Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Онтогенетический аспект становления системы циркуляции жидкости в хрусталике. возможные механизмы регуляции водного гомеостаза хрусталика 13
1.1. Этапы эмбрионального развития хрусталика 13
1.2. Структурные компартменты хрусталика и их роль в поддержании прозрачности 20
1.3. Роль циркуляторной системы хрусталика в поддержании его прозрачности 32
1.4. Перспективные направления профилактики и лечения катаракты 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Экспериментальное моделирование помутнения хрусталика in vitro 41
2.2. Получение экстрактов органов и тканей (экстракта гипофиза крысы, цилиарного тела кролика, глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона) 51
2.3. Определение содержания белка в экстракте глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 52
2.4. Определение содержания белковых фракций в экстракте глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 53
2.5. Определение содержания молекул средней массы в экстракте глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 55
2.6. Определение значения рН экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 56
2.7. Определение желатиназной активности тканей глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 56
2.8. Определение хемоаттрактантной активности экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 57
2.9. Иммуногистохимическое исследование хрусталика четырнадцатидневного куриного эмбриона 59
2.10. Статистическая обработка результатов исследования 60
Глава 3. Результаты исследования 61
3.1. Факторы, оказывающие влияние на прозрачность хрусталика в условиях in vitro 61
3.2. Влияние биологически активных веществ на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro 66
3.2.1. Влияние вазопрессина на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro 67
3.2.2. Влияние компонентов ренин-ангиотензиновой системы на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro 71
3.2.3. Влияние эстрогенов на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro 73
3.3. Источник биологически активных регуляторов водного гомеостаза хрусталика в структуре глаза 75
3.4. Влияние ацетилсалициловой кислоты на прозрачность хрусталика 79
3.5. Влияние экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона на прозрачность хрусталика в условиях in vitro 81
3.6. Биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 85
3.6.1. Содержание белка в экстракте глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 85
3.6.2. Фракционный состав белков в экстракте глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 86
3.6.3. Содержание молекул средней массы в экстракте глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 88
3.6.4. Значение рН экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 88
3.6.5. Желатиназная активность тканей глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 89
3.6.6. Хемоаттрактантная активность экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 91
3.6.7. Экспрессия VEGF в структурах глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона 92
Обсуждение результатов собственных исследований 94
Выводы 109
Список литературы 111
- Структурные компартменты хрусталика и их роль в поддержании прозрачности
- Получение экстрактов органов и тканей (экстракта гипофиза крысы, цилиарного тела кролика, глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона)
- Влияние биологически активных веществ на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro
- Биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона
Введение к работе
Актуальность темы
Катаракта является одной из ведущих причин слабовидения и слепоты наряду с глаукомой и возрастной макулярной дегенерацией (Р.А. Гундорова и соавт., 2004, 2005, 2006). По данным Всемирной Организации Здравоохранения, на долю катаракты приходится 42 % всей глазной патологии. Согласно статистике, частота возрастной катаракты составляет 33,2 случая на 1 000 населения, причём эта цифра существенно увеличивается с возрастом и достигает в 70 – 79 лет 262,3 на 1 000 мужчин и 464,3 на 1 000 женщин. Практически все лица старше 80 лет страдают катарактой (Г.С. Полунин и соавт., 2007).
Основным методом лечения катаракты является хирургическая замена помутневшего хрусталика искусственным (Р.А. Гундорова и соавт., 2005). Однако известно, что через 2 – 5 лет после оперативного лечения у 25,7 – 50,0 % больных наблюдается вторичное снижение остроты зрения вследствие помутнения задней капсулы хрусталика. Это связано с миграцией клеток эпителия с передней капсулы хрусталика на заднюю с их последующей эпителиально-мезенхимальной трансформацией в фибробласты и миофибробласты, что приводит к образованию на задней капсуле многослойных бляшек (J.M. Wormstone et al., 2001; A. Cerra et al., 2003; K.J. Mansfield et al., 2004). Группу риска по формированию катаракты составляют больные, перенесшие любое хирургическое вмешательство на глазном яблоке (О.И. Кваша, 2007).
В хирургическом лечении катаракты, особенно после внедрения методов факоэмульсификации, достигнуты большие успехи, тем не менее, побочные эффекты и последствия оперативного вмешательства стимулируют исследователей на поиск лекарственных средств для профилактики и, возможно, лечения катаракты (Р.А. Гундорова и соавт., 2005, 2006; О.И. Кваша, 2007). Разработка методов воздействия на прозрачность хрусталика в значительной мере зависит от понимания молекулярных основ катарактогенеза.
В настоящее время достаточно хорошо изучены патогенетические закономерности развития катаракты. Помутнение хрусталика – сложный многофакторный и многостадийный процесс. На прозрачность хрусталика влияют углеводный дисбаланс, неблагоприятные факторы окружающей среды – световая энергия, радиоактивное излучение, электромагнитное поле, механические повреждения. Ключевой этап помутнения хрусталика заключается в агрегации водорастворимых белков кристаллинов, физико-химическое состояние которых определяет прозрачность в большей степени, чем изменения других компонентов. В нормально функционирующем хрусталике кристаллины находятся в виде высококонцентрированного раствора, прозрачного для видимого света. При развитии катаракты под действием неблагоприятных факторов происходит образование крупномолекулярных белковых агрегатов, которые при определённых концентрациях служат причинами помутнения хрусталика.
В последние годы в исследовательских работах, посвящённых проблеме помутнения хрусталика, большое внимание стали уделять состоянию его водного гомеостаза. Основными структурами, участвующими в поддержании баланса воды хрусталика, являются белки плазматических мембран – аквапорины (AQP0 волокнистых клеток и AQP1 эпителиальных клеток капсулы) (S.M. Mulders et al, 1995; S. Hamann et al, 1998; K.L. Schey et al, 2000; P. Donaldson et al, 2001; Y. Fujiyoshi et al, 2002; L.E. Ball et al, 2003). Изменение водного гомеостаза непосредственно воздействует на структуру водорастворимых кристаллинов хрусталика, что влияет на состояние его прозрачности. В литературе описаны механизмы гуморальной регуляции активности различных изоформ аквапоринов в почках, головном мозге, лёгких, однако относительно AQP хрусталика эта проблема остаётся нерешённой (D. Marples et al, 1999; P. Agre, 2004). Кроме того, практически не исследован вопрос об источнике биологически активных веществ, регулирующих функцию аквапоринов хрусталика. Возможно, на эту роль претендует цилиарное тело, поскольку в некоторых работах (J. Escribano et al, 2002; M. Coca-Prados et al, 2007) высказано предположение о том, что оно является мультиэндокринной железой, продуцирующей комплекс биологически активных веществ.
Результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют о существовании потенциальной возможности воздействия на различные звенья формирования помутнения хрусталика, в частности на агрегацию водорастворимых белков цитоплазмы кристаллинов волокнистых клеток (С.Э. Аветисов и соавт., 2008; К.О. Муранов и соавт., 2008, Л.В. Соустов и соавт., 2008).
Известно, что биологические препараты, полученные из интенсивно пролиферирующих тканей, способны поддерживать тканевый и клеточный гомеостаз (В.П. Ямскова и соавт., 2000). К таковым можно отнести развивающиеся органы в различные периоды эмбриогенеза. В Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца доказано, что регуляторный белок, выделенный из хрусталика быка, предотвращает развитие ядерного помутнения хрусталика in vitro (М.С. Краснов и соавт., 2005). Наше внимание обращено на экстракт, полученный из глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона, поскольку именно в этот период развития в тканях присутствует комплекс биологически активных веществ, определяющих высокий пролиферативный потенциал, миграционную способность и дифференцировку клеток.
Анализ этих данных определил цель нашего исследования.
Цель работы
В условиях эксперимента in vitro изучить влияние на прозрачность хрусталика некоторых повреждающих факторов, гуморальных регуляторов активности аквапоринов, а также экстрактов различных тканей.
Задачи исследования
-
Исследовать влияние изменения кальциевого и водного гомеостаза хрусталика на его прозрачность в условиях in vitro;
-
В условиях in vitro оценить прозрачность хрусталика под влиянием гуморальных регуляторов активности аквапоринов;
-
Оценить характер воздействия на прозрачность хрусталика экстракта цилиарного тела;
-
Исследовать влияние экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, определить некоторые биохимические и иммунологические свойства экстракта.
Научная новизна
Впервые показано, что нарушение функции аквапоринов в условиях in vitro вызывает изменение прозрачности хрусталика в более ранние сроки, чем дисфункция кальциевых каналов. Установлено положительное влияние гуморальных регуляторов активности аквапоринов (вазопрессин, эстрогены, компоненты ренин-ангиотензиновой системы) на прозрачность хрусталика. В условиях эксперимента впервые показано, что экстракт цилиарного тела и экстракт глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона оказывают положительное влияние на прозрачность хрусталика. Впервые исследованы некоторые биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона. В экспериментальных условиях впервые получены косвенные свидетельства существования локальной ренин-ангиотензиновой системы хрусталика.
Теоретическая и практическая значимость работы
В исследовании показан характер влияния различных факторов, в том числе гуморальных регуляторов активности аквапоринов, на прозрачность хрусталика. Доказано положительное влияние на прозрачность хрусталика веществ, обладающих способностью индуцировать шаперонную активность кристаллинов, а также экстракта глаза куриного эмбриона. Полученные результаты могут послужитьть основой для понимания фундаментальных молекулярных механизмов, обеспечивающих сохранение прозрачности хрусталика на протяжении всей жизни, а также лежащих в основе катарактогенеза. Исследование обозначает новые направления поиска препаратов для профилактики и лечения катаракты.
Положения диссертации, выносимые на защиту
-
Прозрачность хрусталика в условиях in vitro определяется постоянством кальциевого и водного гомеостаза его клеточных и внеклеточных структур. Одним из ключевых факторов в развитии помутнения хрусталика является нарушение циркуляции жидкости в его компартментах.
-
Гуморальными факторами, влияющими на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, являются вазопрессин, эстрогены, компоненты ренин-ангиотензиновой системы.
-
Добавление в среду для культивирования хрусталика экстракта цилиарного тела оказывает положительное влияние на прозрачность.
-
Экстракт глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона содержит комплекс биологически активных веществ, которые способствуют поддержанию прозрачности хрусталика в условиях in vitro.
-
Ацетилсалициловая кислота оказывает положительное влияние на прозрачность хрусталиков в условиях in vitro.
Апробация работы и публикации
Основные положения работы изложены и представлены на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Саратов, 2006), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвящённой памяти профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2008), Российском симпозиуме с международным участием, посвящённом 70-летию заведующего кафедрой Башкирского государственного медицинского университета Д.А. Еникеева (Уфа, 2009), IV Съезде физиологов Урала с международным участием (Екатеринбург, 2009).
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 5 из них - в ведущих рецензируемых журналах из перечня, определенного ВАК Минобрнауки РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками. Библиографический список включает 182 источника – 40 отечественных и 142 иностранных.
Структурные компартменты хрусталика и их роль в поддержании прозрачности
Хрусталик наряду с роговицей, жидкостью передней камеры и стекловидным телом составляет светопроводящий и светопреломляющий аппарат глаза, который позволяет световой волне беспрепятственно проникать к сетчатке. Основными характеристиками хрусталика, обеспечивающими нормальное функционирование зрительного анализатора, являются прозрачность, эластичность и сферичность поверхностей, что достигается при условии сбалансированности всех звеньев метаболизма, сохранности его морфологической и биохимической структуры.
В хрусталике различают передний и задний полюсы, а также экватор, которым хрусталик условно разделяется на переднюю и заднюю поверхности.
Гистологически в нём выделяют капсулу, эпителий и волокна (волокнистые клетки хрусталика).
В капсуле выделяют передний и задний отделы (передняя и задняя капсула), разделённые в области экватора узкой зонулярной пластинкой. Толщина передней капсулы хрусталика человека составляет 0,008 — 0,020 мм, а задней — 0,002 — 0,004 мм. С возрастом толщина капсулы увеличивается.
На внутренней поверхности передней капсулы располагается монослой эпителиальных клеток. Основания клеток достаточно плотно соединены с капсулой. Различают центральную, промежуточную и экваториальную зоны эпителия. Клетки центральной зоны крупнее, чем промежуточной и экваториальной. Центральная зона приблизительно соответствует расширенному зрачку и состоит из уплощённых, неправильной полигональной формы, плотно прилегающих друг к другу клеток. Клетки содержат округлые ядра, окружённые широким ободком цитоплазмы. Митозы в клетках этой области практически отсутствуют, митотический индекс составляет 0,11 : 100 000. К периферии от центральной зоны размеры клеток несколько уменьшаются, за счёт чего они располагаются более густо. Эта зона носит название промежуточной и находится в хрусталике приблизительно напротив радужки. Митозы в ней встречаются несколько чаще — от одного до трёх на всю зону. На поверхности клеток располагаются десмосомы и многочисленные тонкие ультраструктурные пальцевидные выросты плазматических мембран, придающие клеткам необходимую при аккомодации эластичность, то есть соединения типа «замок». Между клетками эпителия хрусталика имеются простые и щелевые соединения, а также плотные контакты.
Кнаружи от промежуточной зоны клетки постепенно переходят в призматический цилиндрический эпителий экваториальной зоны, по наружному краю которой расположение клеток сменяется радиальными рядами волокнообразующего эпителия. Пространство между промежуточной зоной и волокнообразующим эпителием занимают клетки пояса высокой митотической активности, митотический индекс которых равен 60 : 100 000. Пояс высокой митотической активности также носит название приэкваториальной, или герминативной, зоны, поскольку за счёт образующихся в нём клеток и смещения их кнаружи, с одной стороны, происходит образование волокнообразующего эпителия, а с другой - из смещающихся кнутри — пополняется эпителий промежуточной зоны. Между герминативной зоной и волокнообразующим эпителием различают узкую переходную зону, в которой происходит перестройка метаболизма эпителиальных клеток и начинается их дифференцировка. Клетки удлиняются, их основания смещаются за экватор на заднюю капсулу, а вершины растут кпереди от экватора по направлению к переднему полюсу, клетки утрачивают ядро. Органоиды концентрируются в околоядерной зоне, их количество уменьшается.
Эпителиальные клетки капсулы хрусталика являются метаболически активными пролиферирующими клетками, которые выполняют функцию доставки питательных и регуляторных веществ к волокнистым клеткам ядра хрусталика [22, 53] (рис. 1).
Около 35 % массы хрусталика составляют белки, физико-химическое состояние которых во многом определяет его прозрачность. Впервые неоднородность состава белков была показана СТ. Мбгпег в 1894 году. Исследователь выделил среди белков водорастворимые а-, 3- и у-кристаллины, находящиеся в соотношении 37 : 62 : 1, и нерастворимый альбуминоид. В настоящее время выделяют два семейства кристаллинов: а-кристаллины и (Зу-кристаллины [47]. Помимо вышеперечисленных белков, в хрусталике присутствуют и другие протеины: гликопротеиды, располагающиеся в мембранах волокон и между волокнами, в капсуле и в эпителии; коллагеноподобные белки капсулы; рибо- и дезоксирибонуклеопротеиды, липопротеиды, фосфопротеиды, хромопротеиды. Также в хрусталике определяются гистоны, актин, виментин, коллаген, тубулин, белки, формирующие водные каналы - аквапорины (AQP0 и AQP1) [22].
Основными структурными белками хрусталика, влияющими на его прозрачность, являются а-, Р- и у-кристаллины, которые представляют собой мономеры с молекулярной массой 21 кДа [45, 78, 102, 145, 173]. Эти протеины образуют своеобразный гель и составляют около 90 % водорастворимых белков хрусталика [47, 70].
В эмбриональном периоде синтез специфических белков хрусталика — а- и р-кристаллинов начинается на стадии формирования хрусталиковой плакоды [22, 50, 105, 106, 136]. Известно две фракции а-кристаллинов - схА- и аВ-. Они определяются на ранних стадиях развития хрусталика, а их экспрессия существенно возрастает по мере дифференцировки волокон [47]. Исследования показывают, что в условиях in vivo в эмбриональном периоде аА-кристаллин предотвращает апоптоз, который имеет место на стадии формирования хрусталикового пузырька. Таким образом, а-кристаллины принимают участие в созревании и денуклеации первичных и вторичных волокнистых клеток, а также в ходе дифференцировки волокнистых клеток хрусталика [45]. у-кристаллин определяется позднее, на этапе дифференцировки волокнистых клеток [47]. Особенно широко представлена фракция yD-кристаллинов [159].
Получение экстрактов органов и тканей (экстракта гипофиза крысы, цилиарного тела кролика, глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона)
В экспериментальных условиях получали экстракты органов взрослой крысы, кролика, а также тканей глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона [50].
У взрослых здоровых лабораторных кроликов из глаза выделяли цилиарное тело. Гипофиз крысы получали после вскрытия черепной коробки и удаления головного мозга. Выделенные цилиарное тело и гипофиз отмывали в физиологическом растворе хлорида натрия. Экстракты глаз четырнадцатидневных куриных эмбрионов получали в стерильных условиях в параформалиновой камере. Поверхность скорлупы обрабатывали 70 % этиловым спиртом. Эмбрионы извлекали из яйца, промывали в 0,9 % стерильном растворе NaCl. Глазное яблоко выделяли после рассечения покровных тканей головы. Дальнейший ход получения экстрактов различных органов и тканей сходен.
Полученный материал гомогенизировали, разводили небольшим количеством физиологического раствора (1 объёмная часть тканей глаза / 1 объёмная часть физ. раствора) и трёхкратно подвергали замораживанию при температуре -20С и оттаиванию при 37С. Затем полученную жидкость центрифугировали (3000 об/мин) в течение 30 минут при комнатной температуре. Надосадочную жидкость разливали во флаконы. Готовые экстракты хранили при температуре -20С. Непосредственно перед использованием экстракты размораживали при комнатной температуре. В экспериментах применяли различные концентрации экстрактов, для чего полученный 100,00 % экстракт разводили соответствующим количеством 0,9 % стерильного раствора NaCl. Белок в экстракте глаза куриного эмбриона определяли микрометодом с реактивом Бенедикта [15]. Принцип метода: раствор белка в щелочной среде связывается с ионами меди, содержащимися в реактиве Бенедикта, и даёт продукт реакции фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка. Реактивы: - 6 % водный раствор гидроксида натрия NaOH; - реактив Бенедикта: а) 17,3 г цитрата натрия НООССН2-С(ОН)(СООН)-CtbCOONa и 10 г карбоната натрия Na2C03 растворяют в 50 мл дистиллированной воды при нагревании (не доводя до кипения). Раствор фильтруют и объём доводят до 85 мл дистиллированной водой. б) 1,73 г сульфата меди CuS04 растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Растворы а) и б) объединяют в общий объём, доводят до 100 мл дистиллированной водой. Ход определения: к 0,1 мл исследуемой жидкости добавляют 1,9 мл дистиллированной воды и 2,0 мл 6 % раствора NaOH. Раствор тщательно перемешивают и добавляют 0,2 мл реактива Бенедикта.
Встряхивают и через 15 минут фотометрируют на спектрофотометре СФ-46 в ультрафиолетовом свете при длине волны 330 нм против контроля на реактивы. Для построения калибровочного графика готовится ряд рабочих стандартных растворов альбумина с концентрациями 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 г/л. Рабочие стандарты обрабатываются как пробы экстрактов и по данным спектрофотометрирования строится калибровочный график. Содержание белка в исследуемой пробе определяют по калибровочному графику. Белковые фракции в экстрактах определяли методом электрофореза на бумаге по А.Е. Гурвичу [32]. Принцип метода: в молекулах белка содержатся как основные, так и кислые ионизируемые группы. Ионизация этих групп обусловливает свободный заряд молекул белка. Величина и знак заряда зависят от соотношения кислых и основных групп в белке, рН и ионной силы окружающего раствора. При пропускании постоянного электрического тока через смоченную буферным раствором полоску бумаги молекулы белка перемещаются к полюсу с противоположным зарядом. Скорость миграции пропорциональна величине свободного заряда и градиенту потенциала электрического поля. Реактивы: - мединаловый буфер, рН 7,6: мединал 11,5 г, дистиллированная вода до 1 л; - раствор для окраски электрофореграмм — раствор с сернокислым цинком для окраски бромфенол синим: бромфенол синий — 0,1 г, сернокислый цинк — 50 г, ледяная уксусная кислота — 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл; - раствор для отмывания электофореграмм от не связавшейся с белком краски — ледяная уксусная кислота - 20 мл, вода 980 мл; - раствор для элюции краски из окрашенных электрофореграмм - 0,01 н. раствор едкого натра NaOH. Ход определения: 1) Подготовка камеры для электрофореза. Камеру устанавливают горизонтально. Электродные кюветы наполняют буферным раствором до одинакового уровня и оба отделения каждой кюветы соединяют друг с другом при помощи полоски фильтровальной бумаги. Пластинки с электродами укрепляют на ванне. Из хроматографичекой бумаги вырезают полосы необходимого размера и простым карандашом отмечают место, на которое впоследствии будет наноситься экстракт (старт). Бумажные полосы закрепляют так, чтобы они были равномерно натянуты. Концы бумажных полос должны быть погружены в буферный раствор, налитый во внутреннее отделение электродных кювет. Прибор закрывают крышкой и дают бумажным полосам пропитаться буферным раствором, после чего крышку снова снимают и на заранее отмеченные участки бумаги наносят экстракт;
Влияние биологически активных веществ на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro
В литературе имеются сообщения о том, что на прозрачность хрусталика оказывают влияние биологически активные вещества, присутствующие во внутриглазной жидкости. Это обстоятельство послужило теоретической предпосылкой для проведения настоящего исследования [100, 109, 117, 131].
Описанные выше результаты экспериментов свидетельствуют, что прозрачность хрусталика в условиях in vitro в значительной степени зависит от функционирования водных каналов — аквапоринов эпителия капсулы. В этой связи представляется актуальным исследовать возможные механизмы регуляции активности аквапоринов хрусталика.
В работе в условиях in vitro было проведено изучение воздействия на водный гомеостаз хрусталика крысы вазопрессина, эстрогенов, а также компонентов ренин-ангиотензиновой системы (ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) и ангиотензин II). Ниже представлены результаты проведенных экспериментов.
В литературе вопрос гуморальной регуляции функции аквапоринов хрусталика (AQP0 и AQP1) освещен недостаточно широко. Однако доказано, что активность аквапорина 2 и аквапорина 4 (AQP2 и AQP4) собирательных трубочек почек находится под регуляторным влиянием вазопрессина.
Различные изоформы водных каналов имеют гомологичную биохимическую структуру [43, 73, 76, 87, 112, 125]. В этой связи представляется актуальным исследовать эффект вазопрессина на функционирование аквапоринов хрусталика в условиях in vitro. В первой серии экспериментов изучали влияние экстракта гипофиза крысы (источник вазопрессина) на состояние водного гомеостаза и прозрачность хрусталика.
Эксперименты были проведены in vitro на 124 изолированных хрусталиках взрослых здоровых лабораторных крыс обоего пола. Хрусталики культивировали в среде, содержащей различные концентрации экстракта гипофиза (0,02; 0,03; 0,04 и 0,05 %) по методике, описанной выше (экстракт был использован в качестве источника вазопрессина, поскольку из всего комплекса гормонов, синтезирующихся в гипофизе, вазопрессин является единственным активным эффектором, оказывающим непосредственное влияние на водный гомеостаз клетки). На протяжении всего периода инкубирования визуально оценивали прозрачность хрусталиков, используя разлинованную подложку, а также определяли изменение массы хрусталиков (ДМ, %) через одни сутки культивирования (табл. 7).
Добавление в культуральную среду экстракта гипофиза вызывает увеличение массы хрусталиков через одни сутки инкубирования от 5,0 % (концентрация экстракта гипофиза в среде 0,03 %) до 10,7 % (концентрация экстракта гипофиза в среде 0,02 %). В контрольной группе масса хрусталиков увеличивалась на 8,9 %. Статистически значимых различий между изменением массы хрусталиков, культивированных в физиологическом растворе (контрольная группа) и в среде, содержащей 0,05 % экстракт гипофиза, не установлено. Однако при культивировании хрусталиков в присутствии экстракта гипофиза в концентрации 0,03 и 0,04 %, отмечалось достоверно меньшее изменение массы, чем в контрольной группе, а в концентрации 0,02 % - на большую величину. Вероятно, различное изменение массы хрусталиков в рассматриваемых группах можно объяснить неодинаковой активацией функции аквапоринов хрусталика.
Прозрачность хрусталиков во всех опытных группах сохранялась в течение более длительного периода (полное помутнение — на 8 — 10 сутки), чем в контроле. Во второй серии экспериментов хрусталики (n = 93) культивировали в среде, содержащей различные концентрации синтетического аналога вазопрессина - десмопрессина ацетат (10 пг/мл, 25 пг/мл, 50 пг/мл) (табл. 8).
Добавление в культуральную среду синтетического аналога вазопрессина (десмопрессина ацетат) в различной концентрации [4] позволяет существенно продлить срок сохранения прозрачности хрусталиков. Также через одни сутки культивирования в опытных группах отмечается достоверно большее увеличение массы, чем в контроле. Этот факт можно объяснить тем, что вазопрессин увеличивает активность аквапоринов эпителия капсулы хрусталика (AQP1X влияя на показатели водного гомеостаза, а это, в свою очередь, позволяет сохранить прозрачность.
В ряде работ показано, что в структурах глаза экспрессируются все компоненты ренин-ангиотензиновой системы. Предполагается, что они участвуют в регуляции продукции внутриглазной жидкости. Возможно, локальная ренин-ангиотензиновая система оказывает воздействие на систему циркуляции жидкости в хрусталике [131].
Эксперименты были проведены in vitro на 55 изолированных хрусталиках взрослых здоровых лабораторных крыс обоего пола. В работе изучали влияние присутствия в среде 23 нМ каптоприла на состояние водного гомеостаза хрусталика. Указанная концентрация препарата вызывает 50 % блокаду ангиотензинпревращающего фермента [131]. Хрусталики второй группы культивировали в среде, содержащей 10 мкМ валсартана (высокоселективный блокатор ангиотензин II рецепторов подтипа ATi). Оценивались сроки формирования помутнения культивируемых хрусталиков и изменение их массы (ДМ, %) через одни сутки инкубирования (табл. 9).
Биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона
Экстракты из различных тканей используются многими исследователями для выделения биологически активных веществ. Например, I. Berczi et al. (2001) [50] получали экстракт из ткани селезёнки, лимфоидные элементы которой активно синтезируют пролактин. Исследователи гомогенизировали селезёнку крысы, полученный препарат трёхкратно подвергали замораживанию с последующим оттаиванием при 37С, центрифугировали, и в супернатанте радиоиммунным методом был определён пролактин. В ходе экспериментов нами был получен экстракт из глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона и исследованы некоторые его свойства. 14 день развития эмбриона курицы характеризуется тем, что в этот период в тканях присутствует комплекс биологически активных веществ, которые определяют высокий пролиферативный потенциал, миграционную способность и специфическую дифференцировку клеток. Очевидно, эти субстанции содержатся в экстракте эмбрионального глаза, придавая ему характерные биологические свойства. Ниже приведены некоторые биохимические и иммунологические свойства полученного экстракта глаза куриного эмбриона. Нами были проанализированы пробы экстракта эмбрионального глаза (п = 153). В экстракте эмбрионального глаза содержание белка составляет 2,84 ± 0,031 (М ± т) г/л. Белки в экстракте представлены коллагеном, актином, виментином, тубулином, гликопротеидами, липопротеидами, фосфопротеидами, хромопротеидами [2], а также кристаллинами -водорастворимыми белками хрусталика, которые обладают активностью шаперона, то есть регулируют метаболизм и функциональную активность других клеток.
Методом электрофореза на бумаге были выделены белковые фракции, входящие в состав экстракта глаза куриного эмбриона (n = 7) (рис. 9). При описании данных ниже приведены значения выборочного среднего арифметического М и ошибки средней арифметической m (М ± т). В экстракте определяются альбумины (14,413 ± 2,8854, %), а-глобулины (24,872 ± 3,3032, %), (3-глобулины (20,646 ± 1,7281, %) и у-глобулины (37,724 ± 4,7639, %). В двух пробах были обнаружены следы белков, относящихся к преальбуминам. Можно предположить, что в состав этой фракции входят кристаллины хрусталика, молекулярная масса которых составляет около 21 кДа. Анализ полученных экспериментальных данных показал, что на 14 день развития в глазу куриного эмбриона присутствуют субстанции, относящиеся к молекулам средней массы (МСМ). Уровень молекул средней массы в экстракте эмбрионального глаза составляет 4,7 ± 0,11 (М ± т). Молекулы средней массы представляют собой гетерогенную группу веществ разнообразной структуры с молекулярной массой от 300 до 5 000 D. К настоящему времени установлено, что в состав молекул средней массы входят простые и сложные пептиды, гликопептиды, нуклеопептиды, гуморальные регуляторы (инсулин, глюкагон, различные факторы роста, «тропины» и их комплексы), некоторые витамины, олигосахариды, производные глюкуроновых кислот, спиртов [13].
По современным представлениям, МСМ являются показателем, не только отражающим уровень патологического белкового метаболизма, но и характеризующим присутствие биорегуляторов. Доказаны антиоксидантные, иммуностимулирующие и стресспротективные свойства МСМ [5, 21, 31]. Вероятно, определённые в ходе нашей работы молекулы средней массы в эмбриональном экстракте являются представителями субстанций, являющихся регуляторами морфогенеза. 3.6.4. Значение рН экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона рН является одной из основных характеристик гуморальной среды организма. Постоянство рН обеспечивает оптимальную работу ферментных систем. Концентрация ионов водорода влияет на проницаемость клеточных мембран. Поэтому нам представляется важным определить рН экстракта эмбрионального глаза.
Полученные нами экстракты куриного эмбрионального глаза имеют значение рН (М ± т) 7,42 ±0,015. В работе была определена желатиназная активность глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона. В качестве контроля использовали ткань печени взрослой здоровой крысы. В наших исследованиях активность желатиназной активности печени взрослой крысы составляет 15,5. Глаз четырнадцатидневного куриного эмбриона желатиназной активностью не обладает. Рисунки 10 - 11 демонстрируют желатиназную активность глаза куриного эмбриона, а также печени взрослой крысы (контроль). Желатиназа является ферментом, относящимся к группе матриксных металлопротеиназ. Матриксные металлопротеиназы представляют собой цинксодержащие протеазы, способные к специфическому гидролизу всех основных белков экстрацеллюлярного матрикса. Они участвуют в процессе роста, развития и ремоделирования тканей. Согласно нашим исследованиям, желатиназа в структурах глаза куриного эмбриона не определяется, что, вероятно, связано с тем, что в данный период развития (14 день) процессы тканевой перестройки выражены незначительно.
