Введение к работе
Актуальность проблемы. По представлению Европейской базы данных ЗДВ (HFA-DB) (Европейское региональное бюро Всемирной организации здравоохранения), психические расстройства, болезни нервной системы и органов чувств составляли в РФ в 2006 г - 1514 человек на 100000 населения. Инсульт в РФ занимает второе место среди причин смертности и первое место среди причин инвалидизации. Ежегодно им заболевает свыше 450 тыс. чел. (Верещагина Н.В. и др., 2002; Гусев Е.И. и др, 2003; Яхно Н.Н., Виленский Б.С., 2005).
Инсульт и другие цереброваскулярные болезни - ведущая причина заболеваемости и смертности в США (March B.J., 2009), среди причин смертности в других индустриально развитых странах инсульт занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Green A.R., 2008).
В последние годы значительно расширились исследования по регенерации нервной системы и после открытия на рубеже XX и XXI вв. нейральных стволовых клеток в головном мозге (Reynolds В.А., et al., 1993; Weiss S., et al., 1996; Morshead СМ., et al., 1998; Weiss S, van der Kooy D., 1998; Johansson СВ., et al., 1999; Gage F.H., 2000; Kornack D.R., Rakic P., 2001) и костном мозге (Brazelton T.R., et al., 2000; Mezey E., et al., 2000; Blau H.M., et al., 2001) существенно повысился интерес к изучению стволовых клеток. Эти исследования по регенерации нервной системы преимущественно осуществляются как поиск доказательств нейроногенеза в постнатальном периоде. На эту тему опубликовано много работ, описывающих обнаружение тех или иных признаков пролиферации нейронов у взрослых млекопитающих. Роль стволовых клеток и нейральных, в частности, стали рассматривать в однообразном только клеточно-заместительном плане. При упрощенном понимании роли стволовых клеток, казалось, что это открытие ведет к немедленному решению многих медицинских проблем. Все больше стало появляться работ по применению стволовых клеток с лечебной целью в эксперименте и клинике. Мы упомянем только работы неврологической направленности (Скворцова В.Н. и др., 2008; Rossi F.M. et al., 2000; Nakatomi H. et al., 2002; Teng Y. et al., 2002). Немало сообщений и опровергающих эти работы. Некоторые из них оказались терапевтически не эффективны. Но даже если отмечалось лечебное действие, его без специального подтверждения, нельзя объяснять непременно нейроногенезом. Это мнение выражали и сами авторы обсуждаемых работ (Скворцова В.Н. и др., 2008; Teng Y. et al., 2002). Такие результаты, на наш взгляд, являются серьезным мотивом для тщательного всестороннего изучения феномена- нейральная стволовая клетка.
В начале XXI-ого века феномен слияния привлек исследовательский интерес тем, что изменил представления о трансдифференцировке, трансдетерминации или пластичности не только нейральных, но и прочих стволовых клеток. Под
трансдифференцировкой и пластичностью подразумевается способность стволов клеток взрослого организма превращаться в дефинитивные клетки друп зародышевого листка. Такая трактовка воспринималась с доверием до 2002-2003 і когда сразу в нескольких публикациях (Gussoni Е. et al., 2002; Terada N. et al., 20 Ying Qi-L. et al., 2002; Alvarez-Dolado M. et al., 2003; Vassilopoulos G. et al., 2003; W< X. et al., 2003) было заявлено, что слияние стволовой клетки с дифференцировав клеткой различных тканей - событие не редкое и увеличивающееся при поврежден данной ткани. По этой причине «классическое» доказательство пластичности присутствие в дифференцированной клетке маркера стволовой - может иметь и друї объяснение. Стволовая клетка не превратилась в дефинитивную, создав при эт самостоятельно маркеры дифференцировки, а просто слилась с дифференцированной в результате получила уже готовые маркеры, не пройдя соответствующего гг развития и собственной выработки этих маркеров.
Вышеперечисленные теоретические фундаментальные исследования и медив социальная значимость проблемы определяют актуальность исследования механизм регенерации нервной системы и, в первую очередь, нейронов коры. Знания в эт области расширят возможности профилактических и лечебных мероприятий д коррекции и восстановления нарушенных функций ЦНС при нейродегенеративні заболеваниях.
Цель исследования: определить происходят ли слияния региональных клет в префронтальной коре головного мозга (в норме и при создании ишемического оча: и каково значение этих слияний для репаративной регенерации.
Задачи исследования:
1. При ишемическом повреждении префронтальной коры головного мо;
крыс изучить выраженность слияний в поврежденной и неповрежденной ЗОИ
префронтальной коры.
-
Разработать методики определения слившихся клеток (дикарионі гетерокарионов) и проверить достоверность слияния методами электронной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с различными флуорохромны зондами, а также иммуноцитохимическим методом.
-
Выяснить регенераторное значение слияния клеток коры пут количественного определения числа слияний при нарушении и восстановлен функции префронтальной зоны коры.
-
Провести авторадиографическое исследование с целью определі жизнеспособность слившихся и одноядерных клеток и способность клеток коры пролиферации.
5. Определить биологическую роль появления в нейроне второго ядра.
Научная новизна. Впервые экспериментально доказан факт слияния региональных клеток в префронтальной зоне коры головного мозга и образование двуядерных клеток. При слиянии двух нейронов возникали дикарионы. При слиянии нейрона с олигодендроцитом образовывались гетерокарионы. При образовании гетерокариона происходило перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейрональном направлении с повышением дисперсности хроматина и с последующим преобразованием ядра олигодендроцита в ядро нейрона. Взаимосвязь структуры и функции указывает на то, что перепрограммированное ядро олигодендроцита функционировало как ядро нейрона. Слившийся с олигодендроцитом нейрон получает второй набор генов от олигодендроцита, становится тетраплоидным или, по крайней мере, гипердиплоидным и может выполнять повышенную, скорее всего, удвоенную функциональную нагрузку.
Получены данные, указывающие, что наряду с описанной Д.С. Саркисовым внутриклеточной регенерацией путем самостоятельной гиперплазии ультраструктур, нейрон может также внутриклеточно регенерировать, получая эти структуры извне от слившегося с ним ядра олигодендроцита. Приобретенный второй комплект генов может обеспечить увеличение числа любых необходимых структур. Морфологические данные подтверждаются результатами функциональных исследований, показавшими, что улучшение условно-рефлекторной деятельности животных происходит вместе с увеличением числа слияний в префронтальной коре. Показано, что функциональные возможности стволовых нейральных клеток шире, чем было известно ранее. Если раньше роль нейральных и других стволовых клеток представлялась, как только заместительная, то наши данные свидетельствуют, что стволовая клетка через прогенитора, например, олигодендроцита, может не замещать утраченную клетку, а отдавать сохранившейся клетке свое ядро и обеспечивать, таким образом, своеобразную внутриклеточную пролиферацию генов.
Впервые обнаружено, что иногда вслед за объединением цитоплазмы происходило и объединение ядер. В таком случае двуядерный дикарион превращался в одноядерный синкарион. В единственном ядре синкариона содержание ДНК повышается и может доходить до восьми гаплоидных наборов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа фундаментальная. Полученные знания могут быть использованы для оценки скорости и полноты регенерации при действии различных повреждающих факторов и терапевтических агентов. Накопление знаний в области регенерации ЦНС в дальнейшем может дать возможность рационально влиять на частоту слияния клеток и тем направлять в желаемое для врача русло ход физиологической и репаративной регенерации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Нейроны префронтальной зоны коры (поля Frl, Fr2) могут сливаться олигоденроцитами.
-
Улучшение условно-рефлекторной деятельности и статистичесі достоверное увеличение числа дикарионов в префронтальной коре указывают і регенеративное значение слияния клеток.
-
В случае слияния образуется двуядерный гипердиплоидный нейрон дикарион. При слиянии нейрона и олигодендроцита, ядро последнего подвергает перепрограммированию в нейрональном направлении с резким усиление дисперсности хроматина, размера ядра и, в конце концов, становится неотличимым і ядра нейрона. Следовательно, нейрональный дикарион образуется через стади гетерокариона. Принцип единства структуры и функции подсказывает, ч завершившее перепрограммирование бывшее ядро олигодендроцита начина экспрессировать нейрональные гены.
-
Появление дикарионов и образование синкарионов свидетельствуют повышении плоидности нейронов коры в онтогенезе.
-
Слияние олигодендроцитов (прогениторных клеток) с нейронами последующим внутриклеточным перепрограммированием ядер первых по образі вторых, показывает, что биология стволовых клеток не ограничивается наращиваниі числа клеток при развитии и восстановлением их количества при регенерации. Э особенно целесообразно в поддержании гомеостаза ЦНС. Стволовая клетка образует новой дефинитивной клетки. Сложная задача компенсации повреждения и. утраты нейрона, отличающегося индивидуализированным багажом памяти, решает организмом при помощи стволовой клетки путем создания второго ядра поврежденной клетке. Второе ядро обеспечивает гиперплазию ультраструкт) материализующих память.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на: V конференц; молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки прогресс клинической медицины» в форме устного доклада (2008 г, Москв; Заседании Ученого совета НИИОПП РАМН совместно с Бюро ОБМН РАМ посвященном 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ, академи АМН СССР и РАМН Доната Семеновича Саркисова (2009 г, Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи из них 3 в БЭБи] 1 тезисы в Вестнике РАМН.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и спис литературы. Работа изложена на 142 страницах компьютерного текста, содержит
таблицы и 70 рисунков. Библиографический указатель включает 34 отечественных и 119 зарубежных источника.
