Введение к работе
(экспериментальное исследование)
14.03.03 - патологическая физиология
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1^ НОЯ 2012
Иркутск-2012
Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Научный руководитель:
доктор биологических наук Дубровина Валентина Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Попкова София Марковна
(ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и экологии человека» СО РАМН, заведующая лабораторией микроэкологии)
доктор медицинских наук, профессор Бодиенкова Галина Михайловна
(Ангарский филиал ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН — Научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека, заведующая лабораторией иммунологических исследований)
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Научно-исследовательский институт клинической иммунологии»
Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Защита состоится «^ » /C&t^w^r 2012 г. в часов на заседании дис
сертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном
учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003,
г. Иркутск, ул. Тимирязева. 16.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Федерального государственного бюджетного учреждения
«Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.
Автореферат разослан « &ty> /^^^1 2012 г.
Ученый секретарь /^^^^ ^
диссертационного совета уг"^ yS Шолохов Леонид Федорович
Актуальность проблемы
Несмотря на большие достижения в изучении патогенеза туляремии, механизмы вирулентности туляремийного микроба и его взаимодействия с макроорганизмом остаются не до конца выясненными (Дубровина В.И., 2002; Домарадский И.В., 2005; Татарников С.А., 2010; Dennis D.T. et al., 2001; Ellis J., 2002; McLendon M.K. et al., 2006). Для раскрытия этих процессов необходимо привлечение новых современных подходов, способных выявлять ранее неизвестные факторы участия липополисахарида (ЛПС) туляремийного микроба при формировании резистентности организма к туляремии.
В настоящее время большое внимание уделяется ЛПС Francisella tularensis как одному из факторов патогенности. Следует отметить, что цитотоксичность ЛПС S-форм туляремийного микроба более выражена, чем цитотоксичность ЛПС R-форм. Она проявляется деструктивным действием и отчетливой тенденцией к более резкому ингибированию функциональной активности макрофагов мышей (Сорокин В.М. и др., 1996). Имеются сведения о том, что ЛПС туляремийного микроба является эндотоксином, однако для реализации токсических свойств необходимо его представление in vivo живыми бактериальными клетками типичных природных штаммов возбудителя (Оноприенко Н.Н., Павлович Н.В., 2003).
Известно, что ЛПС возбудителя туляремии не обладает летальной токсичностью как для белых мышей (Сорокин В.М. и др., 1996; Shite S. et al., 2007), так и для кроликов (Nutter J.E., 1971), и является одним из основных индукторов специфического иммунитета (Домарадский И.В., 2005; Fulop М. et al., 1993). Такие свойства позволяют рассматривать ЛПС в качестве одного из возможных компонентов химической вакцины.
Способность многих патогенных бактерий к выживанию в фагоцитах играет важную роль в патогенезе инфекции. Так, сравнительно недавно было показано участие О-антигена ЛПС F tularensis в регуляции резистентности к комплементу, что уменьшает эффективность фагоцитоза макрофагами (Clay CD. et al., 2008). По имеющимся в литературе сведениям, О-полисахарид ЛПС F. tularensis subsp. tularensis необходим для внутриклеточного выживания, тогда как О-антиген F. tularensis subsp. novicida является решающим фактором в устойчивости к бактерицидному действию сыворотки и менее значимым для внутриклеточного выживания (Thomas R.M. et al., 2007; Mokrievich A.N. et al, 2010). Кроме того, способность стимулировать образование цитокинов у ЛПС F. tularensis subsp. novicida выражена сильнее, нежели у ЛПС других подвидов франциселл (Kieffer T.L. et al., 2003). Известно, что иммунизация мышей ЛПС вакцинного штамма F tularensis (LVS) вызывает активацию редкой популяции антиген-специфических В-1а клеток, продуцирующих Т-независимые антитела, что защищает мышей от гибели при заражении летальной дозой F tularensis LVS (Cole L.E. et al., 2009).
Работы, касающиеся влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на функциональную способность иммунокомпетентных клеток, затрагивают в основном отдельные их субпопуляции (Cowley S.C. et al., 2005; Ben Nasr A. et al., 2006; Powell H.J. et al, 2008; Cole L.E. et al., 2009; Cowley S.C. et al, 2010). Между тем, функциональная активность этих клеток и их способность секретировать цитокины в ответ на введение ЛПС F. tularensis и закономерности этих реакций изучены в меньшей мере. В связи с этим изучение динамики субпопуляционного
состава клеток крови, экспрессии активационных маркеров (в частности CD25) на поверхности лимфоцитов, а также одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа - апоптоза клеток иммунофагоцитарной системы под действием ЛПС F. tularensis - позволит получить новые данные об особенностях взаимоотношений «хозяин - паразит», что будет способствовать пониманию механизмов патогенеза F. tularensis и экспериментальному обоснованию факторов, обеспечивающих резистентность организма к возбудителю туляремии.
Цель работы: выявить закономерности формирования иммунного ответа экспериментальных животных на введение белковолипополисахаридного комплекса (БЛПСК) туляремийного микроба разных подвидов.
Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:
-
Изучить влияние БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.
-
Выявить закономерности изменений цитокинпродуцирующей активности клеток иммунофагоцитарной системы под влиянием БЛПСК F. tularensis разных подвидов.
-
Дать сравнительную оценку действия БЛПСК F. tularensis разных подвидов на индукцию апоптоза клеток крови белых мышей в условиях in vivo.
-
Выяснить закономерности формирования субпопуляционного состава лимфоцитов крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК F tularensis разных подвидов.
Научная новизна
Получены новые сведения о формировании резистентности организма экспериментальных животных (белых мышей и морских свинок) под действием БЛПСК возбудителя туляремии разных подвидов.
Экспериментально доказано, что препараты БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis Schu, БЛПСК F tularensis subsp. mediasiatica A-120, БЛПСК F tularensis subsp. novi-cida Utah 112, БЛПСК F tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и БЛПСК F tularensis subsp. holarctica И-250, полученные твин-экстракцией в дозе 10 мкг/106 фагоцитов, являются антигенным стимулом для активации кислородзависимого метаболизма. Показано, что БЛПСК F tularensis subsp. mediasiatica, в отличие от БЛПСК туляремийного микроба других подвидов, способствует повышению содержания неферментных катионных белков в фагоцитах.
Новыми являются сведения о стимулирующем действии БЛПСК F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСК F tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ на фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций и, как следствие, завершенный фагоцитоз туляремийного микроба.
При проведении комплексного сравнительного исследования впервые установлено влияние БЛПСК F. tularensis разных подвидов на формирование субпопуляционного состава клеток крови беспородных белых мышей. Установлено, что БЛПСК туляремийного микроба является индуктором Т-лимфоцитов (CD3+CD4+h CD3+CD8+) и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит от подвидовой принадлежности F. tularensis.
Приоритетными являются данные о том, что повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей 4
CD3+CD4+HJl-4+-eTOK (Т-хелперы 2-го типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлена роль БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации иммунокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.
Предложена и научно обоснована концептуальная схема механизмов действия БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы.
Теоретическое и практическое значение работы
На основании проведенных исследований показана роль БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов в реализации бактерицидных механизмов фагоцитоза (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) клеток иммунофагоци-тарной системы.
Получены новые данные о клеточных и гуморальных факторах врожденного иммунитета и функциональных изменениях, происходящих в клетках организма при формировании адаптивного иммунитета под действием БЛПСК F. tularensis разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.
Экспериментально показано, что иммунный ответ, степень активации лимфоцитов, а также апоптоз иммунокомпетентных клеток лабораторных животных в ответ на введение БЛПСК туляремийного микроба зависит от подвидовой принадлежности и способа получения этих препаратов.
Патогенетически обоснована возможность применения БЛПСК туляремийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении F. tularensis.
Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций: «Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008); «Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом по индексу нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов» (Иркутск, 2009); «Выявление фосфати-дилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II» (Иркутск, 2010); «Определение активности НАДФН-диафоразы в фагоцитах экспериментальных животных» (Иркутск, 2011).
Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск), Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ), ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск), Сибирского института физиологии и биологии растений СО РАН (г. Иркутск).
Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Положения, выносимые на защиту
-
Фагоциты, стимулированные БЛПСК F. tularensis, продуцируют ИЛ-1а, способствующий повышению степени активации эффекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция супероксидных и нитроксидных радикалов), которая зависит от способа получения БЛПСК F. tularensis и его подвидовой принадлежности.
-
В процессе иммуногенеза, вызванного БЛПСК туляремииного микроба, активируются пролиферация иммунокомпетентных клеток и модуляция апоптоза. Особенности формирования субпопуляционного состава и образование апоптотических клеток крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК туляремииного микроба, зависят от подвидовой принадлежности, сроков взаимодействия БЛПСК с клетками макроорганизма.
Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на международных научных конференциях: «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010); «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010-2011); всероссийских научных конференциях: «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009); конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010-2011); III ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2011); Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2010-2011); научных конференциях ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Иркутск, 2008-2011).
Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы «Изучение бактерицидных механизмов фагоцитоза и морфо-функциональных изменений иммунокомпетентных клеток и органов экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном Francisella tularensis разных подвидов» с № ГР 0120.0013859 (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР «Влияние липополисахарида туляремииного микроба разных подвидов на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток макроорганизма» с № ГР 0120.0807000 (2008-2012 гг.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две - в иностранных журналах.
Личный вклад соискателя
Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 22 рисунками. Список литературных источников содержит 200 наименований, в том числе 163 -зарубежных.
