Введение к работе
Сердечно-сосудистые заболевания стоят на первом месте в качестве причины смерти в России, США и Европе (Windecker S., 2013; Quarles L.D., 2013). Подавляющая часть сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов (Pranavchand R., 2013). Еще в 1947 году Н. Н. Аничковым было продемонстровано, что накопление холестерина в интиме артерий является одним из первых проявлений атеросклероза (Аничков Н.Н., 1947; Cianciola N.L., 2011). Транспорт холестерина в организме осуществляется липопротеидами. Источником липидов в интиме сосудов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП) (Vukovic I., 2006; Alaupovic, 1971 P.; Cookson F.B., 1971). Нативные ЛНП (нЛНП), выделенные из крови здоровых людей, не вызвают накопления липидов в культуре клеток (Badimn L., 2009). С другой стороны, многими исследователями (Soran H., 2011; Ors E., 2011) было показано, что почти любая модификация (окисление, дегликозилирование, вортексирование, протеолиз, липолиз и др.) нЛНП приводит к их усиленному захвату как субэндотелиальными, так и другими видами клеток.
Возникает вопрос, почему столь различные изменения в ЛНП приводят к одному и тому же эффекту – внутриклеточному накоплениию липидов. При изучении внутриклеточного накопления холестерина, вызванного ЛНП, модифицированными нейраминидазой, липолитическими, протеолитическими ферментами в нашей лаборатории (Orekhov A.N., 1989; Sobenin I.A., 1996; Tertov V.V., 1998) было показано, что все эти модификации приводят к самоассоциации ЛНП. Также было продемонстрировано, что именно ассоциаты модифицированных ЛНП обладают атерогенными свойствами, то есть вызывают накопление холестерина в клетках. Другими исследователями также были получены аналогичные данные о том, что интенсивное встряхивание или вортексирование (Walters M.J., 2010), окисление медью и железом (Satchell L., 2012; Saputri F.C., 2012), обработка гипохлоритом (Guha M., 2010), миелопероксидазой (Панасенко О.М., 2004), фосфолипазой А2 (Yamamoto K., 2011), сфингомиелиназой (Sneck M., 2012), протеазами (Piha M., 1995), гликозидазами (Панасенко О.М., 2006) приводит к самоассоциации ЛНП и их последующему внутриклеточному накоплению.
В крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями не были обнаружены ЛНП, совпадающие по строению с модифицированными in vitro. Нашей группой были выделены из крови и изучены циркулирующие множествено-модифицированные ЛНП (цммЛНП) (Orekhov A.N. et al., 1989; Tertov V.V. et al., 1990), которые характеризовались пониженным содержанием сиаловой кислоты, маннозы и других сахаров. Эти же частицы были обнаружены другими исследователями - так называемые мелкие, плотные ЛНП (La Belle M. et al., 1990; Avogaro P. et al., 1991) и электроотрицательные (Avogaro P. et al., 1988) ЛНП. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП, как и модифицированные in vitro ЛНП обладали двумя общими свойствами: вызывали внутриклеточное накопление липидов и обладали склонностью к самоассоциации. При этом было показано, что существует прямая зависимость между размером ассоциатов и их атерогенными свойствами (Orekhov A.N. et al., 1991 а; Tertov V.V. et al., 1990; Tertov V.V. et al., 1992).
Однако оставались не вполне понятными механизмы атерогенной модификации ЛНП и её роль в атерогенезе. Оставались без ответа и другие вопросы. Каков механизм ассоциации ЛНП? Можно ли повлиять на этот процесс?
Известно, что ЛНП способны не только к самоассоциации, но и к ассоциации с компонентами внеклеточного матрикса (Soto Y, 2012) и образованию циркулирующих иммунных комплексов (Lopes-Virella M.F., 2013; Tertov V.V., 1996). Но как сам процесс ассоциации, так и атерогенные свойства ассоциатов изучены недостаточно. Циркулирующие иммунные комплексы могут служить маркерами предрасположенности к инфаркту миокарда (Lopes-Virella M.F., и др., 2012), но неизвестно, насколько велика прогностическая и диагностическая роль этого параметра. Не разработаны тест-системы для оценки атерогенного потенциала крови больного на основе измерения показателей атерогенной модификации ЛНП, которые могли бы применяться в клинической практике.
Цель настоящей работы
Целью настоящей работы явилось углублённое изучение механизмов атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности (ЛНП), циркулирующих в крови пациентов; исследование роли этой модификации в атерогенезе; разработка на основе накопленных знаний инновационных подходов к диагностике и терапии атеросклероза, в том числе:
- способов диагностики бессимптомного атеросклероза на основе принципиально новых атерогенных показателей,
- средств, имеющих антиатеросклеротический терапевтический потенциал, проявляющийся в предотвращению самоассоциации ЛНП, которая ведёт к инициации атеросклероза на уровне клеток сосудистой стенки.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
Основные задачи исследования:
-
с помощью морфологических методов изучить локализацию липидов в начальных атеросклеротических поражениях;
-
исследовать механизмы устойчивости к ассоциации циркулирующих в крови человека множественно модифицированных ЛНП;
-
разработать клеточную модель липоидоза для изучения клеточных проявлений атеросклероза и оценки атерогенности компонентов крови;
-
изучить роль самоассоциации ЛНП в усилении атерогенного потенциала липопротеидов;
-
найти эффективные ингибиторы ассоциации ЛНП и накопления ассоциатов в артериальных клетках;
-
оценить диагностическую и прогностическую значимость таких показателей атерогенности липопротеидов, как уровень цммЛНП в крови и уровень холестерина в циркулирующих иммунных комплексах, создать на их основе диагноститческую тест-систему.
Научная новизна
Разработана новая клеточная модель на основе макрофагов моноцитарного происхождения, выделенных из крови человека. Данная модель, проще, доступнее и экономичнее используемой ранее клеточной модели на основе субэндотелиальных клеток аорты человека. Результаты экспериментов, проведённых на разработанной модели, аналогичны результатам, полученным на культивируемых субэндотелиальных клетках. Показано, что для изучения атерогенеза на клеточном уровне и оценки атерогенного потенциала ЛНП данная модель является информативной и адекватной.
Продемонстрировано, что липопротеиды низкой плотности образуют крупные нерастворимые комплексы (ассоциаты). Изучено три варианта ассоциации – самоассоциация ЛНП, ассоциация с компонентами внеклеточого матрикса и образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), содержащих цммЛНП. Во всех трех случаях образуются ассоциаты, которые стимулируют захват липопротеидов клетками и подавляют деградацию липидов цммЛНП, и, тем самым, вызывают накопление внутриклеточных липидов, то есть усиливают атерогенный потенциал цммЛНП.
Исследованы возможности модуляции самоассоциации ЛНП. Выявлены амфифильные полимеры (полаксамеры), которые в зависимости от их гидрофобных свойств влияют на самопроизвольную ассоциацию ЛНП. Показано, что полаксамеры с большей гидрофобностью останавливают процесс ассоциации ЛНП, но не вызывают диссоциацию образовавшихся комплексов. Эти вещества можно рассматривать как перспективные агенты с точки зрения прямой антиатеросклеротической терапии.
В новых экспериментальных условиях подтверждены ранее полученные данные о том, что иммунные комплексы, состоящие из модифицированных ЛНП и аутоантител против модифицированных ЛНП, обладают высоким атерогенным потенциалом на уровне артериальных клеток. Разработаны оптимизированные методики для определения в крови уровня цммЛНП и холестерина ЦИК (Х-ЦИК), которые являются маркерами развития атеросклероза. Выявлена диагностическая значимость в отношении раннего атеросклероза двух параметров: уровня цммЛНП и Х-ЦИК. Проведено сравнение данных параметров. Впервые установлена прогностическая значимость ЛНП-содержащих ЦИК, определяемых по уровню Х-ЦИК, в отношении прогрессирования раннего атеросклероза. По диагностической и прогностической значимости цммЛНП и Х-ЦИК значительно превосходят широко применяемые для диагностики атеросклеротических болезней показатели липидного обмена.
Теоретическая и практическая значимость
Впервые установлена прогностическая значимость ЛНП-содержащих ЦИК, определяемых по уровню Х-ЦИК, в отношении прогрессирования раннего атеросклероза. По диагностической и прогностической значимости цммЛНП и Х-ЦИК значительно превосходят широко применяемые для диагностики атеросклеротических болезней показатели липидного обмена.
Выявлены амфифильные полимеры (полаксамеры), которые в зависимости от их гидрофобных свойств влияют на самопроизвольную ассоциацию ЛНП. Показано, что полаксамеры с большей гидрофобностью останавливают процесс ассоциации ЛНП, но не вызывают диссоциацию образовавшихся комплексов. Эти вещества можно рассматривать как перспективные агенты с точки зрения прямой антиатеросклеротической терапии.
В результате проведенной работы было продемонстрировано, что уровень Х-ЦИК коррелирует со степенью выраженности и распространенностью атеросклеротических поражений и обладает высокой диагностической и прогностической значимостью. Разработан макет аналитической тест-системы (мАТС) для одновременного определения контролируемых специфических биомаркеров, в частности, Х-ЦИК, общего холестерина, холестерина ЛНП и ЛВП, а также триглицеридов. Созданный мАТС предназначен для применения в практической медицине в целях экспрессной диагностики сердечно-сосудистых патологий.
Основные положения, выносимые на защиту
1. На начальных стадиях атерогенеза существенная часть липидов накапливается в клетках сосудистой стенки, а не только вне клеток, и инициация атерогенеза сопровождается накоплением внутриклеточных липидов (клеточным липоидозом).
2. Для воспроизведения клеточного липоидоза – ключевого процесса атерогенеза на клеточном уровне - разработана модель на основе первичной культуры моноцитов-макрофагов, выделенных из крови человека. Разработанная клеточная модель адекватна задачам изучения механизмов липоидоза и может быть использована для оценки атерогенного потенциала плазмы (сыворотки) крови, липидных и нелипидных компонентов крови.
3. На разработанной клеточной модели липоидоза показано, что ассоциация ЛНП усиливает атерогенный потенциал липопротеидов, стимулируя захват ЛНП макрофагами.
4. Самоассоциация ЛНП подавляется амфифильными блок-сополимерами окиси пропилена и окиси этилена, так называемыми полаксамерами. Способность полаксамеров ингибировать ассоциацию зависит от гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования, что свидетельствует об определяющей роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП.
5. Результаты клинического исследования бессимптомного атеросклероза позволили установить, что уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов и уровень цммЛНП в сыворотке, являющиеся маркерами атеросклероза, обладают высокой диагностической значимостью.
6. Результаты клинического исследования показали, что уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов имеет высокую прогностическую значимость для оценки развития бессимптомного атеросклероза
Реализация результатов работы
Материалы диссертации были представлены в виде докладов и тезисов докладов на следующих научных мероприятиях: 78th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Hamburg, Germany, June 20-23, 2010; 79th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Gothenburg, Sweden, 26-29 June, 2011; 80th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Milan, Italy, May 25 -28 , 2012; Arteriosclerosis, Thromdosis and Vascular Biology. 2011 Scientific Sessions. April 28-30, 2011, Chicago, Illinois; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions 2013. May 1-3, 2013, Lake Buena Vista, Florida.
На основе полученных в работе данных зарегистрирован 1 патент: Орехов АН, Собенин ИА, Кириченко ТВ, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Способ профилактики и лечения атеросклероза. Патент на изобретение № 2455016 от 07 октября 2012 г.
На основе полученных в работе данных зарегистрированы 9 патентных заявок, представленных в списке опубликованных работ по теме диссертации.
На основе результатов проведённых исследований разработан лабораторный регламент макета аналитической тест-системы для применения в медицине при экспрессной диагностике атерогенных дислипидемий при сердечно сосудистых патологиях.
Работа апробирована 25 сентября 2013 года в ФГБУ “НИИ ОПП” РАМН на межлабораторной конференции с участием лаборатории клеточных механизмов атерогенеза, лаборатории молекулярной физиологии, лаборатории регуляции репаративных процессов, лаборатории общей патологии микроциркуляции.
Личный вклад автора.
Автор принимала непосредственное участие в получении исходных данных и их обработке, представляла полученные результаты на международных конференциях, принимала активное участие в подготовке публикаций по выполненной работе. К защите представлены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.
Публикации по теме диссертации.
По результатам исследований опубликовано 29 научных работ, в том числе 9 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, 6 статей в научно-практических рецензируемых сборниках и 11 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, одна глава в книге и две монографии.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 252 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 213 источников, в том числе 13 отечественных и 200 иностранных. Текст иллюстрирован 50 рисунками и 12 таблицами.
