Введение к работе
Актуальность проблемы
Процессы восстановления утраченных функций печени под воздействием ксенотрансплантации культур клеток до настоящего времени остаются недостаточно изученными. В медицине используются свиные ткани, в том числе биоискусственные системы при различных вариантах печеночной недостаточности (Онищенко Н.А. с соавт, 1999; Соловьев В.В., 2001), трансплантация островков Лангерганса - при лечении сахарного диабета (Aoki Т. et al, 2005; Шумаков В.И. с соавт, 2006). Предлагается использовать ксенотрансплантацию гепатоцитов в качестве временной меры перед аллотрансплантацией печени (Ise A. et al, 2004; Aoki Т. et al, 2005; Fiegel H.C. et al, 2008; Weber A. et al, 2009).
Известно применение ксеноселезенки для лечения больных с иммунными нарушениями (Цыпин А.Б., 1980; Бородин Ю.И., 1998) и в условиях хирургической инфекции (Чикаев В.Ф. с соавт., 2000), причем лечебное воздействие объясняется эффектами биологически активных веществ ксеноселезенки и непосредственным воздействием живых клеток (Цыпин А.Б. с соавт., 1992; БородинЮ.И. с соавт, 1999). Известны саногенные эффекты воздействия ксенотрансплантации культуры клеток селезенки при постспленэктомическом гипоспленизме (Апарцин К.А., 2001).
Литературные данные свидетельствуют о том, что клетки, выделенные из органа, сохраняют функциональные свойства и характерную структуру (Гальперин Э.И., 1978; Van de Kerkhove М.Р., 2004; Castell J.V. et al, 2009).
До настоящего времени разрабатываются технологии выделения (Gourlay W. А. et al, 1999; Рябинин В.Е., 2002; Castell J.V. et al, 2009), культивирования и криокон-сервации (Wang S. Y. et al., 1998; Лебединский A.C. с соавт., 2003; Колокольцова Т.Д., 2008) клеток печени и селезенки, дискутируются оптимальные способы их введения в организм реципиента (Ota Н. et al, 1997; Кузнецов СИ., 1997; Мамхегова Т.Р., 1998; SgroiAetal, 2009).
Известно, что трансплантированные изолированные гепатоциты не столько увеличивают функционирующую массу печени, сколько изменяют гуморальные и молекулярные механизмы, отвечающие за активацию функций оставшихся гепатоцитов реципиента и регенерацию путем выработки регуляторных пептидов, среди которых ведущая роль принадлежит факторам роста (Shirnizu М. et al., 2001; Liu К.Х. et al., 2009). Среди известных факторов роста выделяют один, обладающий наиболее выраженным митогенным эффектом на гепатоциты - фактор роста гепатоцитов. Ответственными за выработку этого фактора являются клетки Ито, а также эндотелиальные и купферовские клетки печени, ретикулярные клетки селезенки. Эмбриональная ткань печени содержит большое количество фактора роста гепатоцитов и его рецепторов; гепатоциты зародыша в первом триместре развития активно отвечают на стимуляцию фактором роста гепатоцитов (Yamaguchi Y et al., 1997; Shikanai M. et al, 2009).
Спектр эффектов фактора роста гепатоцитов многообразен. Прежде всего, это модулятор митогенеза гепатоцитов; показана стимуляция активности других эпителиальных клеток, эндотелия. Воздействие этого фактора обеспечивает рост
и регенерацию не только печени, но других органов - почек, легких, кожи. Существуют прямые указания на протекторное воздействие фактора роста гепатоцитов на клетки печени при остром токсическом повреждении, индуцированном ЧХУ а также улучшение конъюгации билирубина и транспорта желчи (Wolf Н.К., Michalopoulos G.K., 1992; Ido A. et al, 2008). Кроме стимуляции митогенеза, он способен вызывать миграцию эпителиальных клеток, стимулировать морфогенез (Miki С. et al, 1999; Li Z. et al, 2007).
Таким образом, выяснение механизмов саногенеза представляется ключевым для понимания эффектов трансплантации клеток.
Цель исследования: определить закономерности развития и саногенетические механизмы острой печеночной недостаточности под влиянием ксенотрансплантации культуры клеток печени и селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.
Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
-
Разработать технологию получения ассоциированной культуры клеток печени или селезенки свиньи с высоким показателем жизнеспособности после длительной криоконсервации.
-
Исследовать закономерности продукции фактора роста гепатоцитов эмбриональными и неонатальными клетками печени или селезенки свиньи в динамике культивирования.
-
Оценить жизнеспособность и иммуногенность криоконсервированной культуры клеток печени или селезенки свиньи при подкожной трансплантации крысе на модели острой печеночной недостаточности, вызванной острым токсическим повреждением, обширной резекцией или воспалительным повреждением вследствие аспленизации.
-
Исследовать эффекты ксенотрансплантации культуры клеток печени или селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов на течение печеночной недостаточности, вызванной острым токсическим повреждением.
-
Раскрыть механизмы саногенеза и стимуляции мито генной активности гепатоцитов под воздействием ксенотрансплантации клеток печени или селезенки в условиях острой пострезекционной печеночной недостаточности.
-
Раскрыть патогенетические механизмы формирования печеночной недостаточности вследствие воспалительного повреждения печени, индуцированного аспленизацией и на этой модели оценить эффективность ксенотрансплантации клеток печени или селезенки.
-
Существенно расширить концепцию саногенеза острой печеночной недостаточности под воздействием ксенотрансплантации клеток печени или селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.
Научная новизна
Установлена высокая эффективность разработанной технологии выделения, культивирования и криоконсервации эмбриональных и неонатальных клеток печени
и селезенки свиньи, обеспечивающая высокую жизнеспособность полученного материала после длительного (до 6 месяцев) хранения.
Приготовление клеточных ассоциатов в процессе культивирования позволяет воссоздать микроэкологию печени in vitro и повышает функционирование ассоциатов после трансплантации реципиенту.
Впервые выявлена продукция фактора роста гепатоцитов в процессе культивирования ассоциированных клеток печени или селезенки. Динамика концентрации фактора роста гепатоцитов в кулыуральной среде положена в основу способа оценки жизнеспособности клеточного материала. Доказано, что уровень фактора роста гепатоцитов в культуре клеток селезенки выше, чем в культуре клеток печени.
В эксперименте на крысах породы Вистар описана острая печеночная недостаточность на фоне воспалительного повреждения печени, вызванного асплени-зацией, и на этой модели выявлена эффективность коррекции с помощью ксено-трансплантации культуры клеток печени, а также культуры клеток селезенки.
Получено подтверждение гипотезы, согласно которой эффекты ксенотран-сплантации клеток печени и селезенки совпадают с эффектами фактора роста гепатоцитов при острой печеночной недостаточности. В рамках этой гипотезы экспериментально установлена эффективность коррекции печеночной недостаточности токсического и воспалительного генеза с помощью ксенотрансплантации культуры клеток селезенки как продуцента фактора роста гепатоцитов.
Разработана концепция саногенеза острой печеночной недостаточности под воздействием ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток печени и селезенки - продуцентов фактора роста гепатоцитов. Установлена саногенети-ческая роль воздействия повышенных концентраций фактора роста гепатоцитов, вырабатываемого перенесенным материалом, что дополняет метаболическую активность пересаженных органоспецифических клеток при печеночной недостаточности на фоне острого токсического или воспалительного повреждения печени.
Выявленные закономерности положены в основу алгоритма коррекции острой печеночной недостаточности клетками печени и селезенки в зависимости от ее генеза.
Практическая значимость работы
Разработана технология забора, выделения и культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки, позволяющая получать криоконсер-вированный материал с высокой степенью жизнеспособности и продукцией HGF после подготовки к трансплантации.
Предложены оригинальные среды для криоконсервации культур эмбриональных клеток печени и селезенки («Среда для консервации клеток печени», патент РФ № 2161198, дата получения 15.01.2001 г; «Среда для криоконсервации клеток селезенки», патент РФ № 2194753, дата получения 08.01.2001 г). Разработан оригинальный подход в оценке жизнеспособности культивируемого материала («Способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени», патент РФ № 2366704, дата получения 10.09.2009 г).
Показана целесообразность использования при лечении острой печеночной недостаточности клеточных ассоциатов, обладающих выраженной биорегулятор-ной активностью.
Для изучения роли бактериальной транслокации методом динамической и статической сцинтиграфии в патогенезе повреждения печени после апленизации, разработан способ маркировки бактерии Е. coli 99mTc («Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований» патент РФ № 2290643, дата получения 27.12.2006 г.).
Новая концепция печеночной недостаточности при постспленэктомическом гипоспленизме позволила разработать патогенетически обоснованный метод коррекции в эксперименте.
Предложен оригинальный способ коррекции пострезекционной печеночной недостаточности («Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте», патент РФ № 2232550, дата получения 20.07.2004 г.).
Разработанные технологии позволили снизить летальность при ОПН различного генеза в эксперименте. При 90% резекции печени уровень летальности снижен со 100 до 56,6 %, при токсическом повреждении - до 36,7 %, при постспленэкто-мической ОПН - со 100 до 23,3 %.
Дано экспериментальное обоснование и доказана эффективность ксенотран-сплантации криоконсервированной культуры клеток селезенки, криоконсерви-рованной культуры эмбриональных клеток печени и неонатальных гепатоцитов свиньи при острой печеночной недостаточности в зависимости от ее генеза.
Внедрение в практику
Разработанные технологии забора, выделения, культивации и криоконсервации эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки, позволяющие получать клеточный материал с высокой степенью жизнеспособности после подготовки к трансплантации, внедрены в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН.
Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии Иркутского государственного медицинского университета, Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН и биолого-почвенного факультета Иркутского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту:
-
Продукция фактора роста гепатоцитов в среду культивации является критерием эффективности выделения и культивирования эмбриональных и неонатальных клеток печени и селезенки свиньи, позволяющих получить высоко жизнеспособный криоконсервированный материал для ксенотрансплантации.
-
Аспленизация животных сопровождается развитием острой печеночной недостаточности воспалительного генеза.
-
Ксенотрансплантаціє! криоконсервированной культуры клеток, продуцирующих фактор роста гепатоцитов в организме донора, - эффективный метод коррекции острой печеночной недостаточности токсического и воспалительного генеза.
4. Саногенетические механизмы воздействия ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток печени и селезенки зависят от генеза печеночной недостаточности и связаны с одной стороны с уровнем продукции перенесенными клетками фактора роста гепатоцитов, с другой - с их протективной функцией.
Апробация работы
Материалы исследования были представлены на Всероссийской конференции «Реконструкция - основа современной хирургии» (Москва, 1999), Международном съезде гастроэнтерологов «GASTRO-99» (Vancouver, Canada, 1999), 9-м международном конгрессе гастрохирургов (Nagasaki, Japan, 1999), Всероссийской конференции «Новые направления в клинической медицине» (Ленинск-Кузнецкий, 2000), межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии» (Омск, 2000), Международном симпозиуме «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2000), Общероссийской конференции с международным участием «Проблемы морфологии: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2002), XII Всероссийской научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2004), Всероссийской научной конференции «Восстановительные и органосохраняющие технологии - главный путь развития хирургии XXI века» (Москва, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004), VI Международном конгрессе «Науки о человеке» (Томск, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), XIII научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2005), Научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005), XII Международной конференции хирургов-гепатологов стран СНГ и X научно-практической конференции «Вахидовские чтения - 2005» «Актуальные проблемы хирургической гепатологии» (Ташкент, Узбекистан, 2005), научно-практической конференции «Высокотехнологические методы диагностики и лечения в абдоминальной хирургии - проблемы визуализации» (Москва, 2006), ХПІ Международной конференции хирургов-гепатологов стран СНГ (Алматы, Казахстан, 2006), Международной медицинской научной конференции между Автономной Республикой Внутренней Монголией КНР и Республикой Бурятия РФ: (Маньчжурия, Китай, 2007), VII Всероссийской научно-практической конференции РАСХИ (Москва, 2008).
