Введение к работе
Актуальность темы исследования
Одной из важнейших проблем современной медицины является высокая распространенность патологии ЦНС. В развитых странах смертность от нейродегенеративных и цереброваскулярных заболеваний в структуре общей смертности занимает 2-3-е места, в России наблюдается схожая ситуация (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Изучение механизмов повреждения нейронов и глиальных клеток при поражении центральной нервной системы представляет собой актуальную проблему патофизиологии, биохимии, молекулярной и трансляционной медицины. Несмотря на значительное количество исследований, посвященных анализу развития клеточных и молекулярных механизмов нарушения жизнеспособности и функциональной активности нейронов и клеток глиальнои природы, современная медицина все еще далека от создания высокоэффективных технологий коррекции дисфункции мозга (Салмина А.Б. и др., 2008).
Острая нейродегенерация. На первом месте среди причин инвалидности, втором месте среди причин смерти человека (в течение года после дебюта заболевания умирают 48% пациентов), и одними из наиболее распространенных заболеваний зрелого, пожилого, а в последние десятилетия и молодого возраста, являются острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) ишемического типа. Причем наибольшую долю от всех ОНМК (80%) составляют ишемические инсульты (Костычев Н.А., Коршунова А.Б., 2010).
Гипоксически-ишемическое перинатальное поражение головного мозга (перинатальная гипоксия-ишемия, ПГИ) оказывает существенное влияние на многие индивидуальные особенности физической и интеллектуальной сфер развивающегося организма (Northington F.J. et al., 2005), является одной из основных причин смертности (60% заболевших детей умирает в период новорожденное) и неврологической инвалидности (у 25% выживших детей развивается выраженный неврологический дефицит) (Vannucci R.C. et al., 1999; Tu Y.F. et al., 2011; Dickey E.J. et al., 2011). Последствия ПГИ в раннем детском возрасте проявляются в виде синдромов внутричерепной гипертензии, расстройства функции вегетативной нервной системы, гипервозбудимости и гиперактивного поведения, нарушения моторного развития, симптоматических судорог и пароксизмальных расстройств (Шакина Л.Д., Смирнов И.Е., 2010).
Хроническая нейродегенерация. По разным данным, распространенность болезни Паркинсона (БП) в России колеблется от 117000 до 338000 пациентов.
Болезнь Паркинсона развивается в достаточно молодом возрасте: средний возраст дебюта БП - 55 лет, в то же время, у 10% пациентов БП начинается еще раньше - до 40 лет (Воронина Т.А. и др., 2008).
Нарушения развития мозга. Действие повреждающих факторов в
пренатальном или раннем постнатальном периоде может существенным образом
повлиять на механизмы развития головного мозга, которое представляет собой
сопряженные процессы синаптогенеза, нейрон- пролиферации,
дифференцировки и миграции клеток, лежащие в основе сложных форм поведения. Развитие признаков аутистического поведения характерно при действии ряда факторов в пренатальном периоде (вальпроевая кислота, липополисахарид и пр.), что может быть применено в эксперименте для оценки вклада механизмов нарушения развития головного мозга в патогенез нейродегенерации в зрелом мозге (Angelidou A. et al, 2012).
Степень разработанности темы исследования
Известны общие механизмы патогенеза острой и хронической нейродегенерации: развитие воспаления и окислительного стресса (Fukuda S. et al, 2004; Tu Y.F. et al, 2011; Frahbeis С et al, 2012), развитие реактивного астро-и микроглиоза (Bernaudin М. et al., 1998; Miller D.W. et al., 2004), нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Banerjee S., Bhat M.A., 2007; Chalbot S. et al, 2010; Onore C.E. et al, 2012), митохондриальная дисфункция (Miller D.W. et al., 2004), эксайтотоксичность (Jensen F.E., 2005; Matute C, Cavaliere F., 2011), дисфункция нейрон-глиальных взаимодействий (Shaham S., 2005; Ren K., Dubner R., 2008), нарушение нейрогенеза (Arias-Carrion О. et al, 2006; Arias-Carrion 0., 2008; Салмина А.Б. и др., 2012), ведущие к клеточной гибели (Pulera M.R. et al., 1998; Гореликов П.Л., Савельев СВ., 2006; Salmina А.В. et al, 2011; Салмина А.Б. и др., 2012). Однако данные о «молекулярных основах» патогенеза острой и хронической нейродегенерации и о взаимосвязи НАД -зависимых механизмов с проявлениями нейродегенерации были изучены лишь в отношении экспрессии CD38 при аутизме (Higashida Н. et al.,2012).
Известны механизмы, которые могут быть предложены в качестве «мишеней» или «маркеров» при заболеваниях ЦНС (Hirabara S.M. et al., 2012):
НАД -зависимые механизмы регуляции функциональной активности клеток головного мозга, играющие критическую роль в активации и функционировании нейроглиальных клеток в ответ на различные стимулы, с участием НАД -зависимых путей метаболизма (пуринергические рецепторы,
НАД -метаболизирующие ферменты, НАД(Ф)Н-оксидаза), контролирующих гомеостаз НАД и его биодоступность для других ферментов, участвующих в процессах матричных синтезов, репарации ДНК, эпигенетических модификациях ДНК и посттрансляционной модификации белков (Aksoy P. et al., 2006; Dong M.etal, 2011).
Молекулярные механизмы нейрон-астроглиальных взаимодействий,
важные для реализации феномена метаболического сопряжения и
глиоваскулярного контроля, что определяет значение локального
микроокружения, формируемого астроцитами, для функционирования нейронов в (пато)физиологических условиях (Aldskogius Н.К., Kozlova E.N., 1998), поэтому идентификация событий, характеризующих нарушение нейрон-астроглиальной коммуникации, определит прогресс в разработке новых, эффективных методов нейропротекции (Gates М.А. et al, 1993; Fields R.D., Stevens В., 2000; Gomes F.C.A. et al, 2001; Ricci G. et al, 2009).
Молекулярные механизмы воспаления в ЦНС, которые играют роль в активации микроглии и астроглии, запускают» локальную гиперпродукцию цитокинов, формирование инфламмасом, изменение экспрессии ряда молекул, определяющих характер межклеточных взаимодействий. Независимо от причины воспаления при нейродегенерации, терапевтические вмешательства, направленные на предотвращение или подавление этих механизмов, могут быть полезными для остановки прогрессии или развития патологического процесса (Velez-Fort М. et al., 2012), однако данные о механизмах развития воспаления при нейродегенерации или нарушениях развития мозга носят противоречивый и неполный характер (Salmina А.В. et al, 2012).
До сих пор затруднено развитие современных методов диагностики, профилактики и терапии заболеваний центральной нервной системы вследствие недостаточной изученности клеточно-молекулярных механизмов повреждения головного мозга, молекул-маркеров патологических процессов, характеризующих общие компоненты патогенеза или обладающих специфичностью в отношении того или иного вида патологии (Mehta S.L. et al., 2007; Hirabara S.M. et al, 2012).
Таким образом, поиск общего и специфического при острой и хронической дегенерации, нарушениях развития головного мозга - был и остается одной из актуальных задач патофизиологии (Pascual J.M. et al, 1998; Ren К., Dubner R., 2008). Кроме того, существует значительная потребность в оценке влияния дизрегуляции межклеточных взаимодействий на реализацию интегративных
функций головного мозга, в том числе регуляцию сложных форм поведения при неиродегенерации и нарушениях развития мозга.
Цель исследования - выявить вклад НАД -зависимых механизмов
дизрегуляции нейрон-глиальных взаимодействий и нарушения сложных форм
поведения в патогенез ишемии головного мозга и хронической
неиродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона) в эксперименте.
Задачи исследования:
-
Изучить экспрессию молекул, участвующих в НАД -зависимых механизмах внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий (Р2Х7 рецепторы, СБ38/НАД+-гликогидролаза, Сх43, CD157) в клетках нейрональной и глиальной природы при ишемии, хронической неиродегенерации.
-
Выявить изменения метаболического статуса и функциональной активности клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии, хронической неиродегенерации.
-
Изучить особенности апоптоза при ишемии головного мозга, хронической неиродегенерации, нарушении развития мозга во взаимосвязи с изменением НАД -зависимых механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий и механизмами нейровоспаления, контролируемыми НАД -зависимыми процессами в клетках глиальной природы.
-
Исследовать особенности нейрогенеза в различных регионах мозга при острой и хронической неиродегенерации.
-
Выявить специфические изменения, характерные для острой и хронической неиродегенерации на примере экспериментальных моделей ишемии головного мозга и болезни Паркинсона.
-
Оценить вклад изменения нейрон-глиальных взаимодействий в нарушение регуляции сложных форм поведения при ишемии, хронической неиродегенерации (в том числе при действии фактора, индуцирующего нарушение развития мозга в пренатальном периоде).
7. Патогенетически обосновать теорию нейропротективной стратегии и
этиопатогенетической терапии острой и хронической неиродегенерации,
идентифицировав новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени нарушения
нейрон-глиальных взаимодействий и дополнить существующую концепцию
патогенеза острой и хронической неиродегенерации, нарушения развития мозга
новыми данными о механизмах нарушения нейрон-глиальных взаимодействий.
Научная новизна исследования
Впервые предложены новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени для диагностики и фармакологической коррекции активности клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии и хронической нейродегенерации.
Впервые показаны особенности экспрессии НАД -конвертирующих ферментов CD38 и CD157 в дофаминергических нейронах и клетках глии в среднем мозге во взаимосвязи с развитием характерной неврологической симптоматики при экспериментальной болезни Паркинсона и дана оценка изменения количества CD38-, Р2Х7-, Pgp-, Сх43-, CD157-, Мас-1, СЗ/СЗЬ-экспрессирующих клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии и хронической нейродегенерации.
Охарактеризованы новые особенности нарушения НАД -зависимых механизмов нейрон-астроглиального метаболического сопряжения (уровни НАД , лактата, активность АДФ-рибозилциклазы) при ишемии и нейродегенерации.
Впервые показаны особенности экспрессии маркера ранних этапов нейрогенеза и апоптоза клеток головного мозга при нарушении НАД -зависимых механизмов межклеточных взаимодействий и развитии нейровоспаления при ишемии, хронической нейродегенерации.
Выявлены новые особенности экспрессии НАД -конвертирующих ферментов - CD38 и CD 157 - в клетках нейрональной и глиальной природы при развитии нейровоспаления, в том числе во взаимосвязи с НАД -транспортирующими системами (Сх43) и молекулами, регулирующими провоспалительный потенциал клеток микроглии (Мас-1, СЗ/СЗЬ).
Впервые установлено, что действие фактора, нарушающего развитие головного мозга в пренатальном периоде (вальпроат-индуцированная модель аутизма) существенно меняет профиль неврологической симптоматики и реализации сложных форм поведения при развитии экспериментальной болезни Паркинсона, однако доминирующими остаются проявления нейродегенерации.
Теоретическая значимость работы состоит в установлении новых молекулярных механизмов патогенеза острой и хронической нейродегенерации: дополнены данные как о неспецифических механизмах патогенеза острой и хронической нейродегенерации (экспрессия молекул внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий [CD157, CD38, Сх43], нейровоспаления [Р2Х7, Масі, СЗ-СЗЬ], схожие особенности клеточной гибели и нейрогенеза, повышение концентрации лактата и снижение НАД ), так и
специфических особенностях их патогенеза (разнонаправленная метаболическая активность клеток: при ишемии головного мозга отмечается снижение АДФ-рибозилциклазной и функциональной активности клеток ЦНС, при болезни Паркинсона - их увеличение) и выявлении взаимосвязи между молекулярными механизмами и развитием неврологического дефицита при острой и хронической нейродегенерации.
Практическая значимость и внедрение результатов
Разработан новый метод регистрации функциональной активности клеток головного мозга по кинетике их аутофлуоресценции, рекомендуемый для применения при проведении экспериментальных исследований в нейробиологии, нейрофармакологии, нейрохимии.
При последующей разработке персонифицированных методов диагностики и терапии ишемического повреждения и хронической нейродегенерации могут быть использованы полученные данные о молекулах-маркерах и молекулах-мишенях, определяющих характер протекания НАД -зависимых процессов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий (CD157, CD38, Сх43), нейровоспаления (Р2Х7, НАДФН-оксидаза, Масі, СЗ-СЗЬ).
Уточненные механизмы развития ишемического повреждения головного мозга, хронической нейродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона), ассоциированные с нарушением нейрон-глиальных взаимодействий и сложных форм поведения, существенно дополняют концепцию патогенеза повреждения клеток центральной нервной системы и нарушения интегративных функций головного мозга.
Получен патент на изобретение: «Способ коррекции постишемической когнитивной дисфункции» (2008).
Результаты проведенного исследования внедрены в научный процесс НОЦ «Трансляционная медицина» и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (акт внедрения от 06.09.2013), учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (курс «Трансляционная медицина» на русском и английском языках для студентов 5 курса лечебного факультета, курс «Нейробиология развития. Новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени для
диагностики и терапии заболеваний головного мозга» на русском и английском языках для аспирантов КрасГМУ, акт внедрения от 06.09.2013).
Методология и методы исследования
Работа носит экспериментальный характер. Материал исследования -крысы линии Wistar. Для решения поставленных задач выполнено моделирование острой и хронической нейродегенерации, поведенческое фенотипирование животных и оценка у них интегративных функций головного мозга, проведены физико-химические (флуориметрические и фотометрические методы) и клеточно-биологические (иммуногистоцитохимия, TUNEL, флуоресцентная и конфокальная микроскопия) методы исследования на полученных образцах головного мозга; достоверность полученных данных подтверждена методами статистического анализа.
Положения, выносимые на защиту:
-
В патогенезе ишемического повреждения мозга и хронической нейродегенерации важную роль играют нарушения НАД -зависимых механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий, связанные с развитием астро- и микроглиоза, сопровождающиеся изменением экспрессии Р2Х7 рецепторов, СБ38/НАД+-гликогидролазы и Сх43, с преимущественной локализацией CD38 в активированных астроцитах и уменьшением активности АДФ-рибозилциклазы при ишемии головного мозга, преимущественной локализацией CD38 в астроцитах и активированной микроглии и увеличением активности АДФ-рибозилциклазы при экспериментальной болезни Паркинсона. Маркерами нарушения нейрон-глиальных взаимодействий при ишемии и хронической нейродегенерации являются уровни лактата и НАД во внеклеточном пространстве, экспрессия CD38 и Сх43 в клетках нейрональной и астроглиальной природы, экспрессия CD157, Мас-1 и СЗ/СЗЬ в клетках микроглиальной природы. Увеличение экспрессии CD38, Сх43 и Р2Х7 маркирует повреждение клеток «вторичного» характера (вследствие высвобождения активных метаболитов во внеклеточное пространство) при острой ишемии и хронической нейродегенерации.
-
Развитие ишемического повреждения и хронической нейродегенерации сопровождается появлением признаков повреждения ткани: увеличенная экспрессия Р2Х7 рецепторов, CD38, Мас-1 и СЗ/СЗЬ, и признаков восстановления поврежденных клеток: увеличенная экспрессия Рахб в гиппокампе или среднем мозге, экспрессия Р-гликопротеина, снижение уровня НАД , динамическое равновесие между которыми определяет развитие апоптоза
клеток нейрональной и глиальной природы в поврежденной области мозга, а также неврологической симптоматики, характерной для ишемии или экспериментальной болезни Паркинсона. Увеличение экспрессии Мас-1 в среднем мозге при экспериментальной болезни Паркинсона и в пораженной области коры мозга при ишемии сопровождается увеличением экспрессии СЗ/СЗЬ, что свидетельствует о вкладе комплемент-опосредованного механизма повреждения клеток в патогенез острой и хронической нейродегенерации. Коэкспрессия CD 157 с комплексом CD1 lb/CD 18 характеризует изменение CD 157-контролируемых механизмов регуляции уровня НАД в активированных клетках микроглии.
-
Экспрессия CD38 на клетках нейрональной и глиальной природы дифференцирует процессы, сопровождающие развитие острой и хронической нейродегенерации: при ишемическом повреждении мозга нейрональная экспрессия CD38 соответствует усилению нейрогенеза в коре и гиппокампе, а астроглиальная экспрессия CD38 характеризует интенсивность локального метаболизма НАД ; при болезни Паркинсона нейрональная и астроглиальная экспрессия CD38 соответствует реакции активированной микроглии, микроглиальная экспрессия CD38 характеризует интенсивность развития апоптоза в среднем мозге. Активность НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках микроглии меняется однонаправленно с активностью АДФ-рибозилциклазы/С038, причем при ишемии головного мозга активность ферментов уменьшается, а при экспериментальной болезни Паркинсона - увеличивается.
-
Нарушение НАД -зависимых механизмов нейрон-глиальных взаимодействий, определяющее чувствительность клеток к действию апоптогенных стимулов, находит свое отражение в развитии неврологической симптоматики и поведения, специфически характеризующих повреждение клеток при острой ишемии и экспериментальной болезни Паркинсона (в том числе на фоне действия индуктора нарушения развития головного мозга в пренатальном периоде).
-
Направленная регуляция НАД -зависимых механизмов межклеточных взаимодействий достигается применением модуляторов активности CD38, нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа, НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках нейрональной и глиальной природы.
Степень достоверности полученных результатов
Все научные положения и выводы обоснованы применением системного анализа поставленной проблемы, современных методов нейробиологии,
достоверной выборкой исследуемых животных, большим объемом фактического материала, который подвергнут адекватному статистическому анализу.
Апробация результатов
Основные положения работы были доложены и обсуждены на школе-семинаре для молодых ученых «Новые терапевтические стратегии: клеточно-молекулярные мишени действия» в рамках Сибирского конгресса «Человек и лекарство» (Красноярск, 2009), IV,VI и VII Российско-Японских семинарах по нейронаукам (Красноярск, 2009, 2011, 2012), симпозиуме «Образование и интеграция специалистов в области медицинской генетики и молекулярной медицины» в рамках I Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Москва, 2010), 1 международной 3D онлайн-конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля - к геному, протеому и липидому» (Казань, 2011), международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), Школе молодых ученых «Экспериментальные модели заболеваний центральной нервной системы» в рамках выездного Пленума проблемной комиссии «Фундаментальные вопросы нейронаук» Научного Совета РФ по неврологии (Красноярск, 2011), III Съезде физиологов СНГ (Украина, Ялта, 2011), II Всероссийской Интернет-Конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011), международном конгрессе «BITs 2nd Annual World Congress of NeuroTalk» (Dalian, China, 2011), I Международной Интернет-Конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2012), научных семинарах научно-образовательного центра «Трансляционная медицина», НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ (Красноярск, 2010-2013).
Публикации по теме диссертации
Результаты проводимых исследований опубликованы в 46 печатных работах, 16 из которых - в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 2 - в зарубежных изданиях, получен патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации
