Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Роль свободнорадикальных процессов при перитоните 10
1.2. Использование антисептических средств при перитоните в эксперименте и клинике 20
ГЛАВА 2. Материалы и методы 29
2.1. Характеристика экспериментальных групп и методика исследования 29
2.2. Биохимические методы исследования показателей системы «ПОЛ-антиоксиданты» 32
2.3. Гистологические и морфометрические исследования 40
2.4. Микробиологическое исследование 42
2.5. Оборудование и аппаратура 42
2.6. Математическая обработка результатов 43
ГЛАВА 3. Закономерности изменений перекисного статуса и морфологических особенностей брюшины при экспериментальном перитоните 44
3.1. Динамика показателей системы «ПОЛ-антиоксиданты» брюшины животных контрольной группы и при перитоните 44
3.2. Морфологические изменения тканей брюшиной полости в динамике перитонита 50
ГЛАВА 4. Закономерности изменений перекисного статуса и морфологических данных брюшины у животных с экспериментальным перитонитом при санации брюшной полости различными растворами антисептиков 59
4.1. Состояние липопероксидации и антиокислительной защиты брюшины животных с перитонитом при различных способах санации брюшной полости 59
4.2. Доказательная база положительного эффекта гипохлорита натрия при экспериментальном перитоните 71
4.3. Морфологические изменения ткани брюшины животных опытных групп при различных вариантах санации 77
Заключение 98
Выводы 103
Практические рекомендации 104
Список литературы
- Использование антисептических средств при перитоните в эксперименте и клинике
- Гистологические и морфометрические исследования
- Морфологические изменения тканей брюшиной полости в динамике перитонита
- Доказательная база положительного эффекта гипохлорита натрия при экспериментальном перитоните
Использование антисептических средств при перитоните в эксперименте и клинике
В настоящее время успех лечения вторичного распространенного перитонита определяют три основных постулата: 1) оптимальная хирургическая тактика; 2) рациональная антибактериальная терапия; 3) адекватная интенсивная терапия [155]. Анализ литературы показывает, что положительный результат лечения больных с распространенным перитонитом на 80% зависит от оптимальной хирургической тактики и в первую очередь, от адекватной санации брюшной полости, и лишь на 20% — от антибактериальной и интенсивной терапии [130, 182, 184, 187, 205, 206, 208]. Основными задачами оперативного вмешательства являются: 1) устранение источника перитонита; 2) интраоперационная санация; 3) декомпрессия паретичного кишечника; 4) создание условий для пролонгированной санации брюшной полости в послеоперационном периоде [155].
По данным Б.К. Шуркалина и соавт. (2007) выялены преимущества и недостатки способов хирургического вмешательства при перитоните. Установлено, что дренирование брюшной полости не способно адекватно её санировать. Недостатки перитонеального лаважа превышают его клиническую ценность. Авторы продемонстрировали использование лапаростомии и программированных ревизий и санаций брюшной полости. При условии соблюдения строгих показаний эти методики обеспечивают выздоровление свыше 80% пациентов с распространенным перитонитом. Лапароскопическая санация позволяет эффективно воздействовать на инфекционный процесс только при бактериальной контаминации перитонеального экссудата, не превышающей 105 мб/г [155].
Так В.К. Гостищев и соавт. (2007) применяли лечебные бактериофаги у пациентов с распространенным гнойным перитонитом при многократных этапных санациях брюшной полости и выявили высокую чувствительность к ним четырех нозокомиальных штаммов бактерий. Использованные фаговые препараты позволили полностью предупредить присоединение внутриболь-ничных штаммов при длительном течении перитонита. Активность всех фаговых препаратов in vitro значительно превосходила чувствительность к антибактериальным препаратам [147]. А.А. Глухов и соавт. (2009) предложили метод видеолапароскопической гидропрессивной санации брюшной полости при остром перитоните, основанный на обработке париетальной и висцеральной брюшины микродисперсными потоками антисептического раствора. Сформулированы показания и противопоказания для применения метода [121]. Ю.С. Винник и Д.Э. Здзитовецкий (2011) использовали постоянный трансмембранный перитонеальный диализ у больных распространенным перитонитом при «полузакрытом» ведении брюшной полости. Метод основан на диффузионно-разделительных свойствах полупроницаемых мембран. Применение данной технологии позволило авторам в более ранние сроки купировать синдром эндогенной интоксикации у больных и снизить абсолютный риск развития послеоперационных осложнений [24].
Другие исследователи занимались изучением эффективности нового метода санации брюшной полости при остром распространенном перитоните, основанного на сочетанном использовании свойств гипо- и гипертермических рабочих растворов [41]. Выбор направления был обусловлен тем, что температурный фактор определяет многие физико-химические свойства, а следовательно, и биологические эффекты используемых для санации растворов. Было выявлено, что интенсивность перекисного окисления липидов в большей степени возросла после санации брюшной полости интактных животных с использованием гипертермических растворов. Реакция антиоксидантной системы в данных условиях характеризовалась направленностью на стабилизацию свободнорадикального статуса, что подтверждалось увеличением активности каталазы. При морфологическом исследовании стенки тонкой кишки через сутки после гипертермической санации отмечено полнокровие сосудов, мелкие фокусы кровоизлияний, после гипотермической обработки, наряду с вышеописанными изменениями, выявлена лимфо- и плазмоцитарная инфильтрация. На 7-е сутки эксперимента после использования раствора с температурой 12 С обнаружены остаточные проявления кровоизлияний. Десквамации мезотелия с поверхности брюшины ни в одном случае отмечено не было [41]. Исследования влияния температурного режима санации на течение острого перитонита позволили установить, что проведение санации брюшной полости в гипертермическом режиме сопровождалось значительным повышением интенсивности ПОЛ в раннем постсанационном периоде. В 1-й опытной группе содержание МДА спустя 12 ч после санации превышало норму почти в 2 раза. Менее значимое повышение интенсивности ПОЛ при использовании гипотермического раствора обусловило уменьшение нагрузки на антиоксидантную систему, в результате чего активность каталазы к концу эксперимента почти не снижалась. Авторы делают вывод о том, что обработка брюшной полости в гетеротермическом режиме в эксперименте у здоровых животных не приводит к необратимым изменениям гомеостаза организма. Применение метода санации брюшной полости в гетеротермическом режиме у животных с острым перитонитом позволяет повысить эффективность лечения, ускорить динамику снижения микробной обсемененности брюшной полости, существенно снизить степень выраженности постсанационной интоксикации, что в совокупности способствует сокращению количества осложнений и летальных исходов [41].
Проблема инфекции в клинической практике, особенно в хирургии, приобретает все большую актуальность в связи со значительным числом послеоперационных осложнений, обусловленных быстрым ростом и появлением новых антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов, а также снижением общей и местной иммунологической реактивности организма. В процессе поиска эффективного и универсального детоксици-рующего и дезинфицирующего агента внимание исследователей привлекает гипохлорит натрия [3, 13, 14, 27, 28, 38, 92, 98, 102, 113, 121, 122, 140, 143, 156, 157].
Бактерицидные свойства хлорноватистой кислоты, солью которой является гипохлорит, известны давно, поэтому она широко применяется как обеззараживающее и дезинфицирующее средство, например, при хлорировании воды. Однако для клинических целей соли хлорноватистой кислоты не применялись, так как выпускаемые промышленностью препараты имели значительное количество примесей и избыточное содержание ионов хлора [98, 156]. Доказано отсутствие аллергических и токсических свойств раствора ГХН в концентрациях от 0,5 до 2,5 г/л при внутривенном, внутримышечном, внутрибрюшном, подкожном и пероральном их введении, полное отсутствие канцерогенности в опытах на беспородных белых мышах [38, 156]. Обнаружено, что аскорбиновая и мочевая кислота эффективно реагируют с гипохлоритом, выступая в роли его физиологических ловушек и защищая компоненты крови от его окислительного воздействия [98, 156].
Гистологические и морфометрические исследования
В супернатанте изучены следующие показатели: величины веществ с изолированными двойными связями, диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ) [135], уровень соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [5, 32], концентрация оснований Шиффа [73], активности супероксиддисмутазы [21], каталазы [97], глутатионперок-сидазы [103], глутатионредуктазы [21, 99] и общей антиокислительной активности (АОА) [123].
В основу определения диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, а также веществ с изолированными двойными связями в супернатанте положен метод И.А. Волчегорского и соавт. (1989) [135]. Реактивы: смесь гептан-изопропанол (1:1 по объёму), смесь гептан-изопропанол (3:7 по объёму), соляная кислота (рН = 2.0), хлорид натрия (х.ч).
Ход определения: 0,5 мл супернатанта экстрагировали 5 мл смеси гептан-изопропанол (соотношение 1:1) при встряхивании в закрытых пробирках в течение 15 минут. После центрифугирования при 10 000 об/мин полученные вытяжки разбавляли 3 мл смеси гептан-изопропанол (соотношение 3:7) с целью достижения оптимальных объемов и значений оптической плотности в обеих фазах экстракта. К разбавленным липидным вытяжкам приливали водный раствор НСІ в объёме 2 мл для разделения фаз и отмывки от нелипидных примесей. После разделения гептановую фазу отбирали в отдельную сухую пробирку, а к водно-спиртовой добавляли 1 г порошка NaCI для обезвоживания изопропанольного экстракта. После отделения водной фазы изопропанол переносили в отдельную пробирку. Оптические контроли готовили параллельно выше описанным способом, используя вместо биологического материала бидистиллированную воду. Оптическую плотность измеряли в изопропанольной фазе против соответствующего контроля при 220 нм (поглащение изолированных двойных связей), при 232 нм (поглощение диеновых конъюгатов - первичных продуктов ПОЛ) и 278 нм (поглощение кетодиенов и сопряженных триенов - вторичных продуктов ПОЛ). Расчёт содержания продуктов свободнорадикального окисления липидов проводили по формуле:
Уровень продуктов перекисного окисления липидов в биологическом материале выражали на миллиграмм общих липидов супернатанта. Так же рассчитывали содержание продуктов липопероксидации по отношению 232/220 И i 278/220 L - J Для изучения уровня промежуточных интермедиатов свободнорадикального окисления липидов использовали широко применяемый тест с тиобарбитуровой кислотой [5, 32].
Реактивы: 0,6% раствор тиобарбитуровой кислоты (готовится ех tempore путем растворения 0,6 г ТБК в 100 мл дистиллированной воды), 1% раствор ортофосфорной кислоты, 0,1 мл сернокислого железа [5, 32].
Ход определения: к 0,3 мл супернатанта прибавляли 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% раствора ТБК и 0,1 мл раствора сернокислого железа (28 мг FeS04 х 7Н2О2 в 10 мл дистиллированной воды), как правило, рН такой смеси равен 1,8 - 2,0, то есть, оптимален для реакции. Пробирки закрывали притертыми стеклянными пробками и ставили в кипящую водяную баню на 1 час. Затем пробирки охлаждали в холодной воде, добавляли 4 мл н-бутанола, тщательно перемешивали, центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин и измеряли экстинкцию в бутаноловом слое пробы против бутанола при длине волны 535 нм. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, производили с учетом коэффициента молярной экстинкции малонового диальдегида, равного 1,56 х 105 мольхсм"1 [5, 32]. Определение содержания оснований Шиффа в супернатанте [73]. Супернатант экстрагируют методом Фолча, добавляя к 1 объему су-пернатанта 10 объемов реактива Фолча (хлороформ, метанол в соотношении 2:1). Фильтруют в мерный цилиндр через обеззоленный и обезжиренный фильтр. Объем доводят до изначального (2 мл) реактивом Фолча, добавляют 2 мл 0,73% раствора хлорида натрия и отстаивают в темном месте в течении 24 часов. Затем удаляют верхнюю фазу. Нижнюю фазу переносят в химически чистую колбу и выпаривают на роторном испарители. К сухому остатку добавляют 100 мкл хлороформа, 20 мкл забирают в отдельную чистую пробирку для определения концентрации общих липидов, добавляю 3 мл хлороформа и измеряют уровень оснований Шиффа [73].
Уровень оснований Шиффа определяют по интенсивности флуоресценции в хлороформных экстрактах супернатанта и надосадочной жидкости при волне возбуждения 342 нм и волне эмиссии 413 нм и выражают на мг липидов ткани [73].
Величины общей антиокислительной активности определяли по методу М.Ш. Промислова и соавт. (1990) [123].
Реактивы: раствор субстрата окисления (у-линонолевая кислота), 15% трихлоруксусная кислота (ТХУ), раствор FeSo4, 0,6% ТБК (готовится ех tempore), 1 мкмоль сернокислого железа.
Ход определения: в пробирки вносили по 0,5 мл субстрата и 0,5 мл супернатанта. Затем во все пробирки вносили 50 мкл сернокислого железа и проводили инкубацию в термостате при температуре 37С на 30 минут. После добавления 0,3 мл 15% раствора трихлоруксусной кислоты проводили центрифугирование пробирок в течение 5 минут. После осаждения белка брали из каждой пробирки по 0,5 мл и переносили в другие пробирки, куда добавляли 0,5 мл тиобарбитуровой кислоты, закрывали пробкой и помещали в водяную баню при температуре 100С на 30 минут.
Морфологические изменения тканей брюшиной полости в динамике перитонита
При изучении антиокислительной защиты (таблица 13) на 1 сутки выявлено снижение активности глутатионпероксидазы, каталазы в среднем на 61% (р=0,045; р=0,010) по отношению к 3-й опытной группе. Кроме того, наблюдалось уменьшение скорости глутатионпероксидазной реакции в 1,5 раза (р=0,029), с ростом показателя глутатионредуктазы в 1,6 раза (р=0,013) по сравнению с группой перитонита. На этом фоне отмечалось снижение общей антиокислительной активности в среднем в 1,6 раза (р=0,001) относительно группе перитонита и 3-й опытной группе. На 3-й сутки зафиксировано снижение активности всех изучаемых ферментов в среднем в 1,8 раза (р=0,012; р=0,015; р=0,038; р=0,015), а на 7-е сутки в среднем в 3,2 раза (р=0,049; р=0,025; р=0,003; р=0,006) по сравнению с 3-й опытной группой. Кроме того, обнаружено снижение общей АОА на 7-е сутки в среднем на 40% (р=0,002; р=0,037) по отношению к группе перитонита и 3-й опытной группе (таблица 13).
Таким образом, промывание брюшной полости 0,9% раствором хлорида натрия практически не изменяет перекисный статус, присущий животным с перитонитом и характеризуется накоплением конечных продуктов ПОЛ и угнетением ферментативного звена, в особенности глутатионпероксидазы и общей антиокислительной активности. Другими словами сама процедура санации существенно не влияет на состояние процессов липопероксидации в брюшине.
В 4-й опытной группе после санации брюшной полости 0,09% раствором ГХН и витамином С при перитоните на 1 сутки зарегистрировано снижение концентрации субстратов в 1,1 раза (р=0,023), диеновых конъюга-тов в 1,4 раза (р=0,010), ТБК-активных продуктов в 1,4 раза (р=0,01) и оснований Шиффа в 1,7 раза (р=0,001) по отношению к перитониту (таблица 14).
На 3 сутки отмечалось снижение коэффициента с278/220 на 12/о (р=0,014) по сравнению с 3-й опытной группой (таблица 14).
К 7 суткам зафиксирован рост уровня субстратов и диеновых конъюга-тов в среднем на 49% (р=0,044) относительно 3-й опытной группы. Кроме того, наблюдалось снижение содержания ТБК-активных продуктов и оснований Шиффа в среднем в 1,4 раза (р=0,021; р=0,013) по сравнению с перитонитом, а также величины первых были значимо ниже таковых у животных с 0,09% ГХН (таблица 14). Таблица 14 Динамика показателей липопероксидации брюшины при перитоните после санации 0,09% ГХН и 0,09% ГХН+5% р-р аскорбиновой При исследовании ферментативного звена на 1 сутки обнаружено повышение активности всех ферментов: СОД и ГПО в среднем в 1,5 раза (р=0,011; р=0,001), каталазы в 6,3 раза (р=0,001), глутатионредуктазы в 2,2 раза (р=0,001) по отношению к группе перитонита (таблица 15).
Таблица 15 Динамика параметров антиоксидантной защиты брюшины при перитоните после санации 0,09% и 0,09% ГХН+5% р-р аскорбиновой кислоты;
При этом в данный период скорость каталазной реакции была более чем в 3 раза выше, чем в третьей опытной группе. Также выявлен рост общей АОА в 1,3 раза (р=0,009) по сравнению с перитонитом. На 3-й сутки выявлено снижение цифр ГПО на 60% (р=0,004) относительно 3-й опытной группы. К седьмым суткам эксперимента отмечалось повышение всех ферментативных показателей в среднем в 2,6 раза (р=0,011; р=0,006; р=0,006; р=0,016) по сравнению с перитонитом (таблица 15).
Таким образом, обработка брюшной полости 0,09% раствором ГХН с последующим орошением 5% раствором аскорбиновой кислоты приводит к снижению на 7 сутки ТБК-активных продуктов, оснований Шиффа и повышению активности всех антиоксидантных ферментов и АОА относительно группы перитонита. Кроме того, необходимо отметить, что в 4 опытной группе обнаружено повышение активации каталазы на 1 сутки и снижение концентрации промежуточных интермедиатов продуктов ПОЛ к концу недели по сравнению с 3-й опытной группой (орошение брюшной полости 0,09% раствором ГХН при перитоните).
4.3. Морфологические изменения ткани брюшины животных опытных групп при различных вариантах санации
В группах экспериментального перитонита отмечались признаки пареза кишечника: увеличение диаметра кишки в 1,5 и более раз, в просвете наличие жидкости и газа. К 7 суткам наблюдалось увеличение вертикальных размеров печени в группе перитонита - 51,4% случаев, в 1-й опытной группе - 60,9% случаев, во 2-й - 48%, в 3-й опытной группе у 48% животных, в 4-й опытной группе - 42,9%, в 1-й группе сравнения - 53,6% и во 2-й группе сравнения в 23,1% случаев.
В 1-й опытной группе крыс при гистологическом исследовании на 1 сутки эксперимента в тонкой кишке в подслизистом и мышечном слоях обнаружены участки микроабсцедирования. Серозная оболочка утолщена, мезотелий местами отсутствует, клетки из плоских преобразовались в вытянутые (кубические, высокопризматические), располагаются в виде «цепочки» (рисунок 13).
Срез тонкого кишечника крысы 1-й опытной группы на 1 сутки (препарат 9-15). Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х400. Стрелкой указано слущивание мезотелия
На 3-й сутки выявлен отек стенки тонкой кишки. Обнаружено наличие сегментарной гангрены, по периферии зоны некроза - демаркационное воспаление. Брюшина утолщена, с массивными наложениями фибрина, с его организацией (рисунок 14).
На 7-е сутки эксперимента гнойное воспаление менее выражено, слизистая с множественными поверхностными микроэрозиями. Сосуды подлежащих слоев полнокровны с множественными очаговыми кровоизлияниями. Брюшина с микробными колониями, резко утолщена за счет образования грануляционной ткани (рисунок 15).
Доказательная база положительного эффекта гипохлорита натрия при экспериментальном перитоните
Проведенное изучение морфологического состояния брюшины при перитоните выявило существенные патологические изменения. На 1 сутки обнаружен гнойный перитонит, со сменой экссудативных явлений продуктивными на 3 сутки эксперимента [106]. При исследовании бактериальных посевов из брюшной полости на 1 сутки превалировали энтеробактерии и кокковая флора. Вероятно, в результате повышения адаптационных особенностей животных и иммуностимулирующих свойств нормофлоры (лакто- и бифидобактерий) к 7 суткам отмечено снижение количества условно-патогенных микроорганизмов [100].
Использование традиционных растворов (0,9% р-р натрия хлорида) для промывания полости живота при перитоните вызвало накопление вторичных продуктов ПОЛ, а к 7-му дню угнетение ферментативного звена, в особенности глутатионпероксидазы и общей антиокислительной активности. В тоже время отмечены морфологические изменения слизистой оболочки тонкого кишечника в виде отека и частичной десквамации, мышечный слой разволокнен за счет отека. Стенка с неравномерной диффузной лейкоцитарной инфильтрацией. Брюшинный покров частично десквамирован, на его поверхности - фибринозно-гнойные наложения. По-видимому, все изменения обусловлены прогрессированием местной воспалительной реакции, связанной с недостаточным антимикробным действием 0,9% раствора натрия хлорида.
После воздействия 0,09% раствора гипохлорита натрия на интактную брюшину при морфологическом исследовании обнаружен отек тонкого кишечника с полнокровными сосудами и очаговыми кровоизлияниями. Серозная оболочка имеет фибринозные наложения, разрыхляется, клетки вакуолизируются и слущиваются. К 7-м суткам брюшина утолщена, отечна, со слущиванием клеток мезотелия. Вероятнее всего агрессивность раствора направлена на здоровые ткани органов брюшной полости, что вызвало слущивание клеток мезотелия и наложение единичных нитей фибрина [106].
В 1-й и 2-й опытных группах (обработка брюшной полости 0,02% и 0,045% раствором гипохлорита натрия соответственно) так же не обнаружено положительной динамики биохимических и морфологических показателей. Использование 0,02% раствора гипохлорита натрия практически не влияло на перекисный статус брюшины и, кроме того, прослеживалась тенденция к росту промежуточных и конечных интермедиатов ПОЛ на фоне подавления факторов антирадикальной защиты. Применение 0,045% раствора ГХН способствовало росту показателей ПОЛ к 7 суткам и снижению скорости супероксиддисмутазной, каталазной, глутатионредуктазной реакций и общей антиокислительной активности [30, 75]. Это свидетельствует о том, что данные концентрации гипохлорита натрия не достаточны по антимикробному действию и не позволяют качественно очистить полость живота при перитоните.
После санации брюшной полости при перитоните 0,09% раствором гипохлорита натрия на 1 сутки выявлено снижение ТБК-активных продуктов и оснований Шиффа. Активность всех изучаемых ферментов повышалась к 7-м суткам относительно перитонита. Кроме того, наблюдалось максимальное снижение доли фибрина на 1-3 сутки по сравнению с перитонитом, а к 7 суткам эти отличия также носили статистически значимый характер [30, 75]. Морфологически обнаружено вторичное повреждение клеток брюшинного покрова, незначительное наложение фибрина, что подтверждает вероятность влияния 0,09% раствора гипохлорита натрия преимущественно на больные клетки и органы брюшной полости [106].
В отличие от обработки полости живота только 0,09% раствором ГХН, при последовательном промывании 0,09% раствором гипохлорита натрия и
102 5% раствором аскорбиновой кислоты (4-я опытная группа) - к 7-м суткам зарегистрировано снижение уровня вторичных и третичных продуктов ПОЛ и рост активности всех изучаемых ферментов. При морфологическом исследовании обнаружено частичное слущивание клеток мезотелия и наложение единичных нитей фибрина. Данный факт предположительно связан с воздействием как 0,09% раствора гипохлорита натрия на пораженные ткани и органы живота [106], так и антиоксидантним действием аскорбиновой кислоты.
Таким образом, обработка брюшной полости при перитоните 0,09% раствором гипохлорита натрия является оптимальным вариантом санации. Кроме того, совместное применение 0,09% раствора ГХН с последующим орошением полости живота 5% раствором аскорбиновой кислоты оказывает положительное влияние на структурно-фунциональное состояние тканей брюшиной полости, что в дальнейшем приведет к сокращению числа и тяжести осложнений в послеоперационном периоде.
