплантации лимфоидных органов вторичного иммунитета < мезентериалъдах лимфоузлов) сохраняется специфичность строда. обеспечивающая дифференцировку IgA-продуцентов, что характерно только для этой категории органов.
Установлено, что при совместной гетеротопной трансплантации костного мозга и тимуса строма каждого из компонентов сохраняет свою специфичность и обеспечивает формирование фрагментов аналогичных исходным.
Научно - практическая значимость работы. Метод дискриментно-го иммунологического анализа позволил, используя F1 реципиентов, радиационных химер,толерантных и иммунизированных по секс-антигенам животных, впервые установить существование стромальнои линии клеток, ответственных за перенос кроветворного и лимфоидного микроокружения. Выяснено, что клетки-предшественники стромальнои линии,ее пролиферирущие и зрелые элементы гистогенетически независимы от стволовых кроветворных клеток.Эти данные стали основой для развития нового направления исследований-изучение стромально-го компонента кроветворного и лимфоидного микроокружения и явились фундаментом для создания концепции специфического гемопоэти-ческого и иммунологического микроокружения.Данные о гистогенети-ческой независимости стромальнои линии клеток оказали большое влияние на дальнейшее исследование стволовых клеток кастнсй ткани, a также разработку метода культивирования стромальных клеток-предшественников и их обратную трансплантацию в организм с цель» изучения их дифференцировочных и пролиферативных потенций, популяционной структуры.Выявленные закономерности формирования гетеротопных костномозговых и лимфоидных органов продемонстрировали, что именно приживление стромы обеспечивает создание на месте пересадки органа аналогичного исходному. Размер гетеротопных органов зависит от исходной клеточной плотности, величины поверхности трансплантата, от факторов, действующих в организме реципиента. Возможна направленная регуляция величины гетеротопного органа: при трансплантации костного мозга облученному в дозе 4,5 Gy реципиенту получено увеличение величины плацдарма для кроветворения в 2 раза." В длительно существующих (по крайней море, в
течение 14 месяцев) трансплантатах строма самоподдерживается и сохраняет донорскую природу, в то время, как кроветворные клетки замещаются на клетки реципиента. Эти результаты, а также данные о том. что восстановление пула стромальных клеток при локальном (в дозе 9,5 Gy) и тотальном (8,25-11,0 Gy) облучении с последующей инъекцией кроветворных клеток происходит за счет местных стромальных элементов, не за счет инъецированных клеток донора или клеток, мигрирующих из неповрежденных участков, имеют практическую значимость. Отсутствие во взрослом организме репопуляции стромальных элементов должно быть учтено при разработке путей направленного лечения вторичной пострадиационной аплазии и некоторых иммунодефицитных состояний, обусловленных повреждением строки, при которых традиционные методы лечения не эффективны. Данные,свидетельствующие о том, что в смешанных трансплантатах костного мозга и тимуса строма каждого из компонентов ответственна за формирование фрагментов аналогичных исходным и что строма органов вторичного иммунитета при трансплантации поддерживает гистогенез IgA-продуцентов, открывают возможность конструирования гетеротолных кроветворных и лимфоидных органов с заданными свойствами, корректирующих возникающие в организме гемопоэтическиб и иммунологические нарушения.
Успешное использование в экспериментах декальцинированного костного матрикса для лечения костных дефектов у кроликов позволило применить его для стимулирования костеобразования после удаления одонтогенных кист у человека. Применение матрикса в клинике показано в тех случаях, когда не требуется сразу после операции восстанавливать опорную функцию и когда снижена естественная ос-теогенная функция. Апробация метода произведена в ММСИ им.Н.А.Семашко (Стоматология, 1981. Мб).
Материалы диссертации включены в монографии: Е. А. Лурия "Кроветворная и лимфоидная ткань .. культурах"..М. "Медицина", 1972г. '.Фриденштейн А.Я. .Лалыкина К.С. "Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предаественники". М."Медицина",1973г.;И.Л. Чертков.А.Я. Фриденштейн "Клеточные основы кроветворения", М."Медицина", 1977г.; Старостин В. И.. Мичурина Т. В."Строма кроветворных органов и ее взаимоотношения сі стволовой кроветворной клеткой", кн. "Морфология человека и животных, "..нтрополо-гия.М.,1977г.6т.;А.Я.Фг денштейн.Е.А.Лурия "Клеточные основы кроветворного микроокружения",М. "Медицина. )80г. ;а также в курс лек-
ций по иммуноморфологии в МГУ им. М. В. Ломоносова и ЦИУВ г.Москва.
Апробация диссертации. Диссертация апробирована на конференции отдела иммунологии НИИЭМ им.Н. Ф.Гамалеи РАМН 8 июля 1993 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международных, всесоюзных съездах, конференциях и симпозиумах, заседаниях научных обществ, перечень которых приведен в конце автореферата.
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 32 научных работах.
Структура и объем диссертации. Работа написана по традиционному плану и включает следующие разделы: "Введение","Обзор литературы" (3 главы), "Материалы и метода", "Собственные исследования и обсуждения их результатов"(5 глав)."Заключение","Выводы" и "Список литературы" (581 источник). Работа иллюстрирована 22 рисунками и 32 таблицами. Общий объем диссертации 349 страниц.
