Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на продолжительную историю изучения туляремии и ее возбудителя, механизм патогенности туляремийного микроба недостаточно исследован. Возбудитель туляремии интересен и с точки зрения изучения механизмов иммуногенеза, поскольку обеспечивает развитие резистентности организма к повторному заражению.
Известно, что Francisella tularensis является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов, заражающая доза которого для человека при аэрогенном заражении составляет 10 микробных клеток (Олсуфьев Н.Г., 1975; Ellis J. et al., 2002). Из-за высокой вирулентности туляремийный микроб рассматривается как один из наиболее вероятных средств биотерроризма (Домарадский И.В., 2005; Dennis D.G. et al., 2001; Lamps L.W. et al., 2004).
Природные очаги туляремии, выявленные первоначально в Северной Америке, а в последующие годы и в других регионах земного шара, обнаружены и на обширных территориях как России, так и ряда сопредельных государств, что создает потенциальную угрозу для проживающего здесь населения.
В соответствии с современными представлениями (Francisella tularensis taxonomy..., 2004), возбудитель туляремии - Francisella tularensis имеет четыре подвида - F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. novicida, которые различаются между собой по ряду биологических свойств, в том числе по кардинальному признаку - вирулентности для макроорганизма (Johansson A. et al., 2000).
Накопленные к настоящему времени научные сведения однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в том числе и F. tularensis, является биологически сложным полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса (Анисимов А.П., 2002; Домарадский И.В., 2005; Ellis J. et al., 2002). Способность многих патогенных бактерий к паразитированию в фагоцитах, играющая важную роль в патогенезе инфекции, обусловлена генетическим детерминированием этого признака на хромосомном и (или) плазмидном уровнях (Thomas R.M. et al., 2007; Nano F.E., 2004).
Известно, что F. tularensis является внутриклеточным паразитом, поэтому ведущим звеном в защите организма хозяина является клеточный фактор (Олсуфьев Н.Г., 1975; Голубинский Е.П. и др., 1995; Дубровина В.И., 2002; Домарадский И.В., 2005; Ellis J. et al., 2002; Larsson P. et al., 2005). Очевидно, что выживание и последующее размножение туляремийного микроба в фагоците является начальным механизмом патогенеза инфекции (Tarnvik А., 1989; Antony L.S.D. et al., 1991; Ellis J. et al., 2002). Недавно показано, что туляремийный микроб может выживать и размножаться и внутри амебы Acanthamoebae castellani (Abd Н. et al., 2003), что свидетельстует о возможной роли простейших в качестве резервуара туляремийной инфекции в окружающей среде.
\<0
В качестве немногих установленных детерминант вирулентности F tularensis рассматриваются клеточная капсула (Hood A.M., 1977) и белок молекулярной массой 23 кДа, при инактивации которого снижаются вирулентность и способность туляремийного микроба выживать в макрофагах (Golovliov I. et al., 1997). Предполагается, что с белком 23 кДа связана также способность этого микроба подавлять образование макрофагами ФНО-а и ИЛ-1а (Telepnev М. et al., 2003).
Основное внимание исследователей в последние годы было направлено на изучение хромосомных факторов патогенности туляремийного микроба и их влияния на механизмы внутримакрофагального роста, внутриамебного выживания и вирулентности (Baron G.S., Nano F.E., 1998; Gray C.G. et al., 2002; Broekhuijsen M. et al., 2003; Nano F.E. et al., 2004; Lauriano CM. et al., 2004; Nano RE. et al., 2004; Larsson P. et al., 2005).
Работы, касающиеся фагоцитоза туляремийного микроба, затрагивают, в основном, отдельные этапы взаимодействия F. tularensis с иммунокомпетентными клетками (Голубинский Е.П. и др., 1995; Павлович Н.В., 1996; Дубровина В.И., 2002; Оноприенко Н.Н., Павлович Н.В., 2003; Fortier А.Н. et al, 1994; Telepnev М. et al., 2003; Lai H.X. et al., 2004). Между тем, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитов при их взаимодействии с F. tularensis и закономерности этих реакций, - изучены в меньшей мере. В связи с этим, сравнительное изучение фагоцитоза туляремийного микроба с разными биологическими свойствами помимо научного интереса в раскрытии механизмов и особенностей этого процесса, будет способствовать пониманию патогенеза туляремии и, возможно, экспериментальному обоснованию механизмов его циркуляции в природных очагах.
На основании вышеизложенного, целью работы является выяснение роли бактерицидных механизмов фагоцитоза туляремийного микроба разных подвидов клетками иммупофагоцитарной системы в условиях in vitro и в динамике инфекционного процесса.
Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:
-
Выявить особенности фагоцитарной способности макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов морских свинок при их взаимодействии в условиях in vitro с туляремийным микробом разных подвидов.
-
Исследовать особенности бактерицидных реакций фагоцитов экспериментальных животных в ответ на воздействие туляремийного микроба разных подвидов.
-
Дать сравнительную оценку действия F. tularensis разных подвидов на ци-токинпродуцирующую активность перитонеальных макрофагов белых мышей.
-
Выяснить особенности бактерицидных механизмов фагоцитоза F. tularensis разных подвидов в динамике развития инфекционного процесса.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное сравнительное исследование особенности формирования неспецифической резистентности организма экспериментальных
животных (белых мышей и морских свинок) к возбудителю туляремии с разными фенотипическими свойствами.
Новыми являются сведения о том, что усиление продукции противовоспалительного (ИЛ-10) и провоспалительных (ФНО-а, ИЛ-1а, ИФН-у) цитокинов фагоцитами под действием туляремийного микроба зависит от его подвидовой принадлежности и вирулентности. Показано, что наиболее выраженным стимулирующим эффектом на синтез ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у обладает F. tularensis subsp. novicida. Установлено, что снижение продукции ИЛ-1 а, ФНО-а, ИФН-у и активация ИЛ-10 фагоцитами животных, зараженных К tularensis subsp. tularensis, приводит к угнетению их функциональной способности и, как следствие, - к снижению противоинфекционной защиты и гибели животного.
Экспериментально доказано, что бактерии F. tularensis subsp. holarctica и F. tularensis subsp. novicida активируют, a F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica ингибируют системы, способствующие захвату (адгезия и поглощение) и внутриклеточной деградации микроба (кислородзависимые, нитрок-сидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные факторы).
Приоритетными являются данные о том, что ген, кодирующий белок PdpA, определяет ряд дополнительных факторов пагогенности, обусловливающих повышение устойчивости F. tularensis к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ. Утрата у штаммов области pdpA способствует выживанию экспериментальных животных, инфицированных возбудителем туляремии.
Теоретическое и практическое значение работы
На основании проведенных исследований молекулярно-биологических механизмов патогенеза туляремии показана роль бактерицидных систем (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) фагоцитоза.
Получены новые данные о бактерицидных реакциях фагоцитов и их функциональных изменениях в иммунокомпетентных органах экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном F. tularensis разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.
Для оценки неспецифической резистентности организма патогенетически обоснована возможность тестирования показателей функциональной способности клеток иммунофагоцитарной системы экспериментальных животных в ответ на введение патогена.
Экспериментально показано, что наличие области pdpA npdpD в генетической структуре острова патогенности F. tularensis разных подвидов может частично объяснить взаимосвязь уровня вирулентности и его подвидовой принадлежности.
Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении трех методических рекомендаций.
Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского противочумного института, Улан-Удэнского института общей и экс-
периментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», СИФИБР СО РАН (г. Иркутск).
Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора.
Положения исследования, выносимые на защиту:
-
Цитокинпродуцирующая способность фагоцитов при взаимодействии с бактериями F. tularensis зависит от их подвидовой принадлежности и вирулентности. При внедрении F. tularensis subsp. holarctica и F. tularensis subsp. novicida медиаторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1а, ИФН-у) индуцируют активацию эф-фекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция цитокинов, супероксидных и нитроксидных радикалов) в большей степени, чем F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica.
-
Бактерии F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica более устойчивы к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ, чем F. tularensis subsp. holarctica. Фагоцитоз F. tularensis subsp. novicida клетками иммунофагоцитарной системы является завершенным. Факторами, повышающими устойчивость бактерий F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica к фагоцитозу, является их способность ингибировать кислородзависимые, кисло-роднезависимые и нитроксидзависимые бактерицидные системы фагоцитов.
Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на международных научных конференциях: «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010); ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); Всероссийских научных конференциях: «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009); конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); региональных конференциях: «Научно-теоретическая конференция аспирантов и студентов Иркутского государственного университета» (Иркутск, 2007-2010); научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 2004-2010).
Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР (2008-2010 гг.).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две в иностранных журналах.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 16 рисунками. Список литературных источников содержит 205 наименований, в том числе 152 - зарубежных.
