Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные методы лечения патологической неоваскуляризации 12
1.2. Стимуляторы и ингибиторы ангиогенеза 23
1.2.1. Эндотелиальный сосудистый фактор роста-VEGF 23
1.2.2. Препараты, блокирующие VEGF 27
1.2.3. Фактор пигментного эпителия - PEDF 33
1.3. Экспериментальные модели в офтальмологии: органотипические культуры сетчатки и модель ретинальной неоваскуляризации у животных 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Экспериментальные исследования на органотипических культурах сетчатки (первый раздел) 46
2.1.1. Характеристика экспериментального материала 46
2.1.2. Методы исследования органотипических культур сетчатки 48
2.2. Экспериментальные исследования на животных 51
2.2.1. Характеристика экспериментального материала 51
2.2.2. Методы исследования 53
2.2.3. Компьютерный анализ цифровых изображений сосудов сетчатки 55
Глава 3. Влияние PEDF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации 64
3.1. Влияние PEDF на органотипические культуры сетчатки 64
3.2. Влияние PEDF на состояние сетчатки экспериментальных животных 79
3.2.1. Оценка экспериментальной модели ретинальнои неоваскуляризации 80
3.2.2. Влияние PEDF на состояние сетчатки животных с экспериментальной моделью ретинальнои неоваскуляризации 85
Заключение 90
Выводы 101
Список литературы 103
- Эндотелиальный сосудистый фактор роста-VEGF
- Экспериментальные модели в офтальмологии: органотипические культуры сетчатки и модель ретинальной неоваскуляризации у животных
- Методы исследования органотипических культур сетчатки
- Влияние PEDF на состояние сетчатки экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки, связанная с патологической неоваскуляризацией, которая приводит к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. Функциональная реабилитация сетчатки при данной патологии в настоящее время остается актуальной задачей.
Несмотря на совершенствование лазерных и хирургических методов коррекции этих заболеваний, лечение не всегда является эффективным.
Для определения новых стратегических направлений в лечении офтальмологических заболеваний, связанных с развитием неоваскуляризции, необходимо иметь четкое представление о механизмах развития патологического ангиогенеза. Регуляция процессов формирования новообразованных сосудов, с точки зрения современных представлений, осуществляется благодаря наличию системы, связанных между собой, стимулирующих и ингибирующих факторов. Нарушение баланса в этой системе - между ангиогенными и антиангиогенными факторами приводит к развитию патологического ангиогенеза (Мептее T.J., 1990; McAvoy J.W. et al., 1990; Klagsbrun M. et al., 1991; D'Amore P.A., 1994; Mocanu C, 2003; Peter A., 2006; Simo R. et al., 2006).
Ключевым ангиогенным фактором в норме и патологии, благодаря его биологическим свойствам, принято считать эндотелиальный сосудистый фактор роста (Vascular Endothelial Growth Factor-VEGF) (Ferrara N. et al., 1989; Aiello L.P. et al., 1994; Aiello L.P. et al., 1995; Stone J. et al., 1995; Ferrara N., 2001; Ferrara N., 2004). Большое количество экспериментальных работ подтверждают тесную связь VEGF с развитием неоваскуляризации сетчатки (Aiello L. P. et al., 1995; Alon Т. et al., 1995; Shima D.T. et al., 1996).
Учитывая, что VEGF играет роль одного из ведущих факторов в развитии патологической неоваскуляризации, в настоящее время используются несколько лекарственных препаратов, блокирующих его действие. К ним относятся: пегаптаниб (Макуджен) - селективный ингибитор VEGF-165, ранибизумаб (Луцентис) и бевацизумаб (Авастин) - блокаторы всех изоформ VEGF.
Многочисленные научно-клинические исследования, посвященные применению этих препаратов у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией и экссудативной формой возрастной макулярной дегенерации, выявили их высокую эффективность: происходил быстрый регресс новообразованных сосудов сетчатки, и отмечалось повышение зрительных функций (Gragoudas Е. et al., 2004; Avery R.L., 2006; Davidorf F.H. et al., 2006; Chen C.Y. et al., 2007; Kourlas H. et al., 2007).
Однако, несмотря на высокую эффективность, препараты, блокирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста, особенно все его изоформы, продолжают вызывать некоторые опасения, связанные с их механизмом действия.
Из вышеизложенного следует актуальность изучения и разработки новых подходов в подавлении нежелательных патологических эффектов VEGF, что может стать значимым прорывом в лечении данных заболеваний.
В последнее время большой интерес вызывает антиангиогенный фактор с нейротрофическим действием - фактор пигментного эпителия (Pigment Epithelium-Derived Factor-PEDF). Он обладает мощной антиангиогенной активностью, ингибирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, которые играют основную роль в развитии патологической васкуляризации.
При применении PEDF на изолированных культурах эндотелиальных клеток было показано его ингибирующее действие на вызванную миграцию и пролиферацию данных клеток (Stellmach V. et al., 2001; Duh E.J. et al., 2002).
В ходе экспериментальных работ при применении PEDF на моделях ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации было выявлено подавление роста патологических сосудов (Duh EJ. et al., 2002; Apte R. et al, 2004).
На основании проведения клинических исследований было показано снижение уровней PEDF в водянистой влаге у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Boehm В.О. et al., 2003) и в стекловидном теле у пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией при возрастной макулодистрофии (Holekamp N.M. et al., 2002). Кроме этого, выявлено увеличение VEGF и уменьшение PEDF в стекловидном теле у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Ogata N., Nishikawa М. et al., 2002; Funatsu H. et al., 2006; Patel J.I. et al., 2006).
Помимо антиангиогенных свойств, PEDF обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными эффектами.
Было установлено, что PEDF является индуктором нейрональной дифференцировки клеток в культуре клеток ретинобластомы (Tombran-Tink J., 1989, 1991). Далее было установлено, что PEDF значительно увеличивает клеточную жизнеспособность в культурах нормальных мозжечковых гранулярных клетках, не оказывая влияния на митотическую активность (Taniwki Т. et al., 1995). Помимо этого, PEDF способствует дифференцировке и выживанию развивающихся спинных моторных нейронов (Houenou L. et al., 1999). PEDF обладает достаточно высокими нейротрофическими свойствами, как при хроническом, так и при остром нейротоксическом повреждении: активно защищает мозжечковые гранулярные клетки при глутаматном токсическом повреждении (Tanawaki Т. et al., 1997), поддерживает клеточную жизнеспособность за счет уменьшения апоптоза, вызванного перекисью водорода, в культуре крысиных ретинальных нейронов (Сао W. et al., 1999). PEDF поддерживает выживание фоторецепторов при наследственной дегенерации сетчатки у мышей (Cayouette М. et al., 1999) и на модели повреждения фоторецепторов, связанной с потерей пигментного эпителия (Jablonski М.М. et al., 2000), а также после воздействия повреждающих уровней освещенности (Pang I.H. et al., 2007).
При проведении клинических исследований было выявлено снижение уровня содержания PEDF в тканях глаза у пациентов с нейроретинальными дистрофическими заболеваниями (Ogata N. et al., 2004) и миопией высокой степени, особенно с хориоретинальной дистрофией (Ogata N. et al., 2005).
Поскольку PEDF является естественным антагонистом VEGF, представляется перспективным изучить применение именно этого фактора для лечения патологической неоваскуляризации. Однако, мы не нашли в литературе обоснования целесообразности и преимущества использования PEDF по сравнению с широко применяемым в настоящее время анти-VEGF препаратом - Авастином, также не было сравнений с нейротрофическим фактором головного мозга - BDNF, который играет важную роль в развитии зрительного анализатора и регуляции функциональной активности нейронов зрительного центра (Peinado-Ramon P. et al., 1996; Lodovichi С. et al., 2000; Quigley H.A. et al., 2000; Paskowitz Daniel M. et al., 2004).
В связи с этим, актуально проведение сравнительного анализа влияния PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.
Цель исследования: на основании сравнительного анализа оценить влияние PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.
Задачи исследования: 1. Изучить влияние рекомбинантного PEDF на состояние органотипических культур сетчатки и сравнить в условиях культивирования его нейротрофические и нейропротективные свойства с BDNF.
На органотипических культурах сетчатки провести сравнительный анализ антиангиогенньгх свойств рекомбинантного PEDF и анти-VEGF препарата - Авастина.
Разработать количественный метод морфометрического анализа экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации для выявления ее формирования, определения степени ее выраженности и оценки эффективности применения PEDF.
На модели ретинальной неоваскуляризации провести сравнительный анализ антиангиогенньгх свойств рекомбинантного PEDF и Авастина.
Оценить достоинства рекомбинантного PEDF для применения в клинической офтальмологии.
Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ влияния рекомбинантных факторов PEDF, BDNF и анти- VEGF препарата - Авастина на свойства органотипических культур сетчатки животных. Установлено, что PEDF также как BDNF обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными свойствами:РЕОР в дозе 0,5 \ig/ml и BDNF в дозе 0,1 u.g/ml культуральной среды увеличивают зону роста эксплантатов и клеточную жизнеспособность, активизируют процессы клеточноймиграции и роста РШ- тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; PEDF в дозе 0,5 (xg/ml также как Авастин в дозе 50 jj-g/тіобладает в культуральных условиях выраженной антиангиогенной активностью, так как снижается экспрессия фактора фон - Виллибранта.
На экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации разработан морфометрический метод количественного определения средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки. На основании корреляционного анализа результатов количественной морфометрии средней площади васкуляризации в пределах поверхностного
10 ретинального слоя и иммуногистохимического анализа пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки (определение индекса пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки) установлено, что система морфометрического анализа может служить объективным методом количественной оценки степени выраженности патологической неоваскуляризации сетчатки в эксперименте.
На экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации проведен сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и анти- VEGF препарата - Авастинаи установлена высокая эффективность PEDF. Показано, что интравитреальное введение PEDF в дозе 0,5 u.g также как и Авастина в дозе 50 fig вызывает выраженное уменьшение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя, без статистически значимых различий.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученныеэкспериментальные данные позволяют дополнить представления о PEDF - факторе пигментного эпителия и его значительной роли в механизме развития патологического ангиогенеза.
Показано, что метод количественного анализа результатов моделирования ретинальной неоваскуляризации может использоваться для оценки формирования и степени выраженности ретинальной неоваскуляризации в эксперименте.
Установлено, что PEDF имеет преимущества перед анти-VEGF препаратом — Авастином, так как проявляет антиангиогенные свойства в значительно меньшей концентрации и дополнительно обладает нейротрофическими и нейропротективными функциями. Поэтому PEDF может найти в дальнейшем применение в клинической практике для лечения тяжелых заболеваний сетчатки, связанных с патологической неоваскуляризацией.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Рекомбинантный PEDF в дозе 0,5 jxg/ml также как BDNF в дозе 0,1 ug/ml обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными свойствами в органотипических культурах сетчатки животных: наблюдается увеличение зоны роста эксплантатов, высокий уровень жизнеспособности клеток, а также активация процессов клеточной миграции и формирования (З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы.
Рекомбинантный PEDF в дозе 0,5 |ig/ml также как Авастин 50 ug/ml в органотипических культурах сетчатки животных обладает выраженными антиангиогенными свойствами о чем свидетельствует снижение уровня экспрессии фактора фон - Виллибранта.
Использование морфометрического метода количественной оценки ретинальной неваскуляризации путем определения средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки может служить достоверным методом выявления формирования и определения степени выраженности патологической неоваскуляризации сетчатки в эксперименте.
Рекомбинантный PEDF в дозе 0,5 ug; также как Авастин в дозе 50 jig при интравитреальном введении животным оказывает значительный антиангиогенный эффект, выражающийся в существенном уменьшении средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя на модели ретинальной неоваскуляризации.
Эндотелиальный сосудистый фактор роста-VEGF
Для определения новых стратегических направлений в лечении офтальмологических заболеваний, связанных с развитием неоваскуляризции, необходимо иметь четкое представление о механизмах развития патологического ангиогенеза. Регуляция процессов формирования новообразованных сосудов, с точки зрения современных представлений, осуществляется благодаря наличию системы, связанных между собой, стимулирующих и ингибирующих факторов. Нарушение баланса в этой системе - между ангиогенными и антиангиогенными факторами приводит к развитию патологического ангиогенеза (Merimee Т.J., 1990; McAvoy J.W. et al., 1990; Klagsbrun M. et al., 1991; D Amore P.A., 1994; Mocanu C, 2003; Peter A., 2006; Simo R. et al., 2006).
В настоящее время известно большое количество ангиогенных или, как их еще принято называть - вазопролиферативных факторов, которые прямо или опосредованно влияют на ангиогенез. К ним относятся кислый и основной фактор роста фибробластов (aFGF, bFGF), инсулиноподобный фактор роста, фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста b (TGF-b)(McAvoy J.W. et al., 1990). Повышение уровней этих агентов было зарегистрировано в стекловидном теле у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Grant М. et al., 1986; Sivalingam A. et al., 1990; Adamis A.P. et al., 1994; Aiello L.P. et al., 1994; Yoshida A. et al., 1998; Katsura Y. etal., 1998).
Ключевым фактором ангиогенеза в норме и патологии, благодаря его биологическим свойствам, принято считать эндотелиальный сосудистый фактор роста (Vascular Endothelial Growth Factor-VEGF) (Ferrara N. et al., 1989; Aiello L. P. et al., 1994; Aiello L. P. et al., 1995; Stone J. et al., 1995; Ferrara N., 2001; Ferrara N., 2004).
VEGF принадлежит к семейству пептидных факторов. В настоящее время идентифицировано 8 его изоформ, отличающихся по количеству образующих аминокислот; наиболее распространенной из которых является изоформа VEGF-165.
Экспрессируется VEGF в хориоидее и сетчатке - перицитах и эндотелиоцитах, клетках пигментного эпителия и клетках Мюллера, ганглионарных клетках и глиальных (Miller J. et al., 1994).
Основным стимулом к повышению его экспрессии является гипоксия (Simorre-Pmatel V. et al., 1994; Shima D. et al., 1995). Кроме того, установлено, что усиливают продукцию VEGF некоторые противовоспалительные цитокины (IL-1 и IL-6) и ростовые факторы (Epidermal Growth Factor, Transforming Growth Factor).
Основные биологические эффекты VEGF проявляются при его взаимодействии с двумя основными видами рецепторов — VEGFR1 и VEGFR2, расположенных преимущественно на эндотелиоцитах и клетках Мюллера. Активация рецепторов VEGFR2 в процессах ангиогенеза играет ключевую роль, так как приводит к повышению сосудистой проницаемости (GilleH. etal., 2001).
За счет взаимодействия с рецепторами VEGF индуцирует комплекс механизмов формирования сосудов, который включает в себя пролиферацию эндотелиоцитов, их миграцию и индукцию синтеза металлопротеиназ -ферментов, необходимых для инвазии новообразованных сосудов в окружающие ткани (Thieme Н. et al., 1995; Kim I. et al., 1999).
Большое количество экспериментальных работ подтверждают тесную связь VEGF с развитием неоваскуляризации сетчатки и радужки. Так, на экспериментальной модели тромбоза центральной вены сетчатки на приматах, кроликах и модели ретинопатии недоношенных на крысах показано, что экспрессия VEGF резко увеличивается и коррелирует с выраженностью неоваскуляризации (Alon Т. et al., 1995; Shima D. Т. et al., 1996). В экспериментах на трансгенных мышах с повышенным уровнем экспрессии VEGF наблюдалось развитие неососудов сетчатки (Tobe Т. et al., 1998). Интраокулярное введение VEGF в концентрации, соответствующей определяемой при неоваскуляризации, вызывает рубеоз радужки у здоровых приматов, а повторные инъекции ведут к развитию неоваскулярной глаукомы (Tolentino MJ. et al., 1996). В других работах была доказана необходимость присутствия VEGF для развития рубеоза радужки: при введении анти-УЕОР-моноклональных антител приматам с индуцированным тромбозом ЦВС наблюдался регресс неососудов или неоваскуляризация не развивалась вообще. Ингибирование VEGF частично предотвращает развитие неоваскуляризации сетчатки на модели ретинопатии недоношенных на мышах (Aiello L. P. et al., 1995).
Вторым важнейшим биологическим свойством VEGF является его способность повышать проницаемость сосудистой стенки. Установлено, что нарушение гематоофтальмического барьера VEGF вызывает путем повреждения эндотелиоцитов, опосредованного лейкоцитами (Joussen А. М. et al., 2001), формирования фенестр (Roberts W. G. et al., 1997), действия на плотные эндотелиальные контакты (Antonetti D. A. et al., 1999) и трансцеллюлярный транспорт (Qu Н. et al., 1995). Предполагается, что повышение концентрации VEGF является одним из механизмов развития отека сетчатки при тромбозе ЦВС и СД. Так, на экспериментальной модели СД у крыс была продемонстрирована зависимость раннего усиления проницаемости гемотоофтальмического барьера на уровне венул и капилляров от увеличения экспрессии VEGF (Qaum Т. et al., 2001).
Клинические исследования показали, что у пациентов с СД (Aiello L.P. et al., 1994) и тромбозом ЦВС (Malecaze F. et al., 1994) уровень VEGF в водянистой влаге, в стекловидном теле и в сетчатке повышен по сравнению с таковым у здоровых людей. Изменение его концентрации коррелируют с появлением, активностью и регрессом неоваскуляризации. Следует отметить, что уровень VEGF снижается после проведенной панретинальной ЛК (Boyd S. et al., 2002).
Экспериментальные модели в офтальмологии: органотипические культуры сетчатки и модель ретинальной неоваскуляризации у животных
В настоящее время в качестве экспериментальных моделей ряда патологий используются различные типы клеточных и тканевых культур. К преимуществам использования культур в экспериментальных исследованиях относят: - исследования, для проведения которых требуется большое количество экспериментальных животных, могут быть проведены с равной статистической достоверностью на достаточно небольшом количестве культурального материала; - возможность проведения тестирования экспериментального материала в соответствии с требованиями в определенные сроки и с необходимой периодичностью; - использование культурального материала позволяет исключить возможные воздействия со стороны нейро-гуморальной и других систем целостного организма; - клеточные и органотипические культуры имеют ряд преимуществ в исследованиях, направленных на изучение свойств различных препаратов, факторов и других соединений - возможность использовать минимальные количества исследуемого вещества и определить реальные значения скорости включения или метаболизма исследуемых соединений. Клеточная, тканевая и органотипическая культуры - метод сохранения клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма в жизнеспособном состоянии.
Начиная с 60-х гг. прошлого столетия, различные типы клеточных и тканевых культур сетчатки стали широко использоваться в офтальмологии как экспериментальные модели развития и патологии сетчатки. Недостатками клеточных культур являются: клеточные культуры, в отличие от тканевых и органотипических,лишены структурной организации, не имеют характерной гистиотипической архитектуры и связанных с ней характерных биохимических признаков. В клеточных культурах трудно контролировать динамические свойства культивируемых клеток и реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo. В связи с этим исследователи в настоящее время отдают предпочтение клеточным системам, сохраняющим структурную целостность исходной ткани. В последние годы в офтальмологии значительное внимание уделяется органным (органотипическим) культурам сетчатки (CaffeA.R., et al., 1993; Jaworowski A., etal., 1995; FinlayD., et al., 1996; GermerA., et al., 1997; Hoff A., et al, 1999; Rickman D.W., 1999). Органотипическое культивирование, по мнению авторов, позволяет максимально сохранить цитоархитиктонику сетчатки и помогает решать многие задачи, связанные с поддержанием определенных морфологических и функциональных соотношений в тканях глаза, выявлением процессов, участвующих в их регуляции.
С точки зрения некоторых авторов органное культивирование является незаменимым для проведения исследований, связанных с тестированием различных биологически активных соединений. Григорян Э.Н. и др. (1996, 1999) считает, что незаменимой моделью сетчатки является органотипически культивированная сетчатка взрослого тритона. Существенное преимущество этой модели, с точки зрения автора, заключается в том, что при культивировании зрелой сетчатки межклеточные взаимодействия в ней нарушаются частично и сохраняется основная организация. Это дает возможность анализировать влияние различных морфорегуляторных белков, ответственных за поддержание жизнеспособности нейральной сетчатки и функционирования. Однако перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. Клетки приобретают ряд особенностей, которые зависят как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro. Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и других черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo. Таким образом, целесообразно на предварительных этапах исследования использовать органотипические культуры сетчатки, на завершающих конечных стадиях эксперимента необходимо проведение исследований на животных. Увеличение частоты возникновения тяжелой патологии сетчатки, сопровождающейся патологическим ангиогенезом, привело к необходимости разработки новых подходов в лечении данной патологии. С этой целью, в настоящее время, широко используются различные экспериментальные модели патологической неоваскуляризации у животных. Одной из самых популярных теорий патогенеза пролиферативных заболеваний сетчатки, является «гипоксическая теория», согласно которой образование новых сосудов в эмбриональной сетчатке и неоваскуляризация при патологии сетчатки имеют много общего и связаны с выделением вазопролиферативного фактора в ответ на гипоксию. В связи с этим, ряд исследований был посвящен попытке воспроизведения экспериментальной модели патологической неоваскуляризации у животных воздействием переменного режима оксигенации.
Методы исследования органотипических культур сетчатки
Получение прижизненных фотографий клеток и флуоресцентных изображений проводили под инвертированным микроскопом Axsiovert 25 с приставкой mbq 52 ас а цветной камерой DP 500. Анализ фотографий проводился с помощью пакета программ AxioVision 3.1. Прижизненная визуализация морфологии эксплантатов и анализ фотографий проводили под бинокуляром Olympus CZX 20 с цифровой камерой DP50 и программным обеспеченьем к ней версии 1.1.1.1.
Морфологический (микроскопический) анализ - способность клеток выселяться, мигрировать, давать отростки и дифференцироваться. Для количественной оценки роста культивируемых эксплантатов использовали индекс площади (ИП) - отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100 %. Достоверность различий ИП в контрольных и опытных образцах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Анализ на жизнеспособность клеток эксплантата сетчатки Эксплантаты на 14, 21 и 30 сутки культивирования отбирали из культуральной системы и окрашивали йодидом пропидия (РІ) для выявления погибших клеток (они имели красную окраску, обусловленную комплексом проникшего в ядра РІ с ДНК клетки), а также использовали акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки (они имели зеленую окраску).
Посредством флуоресцентного микроскопа производили прямой подсчет жизнеспособных клеток и погибших клеток на равновеликих участках. Достоверность различий в контрольных и опытных образцах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Иммуногистохимический метод исследования На 30-е сутки эксплантаты фиксировали 4% раствором параформальдегида, при +40С, хранили в криосреде (смесь глицерина, этиленгликоля и PBS 1:1:3) при -200С до окрашивания антителами.
После промывания фиксированных прикрепленных эксплантатов в фосфатном буфере дно культуральной чашки просушивали, и эксплантаты с выселившимися клетками окружали гидрофобной полоской, после чего проводили их иммуногистохимическую окраску. Для этого использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру коммутированных нейробластов - (З-Ш-тубулину (mouse antiubulin, betta III isoform monoclonal antibody) в разведении 1:100 (Chemicon, МАВ 1637) и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток - кислому глиальному фибриллярному белку - GFAP (anti-glial fibrillary acidic protein) в разведении 1:80 (Sigma, G9269). Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов при 4С. После промывки в фосфатном буфере, эксплантаты покрывали смесью вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши, меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении), оба в разведении 1:100. Обработку вторичными антителами проводили 2 часа при комнатной температуре. После чего эксплантаты промывали в фосфатном буфере.
Анализ иммуногистохимических препаратов проводили под инвертированным микроскопом Olimpus КХ-100 с камерой Delta Pix 5000 и объективами 10х и 20х. Применяли метод конфокальной микроскопии на базе микроскопа Lieca TCS SPE с программным обеспеченьем Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF) и объективом 40x.
Для анализа антиангиогенных свойств был проведен Вестерн - блот анализ. Для этого использовали эксплантаты, культивируемые с PEDF, Авастином и эксплантаты из группы контроля. Метод основывается на определении количества экспрессируемого фактора фон-Виллебранда, который синтезируется в эндотелиальных клетках, являясь внутриклеточным протеином специфичным для данного типа клеток.
Для проведения метода приготавливали клеточные лизаты опытных и контрольных образцов при помощи Reporter Lysis Buffer. После обработки лизирующим раствором чашки помещали в жидкий азот на несколько секунд, а потом в термостат при +37 на 10 мин. Полученный лизат центрифугировали и наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) с раствором для прокрашивания:
Для переноса на мембрану использовали режим переноса 2мА/см2 (стабилизация по току) 2 часа и напряжение не более 20В. Затем мембрану окрашивали Ponceau Red 3-5 минут на шейкере, чтобы проконтролировать наличие белка на мембране. Затем отмывали мембрану в буфере TBST 3 раза по 5 минут. Мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами (anti-von Willibrand Faktor разведение 1:1000) в 15 мл TBST ночь при +4С. Затем мембрану отмывали 15 минут в TBST буфере2 раза по 10 минут на шейкере. После этого мембрану инкубировали с вторичными антителами (antirabbit, конъюгированные с пероксидазой хрена; разведение 1:10000) 1,5 мл на 15 мл TBST ночь при +4С. Мембрану промывали в 20 мл TBST (15 минут два раза по 10 минут на шейкере). Белки визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (GE Healthcare). Правильность нанесения порций белка на дорожки контролировали при помощи визуализации актина на мембране. Мембрану инкубировали с первичными антителами (actin с-2, разведение 1:1000) по методике, описанной выше. Затем со вторичными антителами (антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена; в разведении 1:10000) и проявляли по методике, описанной выше. Работа проведена на 44 крысах (88 глаз) породы albino Wistar, выращенных в питомнике лабораторных животных «Столбовая» Российской Академии Медицинских Наук. Исследования проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (National Academy press, 1996). Животные были разделены на 4 группы, в каждой по 11 штук, три - с воспроизведенной экспериментальной моделью патологической неовасакуляризации и контрольная группа - без экспериментальной модели (контрольная группа -1). В первой экспериментальной группе животным было произведено интравитреальноевведениеРЕБР в дозе 0,5 jig, во второй авастина в дозе - 50 ig, третья группа являлась второй контрольной - с экспериментальной моделью патологической неоваскуляризации без лечения (контрольная группа -2).
Влияние PEDF на состояние сетчатки экспериментальных животных
На 30 сутки культивирования после иммуногистохимической окраски в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с PEDF и BDNF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых значительно больше, чем на 21 сутки. В этих эксплантатах было обнаружено большое количество GFAP-иммунонегативных- ріІІ-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата и образующими разветвленную сеть (рис. 25, 26). Наличие экспрессии р-Ш тубулина свидетельствуете принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле и в эксплантатах, культивируемых с Авастином происходило расселение GFAP-позитивных клеток. Клетки, экспрессирующие (ЗШ-тубулин, в контроле и в культурах, культивируемых с Авастином, были выявлены только в глубине эксплантатов, в небольшом количестве. При этом аксоноподобные ріІІ-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и очень редко выходили за его пределы, в отличие от опыта (рис. 27, 28).
Таким образом, иммуногистохимическое исследование показало, что в органотипических культурах сетчатки, при культивировании с PEDF наблюдается развитие активных процессов клеточноймиграции и роста рШ-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы, также как в присутствии BDNF, в отличие от контроля и эксплантатов, культивируемых с Авастином, где происходит расселение в основном только GFAP-позитивных клеток.
Таким образом, по результатам исследования установлено, что в органотипических культурах сетчатки при культивировании с PEDF в концентрации 0,5 ig/ml зона роста эксплантатов увеличивается в 3 раза, по сравнению с контролем и Авастином, и соответствует зоне роста эксплантатов при культивировании с BDNF; жизнеспособность клеток увеличивается в 3,3 и в 2,5 раза по сравнению с контролем и Авастином соответственно, по сравнению с BDNF - в 1,2 раза меньше.
Установлено, что в органотипических культурах сетчатки, при культивировании с PEDF и BDNF наблюдается развитие активных процессов клеточноймиграции и роста рТИ- тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы, выходящих за пределы эксплантата. Эти данные свидетельствуют о наличии у PEDF выраженных нейротрофических и нейропротективных свойств, сопоставимых с BDNF.
Выявлено, что в органотипических культурах сетчатки при культивировании с PEDF и Авастином экспрессия фактора фон - Виллибранта в два раза меньше, чем в контроле. Полученный результат свидетельствует о том, что PEDF обладает выраженными антиангиогенными свойствами, которые сопоставимы с Авастином.
После вывода животных из опыта, в результате проведения патоморфологических исследований тотальных препаратов сетчатки после интравитреального введения PEDF в дозе 0,5 \ig, никаких изменений структуры сетчатки выявлено не было, нетипично расположенных клеток не обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения не выявлено.
Характеристика экспериментального материала Животные были разделены на 4 группы: три - с воспроизведенной экспериментальной моделью патологической неовасакуляризации и контрольная группа - без экспериментальной модели (контрольная группа -1).
В первой экспериментальной группе животным было произведено интравитреальноевведение в опытные глаза (OD) PEDF в дозе 0,5 fig, во второй- авастина — 50 \ig. Третья группа являлась второй контрольной - с экспериментальной моделью патологической неоваскуляризации без лечения (контрольная группа -2). В контрольный глаз (OS) в первой и второй экспериментальных группах вводили объем сбалансированного физиологического раствора (СФР), эквивалентный используемому опытному объему. Для подтверждения возникновения патологической ретинальной неоваскуляризации у экспериментальных животных с помощью разработанного количественного морфометрического метода были проведены следующие исследования: 1. Количественная оценка площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя в контрольной группе -1 (рис. 30) и контрольной группе -2 (рис. 31). 2. Измерение среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки в контрольной группе -1 (рис. 32) и контрольной группе 2 (рис. 33). Кроме этого, проведен анализ парафиновых полутонких срезов сетчатки, окрашенных маркером Кі-67 на пролиферативную активность клеток сосудов в этих группах (индекс пролиферативной активности). Для определения статистической взаимосвязи между показателями индекса пролиферативной активности сосудов и средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя использовали расчет коэффициента корреляции в контрольной группе - 2 (с экспериментальной моделью без лечения).
