Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о механизмах регенерации тканей 12
1.1.1. Основные теории старения 18
1.2. Экстремальные состояния и проблема регенерации тканей 20
1.3. Использование стволовых клеток для оптимизации процессов регенерации в условиях старения и воздействия экстремального повреждения 27
1.3.1. Проблема использования стволовых клеток в эксперименте и клинике 27
1.3.2. Использование стволовых клеток в условиях старения и воздействия экстремальных факторов 31
Заключение 35
Глава 2. Методические вопросы исследования
2.1. Общая характеристика лабораторных животных, использованных в исследованиях 38
2.2. Получение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 38
2.2.1. Планирование экспериментальной беременности лабораторных животных 38
2.2.2. Выделение культуры ММСК 39
2.2.3. Условия культивирования ММСК 46
2.2.4. Подсчет клеток 47
2.2.5. Определение жизнеспособности клеток 47
2.2.6. Субкультивирование ММСК 47
2.2.7. Направленные дифференцировки ММСК 48
2.2.8. Окраска культуры ММСК с помощью набора первичных и вторичных антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Rat) 51
2.3. Дозы и способы введения '. 53
2.4. Облучение лабораторных животных на гамма-терапевтической установке 55
2.5. Методы исследования кроветворной ткани 58
2.6. Методы оценки регенераторных процессов в слизистой оболочке тощей кишки 62
2.7. Методы статистической обработки полученных результатов 65
Глава 3. Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на состояние миелоидной ткани и эпителия тощей кишки зрелых и старых лабораторных животных в физиологических условиях
3.1. Состояние миелоидной ткани и периферической крови зрелых и старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в физиологических условиях 66
3.2. Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых и старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в физиологических условиях 74
3.3. Состояние миелоидной ткани и периферической крови зрелых и старых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК в физиологических условиях 77
3.4. Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых и старых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК в физиологических условиях 84
Заключение 86
Глава 4. Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на состояние миелоидной ткани и эпителия тощей кишки зрелых лабораторных животных в условиях воздействия экстремальных факторов
4.1. Состояние миелоидной ткани и периферической крови зрелых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 89
4.2. Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 95
4.3. Состояние миелоидной ткани и периферической крови зрелых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 97
4.4. Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 104
4.5. Состояние миелоидной ткани и периферической крови зрелых лабораторных животных на 5 сутки после введения ММСК в условиях острой кровопотери 107
Заключение 114
Глава 5. Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на состояние миелоидной ткани и эпителия тощей кишки старых лабораторных животных в условиях воздействия экстремальных факторов
5.1. Состояние миелоидной ткани и периферической крови старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 117
5.2. Состояние слизистой оболочки тощей кишки старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 124
5.3. Состояние миелоидной ткани и периферической крови старых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 126
5.4. Состояние слизистой оболочки тощей кишки старых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения 133
5.5. Состояние миелоидной ткани и периферической крови старых лабораторных животных на 5 сутки после введения ММСК в условиях острой кровопотери.ЛЗб Заключение 143
Общее заключение 147
Выводы 158
Литература 159
- Использование стволовых клеток для оптимизации процессов регенерации в условиях старения и воздействия экстремального повреждения
- Получение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
- Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых и старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в физиологических условиях
- Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Последние десятилетия развития мировой медицинской науки характеризуются повышенным интересом к изучению биологии стволовых клеток и возможностью их использования в медицинской практике. Полученные результаты свидетельствуют о значительных возможностях для внедрения новых методов клеточной и тканевой терапии для лечения самых сложных болезней, при которых альтернативные лечебные мероприятия оказываются бессильными. Между тем, следует заметить, что многие вопросы, связанные с изучением механизмов действия стволовых клеток, возможностью их доставки в поврежденную ткань, направленной дифференцировки стволовых клеток остаются в значительной мере неизученными (Le Blanc К. et all., 2003; Majumdar М.К. et all., 2000; Sabatini F. et all., 2005). При старении организма развитие регенерации осуществляется на ином, отличном от молодого организма уровне, что может определять существенные различия в выраженности регенераторного ответа в ответ на действие экстремального фактора (Ястребов А.П., 2005, Хавинсон В.Х., 2007, Оловников A.M., 2009). В процессе старения развивается генерализованный G1/S - блок для процессов дифференцировки и пролиферации, нарушающий процессы клеточного самообновления (Кишкун А.А., 2008). Одной из возможностей преодолеть такой блок является увеличение в организме количества клеток, способных к дифференцировке и пролиферации. С этой целью можно использовать стволовые клетки. Можно полагать, что при использовании стволовых клеток для коррекции процессов старения в организме происходит повышение синтеза факторов роста, необходимых для поддержки дифференциации и пролиферации клеток, приводящее к восстановлению нарушенных при старении функций органов и систем (Захаров Ю.М., 2002; Бочков Н.П., 2002; Губин Г.Д., 1998). В настоящем исследовании изучалась возможность использования аллогенной трансплантации ММСК для воздействия на процессы регенерации в органах и системах при действии экстремальных факторов - ИИ, острой кровопотери, характер повреждений при которых во многом напоминает таковые, развивающиеся в результате старения организма (Квачева Ю.Е., 2002; Мазурик В.К., 1999). Основным источником получения стволовых клеток, является костный мозг, периферическая и пуповинная кровь (Волчков СЕ. с соавт., 2009; Калаумбаева М.З. с соавт., 2009; Jiang Y. et all., 2002). Между тем, фетальные органы по содержанию мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток превосходят выше названные источники (Мелихова М.С. с соавт., 2007; Miki Т. et all, 2007; Alviano F. et all, 2007; Zhang X. Et all., 2006). Однако получение таких клеток связано с определенными методическими трудностями. Также ограничивают использование стволовых клеток этические и некоторые другие проблемы. Можно также полагать, что мезенхимальные стволовые клетки плаценты имеют еще одно преимущество в сравнении с мезенхимальными стволовыми
клетками, полученными из других источников - они находятся в начальном периоде своей жизни и могут обладать в этой связи пролонгированным терапевтическим эффектом, что особенно существенно при их использовании в гериатрической практике.
Цель исследования. Изучить влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на регенерацию тканей зрелых и старых лабораторных животных в физиологических условиях и при воздействии экстремальных факторов (кровопотеря, ионизирующее излучение).
Задачи исследования:
Оценить состояние пролиферативной активности быстрообновляющихся тканей зрелых и старых лабораторных животных в физиологических условиях.
Изучить влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на состояние миелоидной ткани зрелых и старых лабораторных животных в физиологических условиях.
Изучить влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на состояние миелоидной ткани зрелых и старых лабораторных животных в условиях воздействия экстремальных факторов - ионизирующего излучения и острой кровопотери.
Изучить влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты на состояние эпителия кишечника зрелых и старых лабораторных животных в физиологических условиях и после воздействии экстремальных факторов.
Дать сравнительную оценку воздействия трансплантированных ММСК на активность регенерации быстрообновляющихся тканей у зрелых и старых лабораторных животных в физиологических условиях и в условиях экстремального повреждения.
Научная новизна. На основании проведенного исследования доказана возможность использования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, для обеспечения эффективной регенерации тканей в физиологических условиях и в условиях воздействия на организм экстремальных факторов. Показано, что трансплантация ММСК в физиологических условиях оказывает стимулирующее действие на эритропоэз зрелых и старых лабораторных животных, вызывает увеличение содержания криптального эпителия тощей кишки. У старых животных при этом происходит снижение уровня цитогенетически измененных клеток. В условиях воздействия ионизирующего излучения трансплантация ММСК также приводит к существенному увеличению средней клеточности крипты. У зрелых лабораторных животных данный механизм реализуется за счет повышения митотической активности эпителиоцитов и угнетения апоптоза, у старых - за счет ингибирования запрограммированной клеточной гибели.
Установлено, что в условиях воздействия экстремальных факторов (ионизирующего излучения, острой кровопотери) введение ММСК зрелым и старым лабораторным животным приводит к стимуляции эритропоэза, снижению мутагенной активности, стимуляции гранулоцитопоэза у зрелых животных.
На основании проведенных исследований можно заключить, что старые лабораторные животные сохраняют способность при воздействии ММСК к активации регенерации быстрообновляющихся тканей, как в физиологических условиях, так и после воздействия экстремальных факторов.
Полученные результаты исследования послужили основой для получения двух положительных решений о выдаче патента на изобретение:
1.) от 14.01.2010: «Способ восстановления регенерации миелоидной ткани после воздействия ионизирующего излучения, путем аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты»;
2.) от 25.02.2010: «Способ снятия клеток с культуральной поверхности при проведении пассажа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток».
Теоретическая и практическая значимость работы. Выполненная работа явилась доказательством возможности использования трансплантации ММСК для повышения активности регенерации быстрообновляющихся тканей в условиях воздействия экстремальных факторов. При этом, активация регенерации после введения ММСК зарегистрирована как у зрелых, так и у старых лабораторных животных.
Основные положения, выносимые на защиту.
Трансплантация ММСК зрелым лабораторным животным в физиологических условиях и в условиях воздействия экстремальных факторов (ионизирующее излучение, острая кровопотеря) оказывает стимулирующее действие на пролиферативную активность быстрообновляющихся тканей (эпителий тощей кишки, миелоидная ткань).
У старых лабораторных животных сохраняется способность к активации регенерации быстрообновляющихся тканей при трансплантации ММСК, как в физиологических условиях, так и в условиях воздействия экстремальных факторов.
Практическое внедрение результатов исследования
Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедрах
патологической физиологии и биохимии в разделы: экстремальные
воздействия, геронтология.
Разработанная методика по выделению и культивированию ММСК
внедрена в работу лаборатории геронтологии ГУЗ СО института
медицинских клеточных технологий.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
63-й и 64-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» на секции «Meдико-биологические дисциплины» среди молодых ученых г. Екатеринбург, 2008, 2009 гг.
IV съезд физиологов Урала (с международным участием), г. Екатеринбург, 2009 г.
Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2009 г.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 14 научных статьях, из них 7 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, глав собственных исследований, выводов и списка литературы, включающего 223 источников (103 отечественных, 115 иностранных).
Диссертация содержит 181 страницу машинописного текста. Работа иллюстрирована 62 таблицами и 36 рисунками.
Использование стволовых клеток для оптимизации процессов регенерации в условиях старения и воздействия экстремального повреждения
В биологию термин «стволовая клетка» ввел русский ученый Александр Максимов в 1908 году в Берлине на съезде гематологического общества. Следующей значительной вехой в исследовании этого научного вопроса стало открытие российскими специалистами Александром Фриденштейном и Иосифом Чертковым в 60-70-е годы прошлого века стволовых клеток крови. Развитие учения о стволовых клетках в последние годы и достижения клеточной терапии дают основания надеяться на новые перспективы в лечении ряда тяжёлых хронических и неизлечимых заболеваний. Стволовыми клетками называют универсальные клетки организма, способные при определенных условиях развиться в любой вид ткани и способствовать образованию любого органа - печени, почек, сердца, мозга и т.д. Они способны к самообновлению и, что самое главное, в процессе деления образуют специализированные клетки различных тканей [22, 62, 70, 109, 140]. Таким образом, все клетки нашего организма возникают из стволовых клеток. Стволовые клетки обновляют и замещают клетки, утраченные в результате каких-либо повреждений во всех органах и тканях [93, 125, 149]. В 1998 году американским ученым Джону Герхарту и Джеймсу Томпсону впервые в лабораторных условиях удалось получить и культивировать культуры эмбриональных стволовых клеток, способных дифференцироваться в различные зрелые клетки и органы. Таким образом, у человечества появилась реальная возможность в лабораторных условиях наращивать необходимое количество «запчастей» для организма и коррегировать последствия ряда хронических и острых заболеваний, продлевать срок активной жизни. Такой вид коррекции заболеваний получил название заместительной клеточной терапии, так как основан на использовании собственных или донорских стволовых клеток для замещения дефектных органов и систем организма [13, 28, 94, 106, 155, 185]. По своему происхождению стволовые клетки разделяют на эмбриональные, фетальные, стволовые клетки плаценты, пуповинной крови и стволовые клетки взрослого человека [25, 132, 177, 180]. Источником эмбриональных стволовых клеток является бластоциста - зародыш, который формируется к пятому дню оплодотворения. Эти стволовые клетки способны дифференцироваться абсолютно во все типы клеток взрослого организма. Но у этого источника стволовых клеток есть существенный недостаток, т.к. эти клетки in vitro способны спонтанно перерождаться в раковые клетки, и в настоящее время отсутствует безопасная линия эмбриональных стволовых клеток, годных для клинического применения [14, 22, 37]. Фетальные стволовые клетки получают из абортивного материала на 9-12 неделе беременности. Такие клетки уже получили свое определенное направление развития в организме и не являются онкологически опасными. Фетальные клетки практически не иммуногенны, поскольку в 1 и 2 триместрах гестации на них не экспрессированы белки гистосовместимости 1 и 2 класса. Однако помимо этических и юридических проблем, использование абортивного материала чревато осложнениями, такими, как заражение реципиента вирусом герпеса, вирусными гепатитами, СПИДом и др. инфекциями. Поэтому для использования подобных технологий требуется жесткий лабораторно-клинический контроль. Тем не менее, существует множество работ и исследований, в рамках которых доказан огромный потенциал данной технологии как альтернативы к собственным стволовым клеткам [93, 124, 166, 182, 206, 214]. Источником стволовых клеток является также плацентарно-пуповинная кровь, собранная после рождения ребенка и богатая стволовыми клетками. Взяв эту кровь и поместив в криобанк стволовых клеток, в дальнейшем можно использовать ее для восстановления практически любых тканей и органов, а также для лечения любых заболеваний, в том числе и онкологических. Однако количество стволовых клеток в пуповинной крови не достаточно велико, и эффективное их применение без наращивания в культуре возможно только однократно [68, 70]. Доступным источником стволовых клеток является костный мозг человека, в котором выделяют два вида стволовых клеток: первый - это гематопоэтические стволовые клетки, из которых формируются абсолютно все клетки крови, второй - это мезенхимальные стволовые клетки, которые могут трансформироваться в клетки различных органов и тканей [115, 132, 137]. В качестве источника мезенхимальных стволовых клеток особое внимание привлекает плацента. Плацента, которая является органом, происходящим из тканей, как матери, так и плода, может быть получена неоперативным путем без высокого риска инвазивности. При этом удается получить из плаценты на порядок больше клеток, чем из других источников [22, 104, 126, 138, 188, 189]. После родов плаценту можно сохранять в лаборатории и получать клетки даже спустя несколько дней. Выделение ММСК из послеродовых тканей позволит создавать более «богатые» персональные фамильные клеточные банки. На последней конференции по вопросам номенклатуры, фенотипирования клеток из плацентарных тканей и этических проблем их использования в 2007 году постановили [158]: 1. Клетки из всех плацентарных тканей следует называть мезенхимальными стромальными клетками. 2. Основные критерии из определения: способность прикрепляться к пластику; формирование фибробластоподобных колоний; специфический паттерн экспрессии поверхностных антигенов (CD90\CD105\CD73+ и CD45/CD34/CD14/HLADR): дифференцировочный потенциал - способность дифференцироваться в клетки остеогенного, хондрогенного, адипогенного и эндотелиального ряда. Bailo М., Soncini М., Vertua Е. в своих исследованиях показали значительную способность клеток к приживлению в организме свиньи и крысы [126]. Так, был продемонстрирован донорский химеризм в мозге, легких, костном мозге, тимусе, селезенке, почках и печени после трансплантации человеческих клеток амниона и хориона. Доклинические модели: 1. Регенерация печени [168]. 2. Регенерация сердечной мышечной ткани [179]. Совместное культивирование с кардиомиоцитами грызунов способствовало кардиомиогенной дифференцировке стволовых клеток пуповинно-плацентарного комплекса. Кроме того, клетки были способны интегрироваться в миокард и выживать как минимум в течение 2 месяцев после трансплантации. 3. Нейродегенеративные заболевания. На крысиной модели болезни Паркинсона стволовые клетки пуповинно-плацентарного комплекса способствовали выживанию нейронов черной субстанции мозга [166]. В другой работе клетки также пересаживали в поврежденный спинной мозг приматов, где они противостояли гибели моторных нейронов и способствовали формированию новых аксонов [152].
Получение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
Лабораторные крысы - это полиэстричные животные с длительностью эстрального цикла 4-5 дней и спонтанным типом овуляции. Определение фаз эстрального цикла дает возможность планировать экспериментальную беременность. Для определения фазы эстрального цикла производилось взятие мазков у лабораторных крыс-самок ежедневно утром в одно и то же время. Приготовление влагалищного мазка осуществлялось следующим образом: содержимое влагалища брали с заднего свода стеклянной палочкой (диаметр 0,3 см) путем вращательных движений, наносили на чистое сухое предметное стекло. Фиксация мазка осуществлялась по методу Май-Грюнвальда, окраска по Романовскому-Гимзе.
По результатам микроскопии цитологических мазков производилось определение фазы эстрального цикла. По цитологической картине влагалищного мазка лабораторных крыс можно определить четыре фазы эстрального цикла.
Фаза межтечковая (диэструс). Во влагалищном мазке небольшое количество эпителиальных клеток с четко выраженными ядрами, значительным числом лейкоцитов и слизи. Фаза предтечковая (проэструс). Во влагалищном мазке присутствует значительное количество эпителиальных клеток овальной формы с большим ядром. Лейкоциты отсутствуют. Фаза течки (эструс). Во влагалищном мазке много ороговевших безъядерных клеток, так называемых чешуек. Ядерные эпителиальные клетки и лейкоциты отсутствуют.
Фаза послетечковая (метоэструс). Во влагалищном мазке много лейкоцитов, слизи, некоторое количество ороговевших чешуек, а также ядерные клетки. В фазу течки (эструс) самка является фертильной. Самку подсаживали к самцам в соотношении 1:3. Ежедневное взятие мазков у самки продолжалось до дня обнаружения в мазке сперматозоидов. Этот день условно принимали за первый день беременности, самку отсаживали в отдельную клетку. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) -гетерогенная популяция клеток, способная к дифференцировке в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение: адипоциты, остеоциты, хондроциты, а также в особых условиях in vitro - в клетки эктодермального и энтодермального фенотипа [128, 136]. ММСК обладают несколькими, отличными от основной популяции клеток, уникальными свойствами: 1. Они неспециализированы - т.е. не имеют тканеспецифичных структур, позволяющих выполнять специализированные функции [167, 173]. 2. Они способны к пролиферации, т.е. к длительному (по-видимому, больше продолжительности жизни человека) размножению и продукции большого (возможно, сколь угодного) числа клеток. Исходная популяция ММСК, которая пролиферирует в лабораторных условиях в течение нескольких месяцев, может вырасти до нескольких миллионов клеток [147, 168, 172]. 3. Они способны к дифференцировке - процессу специализации клеток. Какие внешние и внутренние силы (или сигналы) дают толчок к началу дифференцировки, еще до конца не ясно. По-видимому, внутренние сигналы управляются генами клетки, а внешние - химическими веществами, выделяемыми другими клетками, а также некоторыми молекулами окружающей среды. Наиболее вероятно, что эти воздействия имеют информационный, а не физический, химический, средовой и т.п. характер [146. 164]. 4. Одной из основных характеристик ММСК является способность к асимметрическому делению. В результате деления специализированных клеток образуются пары таких же клеток, полностью тождественных друг другу. А для ММСК это правило не обязательно: они могут делиться несимметрично - только одна дочерняя клетка идентична родительской и остается стволовой, другая претерпевает цепь превращений и становится специализированной [183, 186]. 5. Попадая в организм при трансплантации, ММСК продолжают делиться и, как сейчас считается, сами находят место, где их помощь нужнее всего. Они продуцируют разнообразные биологически активные вещества, которые обновляют и регенерируют окружающие ткани [58, 101]. В экспериментах по совместному культивированию разных клеток показано, что ММСК не подвергаются аллогенному отторжению, как у людей, так и у экспериментальных животных [38, 57, 63]. В основе этого эффекта лежат три основных механизма. Во-первых, ММСК не содержат антигена гистосовместимости. Во-вторых, эти клетки предотвращают Т-клеточный ответ непрямым путем через модуляцию дендритных клеток и непосредственно, нарушая функцию и пролиферацию NK-клеток, а также CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов [112, 123]. В-третьих, ММСК индуцируют супрессивное местное микроокружение путем продукции простагландинов и интерлейкина-10, который ингибирует продукцию у - интерферона Т-лимфоцитами и продукцию всех провоспалительных цитокинов макрофагами [38, 131]. А также путем экспрессии индоламин 2,3,-диоксигеназы, которая исчерпывает местный уровень триптофана [57, 187]. Все эти данные расширяют возможности клинического применения ММСК. Также известно, что ММСК секретируют растворимые факторы (цитокины), которые создают иммуносупрессивную среду. Считается общепринятым, что ММСК в стандартных условиях (без воздействия специфического индуктора) не секретируют IL-2, -3, -4, -5 , но секретируют IL-6, -7, -8, -11, -12, -14, -15, -27, LIF (лейкоз ингибирующий фактор - ЛИФ), колониестимулирующий фактор макрофагов.
Некоторые из этих цитокинов обеспечивают критические взаимодействия «клетка-клетка», ускоряя дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток. ММСК (в большей степени ММСК селезенки) секретируют также гепатоцитарный фактор роста, который индуцирует митогенную и антиапоптотическую активность в различных системах, ускоряет заживление ран, что подтверждает активную роль ММСК в регенеративной медицине (в тканевой репарации) [128, 101, 191].
Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых и старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в физиологических условиях
При подсчете ретикулоцитов периферической крови зрелых и старых лабораторных животных установлено их достоверное увеличение (у зрелых животных на 35,5 %, у старых на 27 %), что можно объяснить выявленной ранее стимуляцией эритропоэза. При подсчете лейкоцитарной формулы не отмечено значимого изменения содержания гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов по сравнению с контрольными значениями (таблица 3.3.6).
Таким образом, введение ММСК на 7 сутки в физиологических условиях оказывает стимулирующее действие на эритропоэз и у зрелых, и у старых лабораторных животных, приводит к снижению спонтанного уровня мутагенеза у старых лабораторных животных.
В подгруппе зрелых лабораторных животных на 7 сутки после внутривенной трансплантации ММСК в физиологических условиях при подсчете числа митозов в эпителиоцитах крипт на 40 % установлено повышение пролиферативной активности эпителиоцитов (МИ: 11,45 ± 1,65).
При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза не выявлено значимого изменения изучаемого показателя по сравнению с контрольной группой.
Пролиферативный ответ на введение ММСК нашел свое отражение в увеличении содержания эпителиоцитов в криптах. Так показатель СКК был на 21 % выше, чем в группе контроля (рис. 3.4.1).
В подгруппе старых лабораторных животных на 7 сутки после трансплантации ММСК в физиологических условиях при подсчете числа митотически делящихся клеток не установлено значимого пролиферативного ответа после проведенной трансплантации по сравнению со значениями нормы.
При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза выявлено, что степень выраженности апоптоза была существенно меньше, чем в контроле (АИ: 4,85 ± 0,62, р 0,05).
Антиапоптогенное действие нашло свое отражение при подсчете количества криптальных эпителиоцитов. Было выявлено повышение содержания криштального эпителия, и данный показатель был на 14 % больше по сравнению с контролем (таблица 3.4.2).
Таким образом, введение ММСК зрелым и старым лабораторным животным на 7 сутки приводит к увеличению средней клеточности 1 крипты. У зрелых лабораторных животных это происходит за счет повышения митозов, тогда как у старых лабораторных животных - за счет снижения выраженности запрограммированной клеточной гибели. Проведенные исследования позволили определить и сравнить особенности состояния процессов регенерации зрелых и старых лабораторных животных в миелоидной ткани и в тощей кишке в физиологических условиях при внутривенном введении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.
Введение ММСК старым лабораторным животным уже на 1 сутки приводит к увеличению количества митотически делящихся клеток эритроидного дифферона (МИ Эр.д.: 2,00 ± 1,33 %о, р 0,5) и, таким образом, к стимуляции пролиферативного пула эритроидного ростка. Так содержание эритробластов (0,62 ± 0,09 %, р 0,05) и базофильных нормобластов (2,90 ± 0,53 %, р 0,05) было соответственно на 37 % и 51 % больше относительно контроля. В то же время содержание клеток созревающего пула эритроидного дифферона, а таюке общее содержание эритроидных элементов и элементов гранулоцитарного дифферона достоверно не отличалось от значений нормы. У зрелых лабораторных животных такого эффекта отмечено не было - активность эритропоэза и гранулоцитопоэза зрелых лабораторных животных статистически не отличалась от контроля. У старых лабораторных животных, в отличие от зрелых, на 1 сутки после введения ММСК отмечается активация митотической активности эпителиоцитов тощей кишки. Так митотический индекс был на 43 % выше относительно контроля. На 7 сутки после введения ММСК в физиологических условиях отмечаются сходные изменения у зрелых и старых лабораторных животных. Выявлена активация пролиферативной активности эритроидного дифферона, увеличение общего содержания эритроидных элементов и у зрелых, и у старых лабораторных животных. При подсчете числа митозов в клетках гранулоцитарного дифферона не отмечено значимого действия ММСК на пролиферативную активность. Значение ГЭС и у зрелых, и у старых лабораторных животных было достоверно ниже контрольных показателей, что еще раз свидетельствует о преимущественном действии вводимых ММСК в физиологических условиях на активность эритропоэза. Данный факт можно объяснить способностью ММСК к синтезу многочисленных ангиогенных факторов (ангиопоэтин 1, platelet-derived growth factor -гепатоцитарный фактор роста, ингибирующий гипоксию фактор HIF-la, эндотелиальный фактор роста). В периферической крови зрелых и старых лабораторных животных установлено достоверное увеличение ретикулоцитов, что молено объяснить выявленной стимуляцией эритропоэза. Данные микроядерного теста на 7 сутки после введения ММСК разнятся. У зрелых лабораторных животных не выявлено существенных изменений изучаемого показателя относительно контроля, и данный показатель соответствовал СУМ. В ретикулоцитах старых лабораторных животных установлено, что уровень образования микроядер на фоне проводимой трансплантации ММСК находился существенно ниже значений в контрольной группе. Введение ММСК зрелым и старым лабораторным животным на 7 сутки приводит к увеличению средней клеточности 1 крипты на 21 % выше, чем в группе контроля у зрелых лабораторных животных и на 14 % выше показателя контроля у старых лабораторных животных. При этом у зрелых лабораторных животных отмечается повышение пролиферативной активности на 40 %, а у старых - снижение выраженности запрограммированной клеточной гибели на 17,5 %. Таким образом, увеличение средней клеточности у зрелых лабораторных животных происходит за счет повышения количества митозов, а у старых - за счет снижения апоптоза.
Состояние слизистой оболочки тощей кишки зрелых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК в условиях воздействия ионизирующего излучения
В контрольной подгруппе зрелых лабораторных животных на 7 сутки после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в клетках эритроидного и гранулоцитарного дифферонов выявлено восстановление пролиферативной активности, которая на 7 сутки соответствовала значениям нормы.
По результатам миелограммы контрольной подгруппы зрелых лабораторных животных к 7 суткам после облучения не произошло естественного восстановления активности эритропоэза и гранулоцитопоэза. Произошло естественное восстановление содержания клеток пролиферативного пула эритроидного ростка (эритробластов и базофильных нормобластов). Однако не произошло восстановления содержания клеток созревающего пула (оксифильных и полихроматофильных нормобластов) и общее количество эритроидных элементов оказалось ниже значений нормы. Анализируя данные гранулоцитарного ростка, следует отметить, что произошло также восстановление содержания клеток пролиферативного пула (миелобластов и промиелоцитов). Не достигли значений нормы миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные формы нейтрофилов. Вследствие этого было отмечено снижение общего содержания гранулоцитов миелоидной ткани. Значения ИСЭНбл и ИСН на 7 сутки после воздействия ИИ соответствовали значению нормы. Не произошло полноценного восстановления моноцитопоэза, тогда как лимфоцитопоэз достиг значений нормы (таблица 4.3.1).
При подсчете микроядер в полихроматофильных нормобластах зрелых лабораторных животных, установлено, что не произошло полного восстановления содержания цитогенетически измененных клеток до значений нормы, и данный показатель был достоверно выше СУМ (таблица 4.3.2).
Анализируя данные периферической крови зрелых лабораторных животных на 7 сутки после воздействия ИИ, установлено наличие ретикулоцитопении, снижение содержания нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, восстановление содержания лимфоцитов (таблица 4.3.3.).
Изучая данные миелограммы опытной подгруппы зрелых ч лабораторных животных на 7 сутки после воздействия ИИ, установлено, что на фоне введения ММСК также как и в контрольной подгруппе произошло восстановление содержания миелобластов, промиелоцитов. Выявлено увеличение содержания палочкоядерных и сегментоядерных форм нейтрофилов по сравнению с контрольной подгруппой (27,37 ± 0,97, р 0.05). Это нашло свое отражение в увеличении общего содержания гранулоцитов по сравнению с контрольной подгруппой (Гр.эл.: 48,42 ± 2,38, р 0,05).
Анализируя данные эритроидного ростка зрелых лабораторных животных, следует отметить, что также как и в контрольной подгруппе произошло восстановление содержания эритробластов и базофильных нормобластов. Кроме того, наблюдается увеличение содержания полихроматофильных (10,27 ± 1,59 %, р 0,05) и оксифильных (1,82 ± 0,22 %, р 0.05) нормобластов по сравнению с контрольной подгруппой. Описанные изменения отразились в повышении активности эритроидного дифферона (Эр.эл: 14,67 ± 2,79 %, р 0,05). Показатель ГЭС был ниже значений нормы, что свидетельствует о стимуляции преимущественно эритроидного ростка. Содержание моноцитов было существенно ниже показателей нормы (таблица 4.3.4).
При подсчете микроядер в полихроматофильных нормобластах зрелых лабораторных животных выявлено снижение индуцированной мутагенной активности на фоне введения ММСК, что привело к восстановлению уровня цитогенетически измененных клеток до значений нормы (МЯТ 5,13 ± 1,18 %о, р 0,05) (таблица 4.3.5, рисунок 4.3.2).
По данным периферической крови зрелых лабораторных животных на 7 сутки после введения ММСК на фоне воздействия ИИ, обнаружено, что на фоне введения ММСК также как и в контрольной подгруппе произошло восстановление содержания лимфоцитов. Установлено увеличение количества ретикулоцитов (2,17 ± 0,56 %о, р 0,05), гранулоцитов (20,83 ± 2,50 %, р 0,05) и моноцитов (6,83 ± 1,50, р 0,05) по сравнению с контрольной подгруппой (таблица 4.3.6).
Таким образом, у зрелых лабораторных животных на 7 сутки после воздействия ИИ на фоне введения ММСК отмечено увеличение общего количества эритроидных и гранулоцитарных элементов. Выявлено снижение уровня цитогенетически измененных клеток, и показатель СУМ достиг значений нормы.
В контрольной подгруппе зрелых лабораторных животных при подсчете числа митозов в криптах, подсчете средней клеточности в 1 крипте, отмечено восстановление пролиферативной активности и средней клеточности крипты. В то же время содержание клеток в состоянии апоптоза оставалось существенно выше значений нормы (АИ: 6,60 ± 0,63 %, р 0,05) (таблица 4.4.1).
