Введение к работе
Актуальность темы. Отличительной особенностью канцерогенеза
ftte f ОгамэШчвосов строение щвлввагв контакта ІЦвпаноВ ивнтшг соґгаит ив с юл панн л Фетиш о"> числа ины+вчдуягьньи мирдодовлыда. проннывиицИк ппшіиотцчесш* м***3{даы саецпетруюиінхлррт с драгам цп#гог Кчвдын1 канагвц в свод очароа состоит на дда
рнуГіьГ*ТЄМСЛ*Ч* 11»СТИ MCft*yF> №кС*КСИі<Н:гіНОв ClpyKTVIMO (COiH*ttC*|riW ДОАСГНПпЧТ eadufl тр*"ем*мавангіьм d*n*. и*тъдо пронидьмивщщ ft упрді ьньи> i,\t і *)ряиы «патде
домк^ьїкйп'срькп^йіьнклкігсяд^мяїнарацчто^ьяінн сндея г/ТАитвточной лфглями
является многообразие этиологических факторов, вовлеченных в этот процесс. Помимо общепризнанной роли в генезе рака генетических повреждений ряда генов, белковые продукты которых регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и клеточную смерть (Hanahan D, Weinberg RA, 2000; Vogelstein В, Kinzler KW, 2004), а также осуществляют репарационный контроль клеточного генома, существенный вклад в канцерогенез вносят и нарушения межклеточных взаимодействий (Васильев ЮМ, 1997; Yamasaki Н, 1990). Контактируя между собой, клетки получают разнообразную сигнальную информацию, опосредованно влияющую на практически все аспекты их жизнедеятельности. Аппарат межклеточных взаимодействий состоит из нескольких структурно и функционально различных типов межклеточных соединений. Большинство из них - адгезивные соединения, десмосомы, плотные контакты - имеют выраженную структурно-механическую функцию, объединяя клетки в единое целое, т.е. ткань. Щелевые же контакты (ЩК), представляя собой микроскопические водяные канальцы, напрямую соединяющие цитоплазмы клеток, обеспечивают непосредственный обмен метаболитами и сигнальными молекулами между клетками в пределах данной ткани (рис.1).
Являясь неотъемлемой составной частью комплексного аппарата межклеточных взамодействий, ЩК вносят существенный вклад в обеспечение поддержания разнообразных параметров тканевого гомеостаза (Крутовских ВА, 2000; Kumar NM, GilulaNB, 1996; Willecke Ketal, 2002).
Соответственно, нарушение функции щелевых контактов существенно влияет на клеточную пролиферацию, дифференцировку, клеточную гибель, что в свою очередь имеет значительный этиопатогенетический вклад в процесс формирования новообразований (Yamasaki Н, 1990; Yamasaki Н, Naus CCG, 1996; Trosko JE., Ruch RJ., 1998; Kratovskikh V, 2002; Ruch RJ., Trosko JE., 2001).
Резкое снижение способности сообщаться между собой через ЩК было отмечено in vitro у опухолевых клеток еще несколько десятилетий назад (Lowenstein WR, Kanno Y. 1966). Этиологическая значимость этого феномена, а также отвечающие за эти нарушения механизмы долгое время оставались во многом неясными, в основном, из-за отсутствия фундаментальных знаний о молекулярной структуре щелевых контактов.
До последнего времени оставалось также неясно, сопровождается ли опухолевый рост in vivo утратой межклеточной сообщаемости через ЩК аналогично феномену, описанному ещё много лет назад в культуре опухолевых клеток.
Благодаря недавнему бурному прогрессу в области биологии межклеточных взаимодействий, в частности, открытие семейства белков ЩК - коннексинов (Сх), стало возможным получение высокоспецифичных антисывороткок и молекулярных генных проб ко многим индивидуальным белкам этого семейства, что существенно расширило экспериментальные возможности в изучении как функции ЩК и входящих в их состав коннексинов, так и механизмов их нарушений в канцерогенезе.
В частности, многочисленные эксперименты по восстановлению межклеточной сообщаемости у коммуникационно дефектных линий раковых клеток путём устойчивой трансфекции в них генов ЩК коннексинов показали, что межклеточная сообщаемость является сильным опухолеподавляющим фактором (Rose В. et al., 1991; Eghbali В, et al., 1991; Chen Sh-Ch. et al., 1995). В то же время в ряде случаев обнаружилось, что подавление опухолеродности клеток при искусственном восстановлении экспрессии в них белков коннексинов далеко не всегда и не обязательно непосредственно связано с улучшением межклеточной сообщаемости. Более того, оказалось, что для подавления
опухолеродного фенотипа важно не само по себе восстановление межклеточной сообщаемости, а в большей мере тип индивидуального коннексина, с помощью которого это было произведено (Mesnil М. et al, 1995).
Таким образом, было предположено, что белки ЩК коннексины, наряду со своей основной функцией обеспечивать межклеточную сообщаемость формированием каналов щелевых контактов, также обладают дополнительными свойствами, имеющими существенное влияние на поведение опухолевых клеток.
Выяснение механизмов повреждения межклеточной сообщаемости при опухолевом процессе может существенно улучшить диагностику рака, способствовать разработке новых методов его лечения, а также способствовать разработке новых онкопрофилактических стратегий.
Цель работы:
Оценка этиопатогенетической значимости нарушений межклеточных взаимодействий через щелевые контакты в канцерогенезе.
Задачи исследования:
Выявить функциональные нарушения межклеточной сообщаемости через ЩК на разных этапах канцерогенеза in vivo.
Изучить молекулярные механизмы нарушения функций ЩК в экспериментальном и спонтанном канцерогенезе.
Выявить молекулярные механизмы подавления опухолевого роста белками ЩК коннексинами.
Экспериментально проверить предположение о многофункциональной природе белков коннексинов и оценить потенциальный вклад этих функций в коннексин-опосредованное подавление опухолевого роста.
Научная новизна
Впервые было показано, что в опухолях печени человека межклеточная сообщаемость резко снижена по сравнению с окружающей их непораженной тканью.
Впервые на экспериментальной модели гепатоканцерогенеза крыс было продемонстрировано, что предопухолевые очаговые поражения уже на самых ранних этапах своего формирования могут быть коммуникационно изолированы от окружающей их нормальной паренхимы печени.
Впервые бьгли получены экспериментальные доказательства распространения среди опухолевых клеток через их ЩК сигнальных молекул, запускающих механизм клеточной гибели.
Впервые были обнаружены соматические мутационные повреждения гена коннексина43 (Сх43) в спорадических опухолях толстой кишки человека. Было также выявлено, что мутации гена Сх43 происходят на довольно поздних этапах формирования новообразований колоректального рака, и их возникновение тесно связано с появлением признаков озлокачествления.
Также впервые было обнаружено, что редкие варианты гена коннексина26, вызывающие врождённую доречевую глухоту по рецессивному типу, могут быть дополнительным фактором генетической предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта.
Научно-практическая значимость. Полученные в работе даные
расширяют современные представления о молекулярно-генетических механизмах канцерогенеза и имеют конкретную практическую значимость.
В частности, экспериментально обнаруженная возможность распространения в популяции опухолевых клеток через ЩК вызывающих клеточную гибель сигналов может быть успешно использована для повышения эффективности лекарственной терапии рака.
Специфический характер обнаруженных в опухолях толстой кишки человека мутаций Сх43 - сдвиг рамки считывания из-за инсерции-делеции единичных нуклеотидов в карбоксильно-терминальном домене белка -дополняет имеющиеся ранее представления о молекулярных механизмах канцерогенеза толстой кишки. Разрушение в результате таких мутаций способности Сх43 взаимодействовать с целым рядом сигнально активных белков (Р-катенин, ZO-1, клаудин, дребрин и другие) (Giepmans BNG, MoolenaarWH., 1998, ToyofukuT et al, 1998; Ai Zh et al, 2000; Jin Ch., et al, 2000; Butkevich E. et al., 2004) приводит к неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Природа этих мутации также убедительно указывает на наличие нераспознанной ранее сигнальной активности Сх43 в контроле опухолевого фенотипа.
Обнаруженная в данной работе тесная взаимосвязь специфического мутационного повреждения Сх43 в его карбокси-терминальной части с появлением признаков инвазивности опухолей толстой кишки может быть использована в клинической практике в качестве нового диагностического критерия опухолевой прогрессии.
Возникающие при раке толстой кишки в результате сдвигающих рамку считывания мутаций новые аминокислотные последовательности в составе белковой молекулы Сх43 обладают сильной антигенностью и могут служить иммуно-диагностической и иммуно-терапевтической мишенью.
Высокая частота гетерозиготных носителей редких вариантов гена Сх26 среди больных раком желудочно-кишечного тракта позволяет использовать наличие этих вариантов в качестве нового критерия для раннего выявления групп повышенного онкологического риска.
Результаты исследования опубликованы в 34 научных публикациях в отечественной и международной научной периодике.
Основные положения, выносимые на защиту:
Опухолевый рост in vivo сопровождается значительным снижением межклеточной сообщаемости через ЩК, в основе чего лежат различные механизмы.
Межклеточная сообщаемость через ЩК является сильным противоопухолевым фактором.
Межклеточная сообщаемость между опухолевыми клетками через ЩК может являться путём распространения в опухолевой клеточной популяции сигналов, запускающих процесс клеточной смерти, что является существенной составляющей опухоль-подавляющего эффекта межклеточной сообщаемости.
Белки ЩК коннексины являются опухолевыми супрессорами, способными подавлять опухолевый рост независимо от межклеточной сообщаемости через ЩК. Именно это свойство и обусловливает ярко выраженную вариабельность противоопухолевого потенциала каждого из 20 известных индивидуальных коннексинов.
Индивидуальные коннексины могут быть избирательно и высоко специфично соматически мутированы в отдельных типах раков человека. Мутационно модифицированные коннексины могут приобретать способствовать ускорять опухолевую прогрессию.
Редкие варианты гена коннексина26 могут быть новым фактором предрасположенности к ракам желудочно-кишечного тракта.
Апробация работы. Диссертация была представлена на
международных конференциях по межклеточным щелевым контактам [Хирошима (Япония, 1993), Кей Ларго (США, 1997), Гватт (Швейцария, 1999), Гонолулу (США, 2001), Кембридж (Англия, 2003)], на ежегодных
симпозиумах американской ассоциации по изучению рака (1991, 1993, 1995, 1997, 1999, 2002), международном симпозиуме по раннему выявлению и предотвращению рака (Париж, Франция, 2002). Всего по теме диссертации было сделано 40 устных и постерных презентаций.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, пяти глав, описывающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Объём работы составляет 135 страниц. Диссертация проиллюстрирована 45 рисунками и 6 таблицами. Список цитированной литературы содержит 20 отечественных и 239 зарубежных источников.
В исследованиях были использованы раличные экспериментальные модели химического гепатоканцерогенеза у крыс. В опытах по индукции опухолей печени было использовано 50 Fisher 344 крыс. Ряд исследований был произведён с использованием человеческого опухолевого материала -хирургически удалённые опухоли печени, толстой кишки, желудка, мочевого пузыря, а также образцы крови. Также использовались линии опухолевых клеток грызунов (ВС31) и человека (HeLa, А431).
Межклеточная сообщаемость в опухолях печени in vivo измерялась специально разработанным для этого исследования функциональным методом нанесения уколов красителя Lucifer yellow в толщу полутонких срезов печени, основанном на феномене селективного перетекания красителей через щелевые контакты клеток (Kratovskikh V. et al, 1991, 1995; Kratovskikh V, Yamasaki H., 1995).
Межклеточная сообщаемость в культуре клеток измерялась либо методом микроиньекций красителя Lucifer yellow в отдельные клетки монослоя с последующим количественным подсчётом клеток, в которые перетёк краситель, либо упрощённым методом scrape loading, когда загрузка красителя в клетки производилась путём нанесения пореза монослоя в присутствии в питательной среде красителя Lucifer yellow с последующей полуколичественной оценкой его растекания в соседние неповреждённые клетки.
Опухоль-ассоциированные нарушения экспрессии индивидуальных белков ЩК коннексинов изучались на тканевом уровне рядом непрямых методов (иммуногистохимическая окраска и иммуноблоттинг) с использованием высокоспецифичных антисывороток, полученных в
отделе Многостадийного Канцерогенеза Международного Агентства по Изучению Рака (МАИР) иммунизацией кроликов синтетическими пептидами, соответствующими разным доменам индивидуальных коннексинов. В ряде случаев использовались коммерческие антиконнексиновые антисыворотки (Chemicon Intl, Sigma, Zymed Laboratories Inc., Transduction Laboratories). Иммуногистохимические окраски на белки коннексины производились либо с использованием метода усиления сигнала DAB продукта его последующим серебрением [Merchenthaler I. et al. 1989], либо с использьванием тирамидного метода (TSA Fluorescence systems, NEN Life Science Products). Выявление опухолевых клеток на криостатных срезах опухолей человека производилось с помощью моноклональмных антикератиновых антител (клон HI), любезно предоставленным Д-ром Трояновским СМ, (Медицинская Школа Вашингтонского Университета, Сент Луис, США). Иммунофлюопесцентно окрашенные препараты исследовались в лазерном конфокальном микроскопе Pascal 510, (С Zeiss, Germany).
Механизмы нарушений межклеточных взаимодействий через ЩК при раке изучались различными молекулярно-биологическими методами. Так, наличие мутационных повреждений генов коннексинов первоначально оценивалось непрямым методом гетеродуплекса. Образцы с выявленным аномальным профилем миграции радиоактивно меченных ПЦР-продуктов генов коннексинов проверялись на наличие в них мутаций последующим прямым секвенированием с использованием наборов ABI Prizm BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction на оборудовании AB Applied Biosystems.
Способность белков коннексинов влиять на клеточный рост исследовалась методом устойчивой транс фекции в опухолевые клетки векторов, содержащих соответствующие гены (Invitrogen) и последующей оценки скорости роста полученных в результате отбора устойчивых клонов клеток в культуре.
Противоопухолевый эффект искусственной экспрессии коннексинов после устойчивой трансфекции в опухолевые клетки содержащих эти гены векторов оценивался по динамике развития опухолевых узлов на месте подкожного введения коннексин-экспрессирующих клеточных линий голым мышам.
Мутации белков коннексинов были произведены методом целенаправленного мутагенеза на основе ПЦР с использованием коммерческого набора (QuickChange Site-Directed mutagenesis kit, Stratagene).
Вовлечение межклеточной сообщаемости через ЩК в распространение вызывающих клеточную гибель сигналов изучалось на клеточной линии рака мочевого пузыря крысы (линия ВС31) методом спонтанной избирательной загрузки апоптотических клеток красителями-трейсерами (Lucifer yellow и пропидиум йодида). Клеточная гибель измерялась in situ с помощью флюоресцентно меченного маркера апоптоза Annexin V (Boehringer Mannheim), а также по характеру деградации ДНК, выделенной из клеточных гомогенатов.
Статистическая обработка экспериментальных данных производилась с использованием программы GraphPad PRIZMA 3.
