Введение к работе
Актуальность проблемы. Идиопатический фиброз лёгкого (ИФЛ) является хроническим прогрессирующим заболеванием неизвестной этиологии. Прогноз ИФЛ в большинстве своём неблагоприятный, состояние пациентов ухудшается быстрыми темпами. Продолжительность жизни с момента постановки диагноза составляет от 2 до 4 лет. Существующий набор лечебных мероприятий для лёгочного фиброза ограничен и не эффективен. Клиническая практика сосредоточена преимущественно на лечении осложнений и поддерживающей терапии [Khalil N. et al., 2004; Horowitz J.C. et al, 2006; Kim D.S. et al, 2006; Meltzer E.B. et al, 2008].
В последнее время огромное внимание уделяется такому направлению лечения, как терапия стволовыми клетками (СК) [Siniscalco D. et al., 2008; Uccelli A. et al, 2008]. Трансплантация гемопоэтических СК (ГСК) используется для лечения Т-клеточного лейкоза у взрослых, лимфомы, множественной миеломы и др. Известны случаи лечения донорскими мезенхимальными СК (МСК) нейродегенеративных и гастроинтерстициальных заболеваний, инфарктов и инсультов, лейкозов, лимфом, реакции «трансплант против хозяина», диабета, костных (хрящевых) заболеваний [Trounson A., et al., 2011]. Клеточная терапия с использованием СК мезенхимального происхождения рассматривается как перспективный подход лечения хронических заболеваний лёгких, в том числе, лёгочного фиброза [Ortiz L.A. et al, 2003; Loebinger M.R. et al, 2008; Siniscalco D. et al, 2008; Moodley Y. et al, 2009; Shukla M.N. et al, 2009].
Помимо лечебных эффектов донорские СК оказывают неспецифическое иммуносупрессивное действие. У пациентов, получающих МСК-терапию, повышается риск развития вирусных, грибковых и бактериальных инфекционных заболеваний, аллергических реакций [Benjamin D.K. et al, 2002; Engelhard D. et al, 2002]. Возможен рецидив лейкоза в связи с ослаблением реакции «трансплантат против лейкоза» [Horowitz М. М. et al., 1990]. В клинике для клеточной терапии применяются прекультивированные мононукле-ары. В некоторых случаях это может привести к изменению фенотипа и функций СК [Banfi A. et al, 2000; 2002], в том числе, приобретению неопластических свойств [Lalu М.М. et al., 2012]. Выделенные из костного мозга реципиентов МСК в различные сроки после трансплантации демонстрируют черты частичного, а чаще, полного химеризма [Lee S.T. et al., 2002; Le Blanc К. et al., 2007]. Существуют данные о достаточно большой вариабельности иммуномодулирующих свойств МСК [Tse W.T. et al., 2003]. Ряд авторов придерживается мнения, что эффекты трансплантированных МСК связаны с па-ракринными механизмами [Kang S.K. et al., 2012]. В этой связи можно говорить о том, что при клеточной терапии донорские МСК не реализуют свой регенераторный потенциал.
До настоящего времени не ясно, с какими из СК связаны лечебные эффекты клеточной терапии. Отдельно взятые клоны МСК отличаются друг от друга по экспрессии генов, фенотипу, способности к дифференцировке и экспансии [Muraglia A. et al., 2000; Tremain N. et al., 2001]. Такая нестабильность эффектов клеточной терапии, отсутствие стандартизированных и эф-
фективных методов получения достаточного количества клеточного материала с заданными свойствами для трансплантации выступают серьёзным препятствием для развития терапии СК [Garcia-Castro J. et al, 2008]. Есть сомнения в том, что индуцированные донорские плюрипотентные СК взрослого организма эквивалентны эмбриональным СК по свойствам [Robinton D.A. et al., 2012]. Вышеизложенные негативные эффекты трансплантации предопределили поиск новых подходов лечения стволовыми клетками.
Практически во всех органах и тканях существуют так называемые регионарные СК (РСК) [Meirelles L.S. et al, 2006; Prunet-Marcassus В. et al., 2006; Krampera M. et al., 2007]. Фармакологическая модуляция функций РСК может явиться более безопасным методом лечения многих хронических заболеваний по сравнению с трансплантацией СК. Однако на сегодняшний день роль РСК различных тканей и органов в патогенезе хронических заболеваний и процессах регенерации остаётся малоизученной. Это затрудняет разработку тактики медикаментозного лечения с использованием средств, модулирующих функции эндогенных СК взрослого организма.
Ряд исследователей связывают синтез коллагеновых волокон в лёгких с активностью адренергической системы [Berg R.A. et al., 1981; Giri S.N. et al., 1987]. Островки нейроэндокринных клеток ткани легких секретируют биогенные амины и пептиды, регулирующие рост эпителиоцитов в норме и при патологии [Polak J.M. et al, 1993; Lauweryns J.M. et al.,1997; Reynolds S.D. et al., 2000]. Исходя из этого, возникло предположение о том, что соединения, модулирующие активность адренергической системы, могут влиять на фиб-рогенез в лёгких.
Принимая во внимание вышеизложенное, представляет несомненный интерес изучение роли костномозговых и регионарных СК, а также прогениторных клеток гемо- и мезенхимопоэза в патогенезе токсического пневмофиброза. Исследование актуально и с той точки зрения, что оно позволит оценить целесообразность коррекции фиброгенеза симпато литиком.
Цель исследования. Изучить роль эндогенных стволовых и прогениторных клеток различных классов взрослого организма в развитии пневмофиброза. Дать патогенетическую оценку целесообразности применения сим-патолитика в коррекции фиброзного заболевания лёгких.
Задачи исследования:
-
Изучить состояние гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток в условиях блеомицин-индуцированного пневмофиброза.
-
Оценить функциональную активность костномозговых и регионарных мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток при фиброзе лёгких.
-
В условиях введения блеомицина исследовать возможность коррекции резерпином воспалительной реакции и фиброгенеза в лёгких.
-
Изучить действие резерпина на костномозговые и регионарные стволовые и прогениторные клетки гемо- и мезенхимопоэза при пневмофиброзе.
Научная новизна работы. В работе изучена роль эндогенных стволовых и прогениторных клеток гемопоэтического и мезенхимального происхождения взрослого организма в развитии блеомицин-индуцированного воспаления и фиброгенеза в лёгких у мышей линии C57BL/6. Продемонстрировано, что одновременно с инфильтрацией интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками (лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги и нейтрофилы) отмечается лейкоцитоз в периферической крови и гиперплазия костномозгового гемопоэза. Причиной системного увеличения количества морфологически распознаваемых гемопоэтических клеток (костный мозг, кровь, лёгкие) выступает стимуляция ГСК (Lin~, Sca-1+, c-Kit+, CD34") и прогениторных С045+-клеток (формирующих гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные, гранулоцитарные и эритро-идные колонии) костномозгового происхождения с последующей их мобилизацией в кровь. Фибротическая фаза пневмофиброза характеризуется экспансией лёгких прогениторными С045"-клетками с высокой клональной активностью (образование фибробластных колоний) и МСК (CD31~, CD34", CD45", CD44+, CD73+, CD90+, CD106+), интенсивно дифференцирующимися в фиб-робластные клетки. Кроме этого, в костном мозге и крови выявлено существенное повышение числа фибробластных предшественников и прилипающих к пластику клеток, демонстрирующих МСК-подобный фенотип.
Показано, что в условиях введения блеомицина симпатолитик резерпин снижает интенсивность деструктивных процессов в лёгких мышей, уменьшает инфильтрацию интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками и интенсивность отложения коллагеновых волокон в паренхиме.
Выявлено влияние резерпина на гемопоэтические и мезенхимальные стволовые и прогениторные клетки при пневмофиброзе. В фазу воспаления симпатолитик уменьшает количество костномозговых и циркулирующих в крови колониеобразующих единиц (КОЕ) гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного и гранулоцитарного типа, снижает функциональную активность (дифференцировку в прогениторные гранулоцитарные клетки) ГСК костного мозга. В фазу интенсивного отложения коллагеновых волокон в паренхиме лёгких резерпин угнетает дифференцировку лёгочных МСК в направлении фибробластоподобных клеток и понижает клональную активность прогениторных С045~-клеток в костном мозге, крови и лёгких.
Практическое значение работы. Продемонстрирована реакция морфологически распознаваемых клеток периферической крови и костного мозга в условиях интратрахеального введения блеомицина. Определена роль эндогенных СК и прогениторных клеток гемо- и мезенхимопоэза взрослого организма в патогенезе пневмофиброза. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание клеточных механизмов индукции и развития воспалительной реакции в интерстиции легких, а также фиброгенеза и могут слу-
жить основой для создания новых более эффективных методов диагностики и терапии ИФЛ.
Материалы исследования эффектов и механизмов действия симпатоли-тика резерпина можно использовать при разработке нового метода терапии ИФЛ стволовыми клетками, основанного на избирательной модуляции функций эндогенных стволовых и прогениторных клеток взрослого организма с помощью нейро-фармакологических агентов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 5th International Conference on Drag Discovery & Therapy (Dubai, 2013), 6th Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell (Dalian, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 1 статья в иностранном журнале и 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Получен 1 патент (RU) на изобретение № 2479312 «Средство, обладающее противовоспалительным и антифибротическим действием в лёгочной ткани при ци-тостатическом воздействии» (опубл. 20.04.2013, Бюл. №11).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками, 12 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 341 источника, из них 27 отечественных и 314 зарубежных.
