Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование фосфатидилинозитол-4,5-би-фосфат (Р1Р2)-опосредованных сигнальных путей представляет собой новое и быстро развивающееся направление в области клеточной сигнальной трансдук-ции [Hilgemann D. W. et al, 2001; Suh В. С, Hille В., 2005; Di Paolo G., De Camilli P., 2006]. На протяжении последнего десятилетия наблюдается бурное открытие PIP2-чувствительных мембранных транспортных белков, многие из которых являются ионными каналами и транспортёрами [Berridge М. J. et al., 1989; Ma L., et al, 1998; Yin H. L., Janmey P. A., 2003; GamperN., Shapiro M. S.,2007].
Фосфоинозитидная модуляция мембранных белков в нейронах оказывает существенный эффект на нейрональную возбудимость и синаптическое транс-миттерное высвобождение. Особенности комплексных сигнальных механизмов, регулирующих мембранные белки, представляют собой интригующее множество задач для дальнейшего исследования [Gamper N., Shapiro М. S., 2007].
Многочисленные современные данные об участии киназных сигнальных путей в регуляции моноаминовых рецепторов и транспортёров раскрывают новую модальность передачи сигнала в мозге [Jacinto Е. et al., 2006; Gonz'alez-Maeso J. et al., 2008; Beaulieu J.-M. et al., 2009]. PIP2 образуется при фосфорили-ровании фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназой тип 2 альфа (PIP5K2A) [Yin Н. L., Janmey Р. А., 2003; Rameh L. Е. et al, 1997; Roth М. G. et al, 2004], в связи с чем её физиологическое и патофизиологическое значение в регуляции нейро-нальной активности является самым непосредственным. Недавно были получены доказательства ассоциации между мутацией (N251S)-PIP5K2A и шизофренией [Stopkova P. et al., 2003; Stopkova P. et al, 2005; Schwab S. G. et al., 2006; Bakker S. C. et al, 2007; He Z. et al, 2007; Lang U. E. et al, 2007].
Шизофрения представляет собой тяжёлое психическое заболевание не установленной этиологии, склонное к хроническому течению, которым страдает приблизительно 1 % населения [Inta D. et al., 2009]. Несмотря на колоссальные усилия, затраченные на выяснение этиопатогенеза этого заболевания, фундаментальные нейробиологические процессы, ведущие к шизофрении, остаются до сих пор не до конца расшифрованными.
Дофаминовая теория шизофрении, основоположником которой является Арвид Карлсон, постулирует дисфункцию дофаминергической нейротрансмит-терной системы [Carlsson А., 1988]. Она основана на психодислептических эффектах дофаминовых агонистов [Wallis G. G. et al., 1949; Angrist В., Gershon S., 1977] а также на способности типичных антипсихотических препаратов, являющихся антагонистами дофаминовых рецепторов 2 (D2) лечить позитивные симптомы (бред, галлюцинации) шизофрении [Van Rossum J. М., 1966; Seeman P. et al., 1976; Creese I. et al., 1976]. Тем не менее, попытки объяснить заболевание исключительно в выражении дофаминергической дисфункции, оставляют много аспектов шизофрении неразрешёнными. Тот клинический факт, что D2-блокада значительно менее эффективна при лечении негативных симптомов (таких как социальный аутизм, отсутствие мотивации или когнитивные изме-
нения, включая дефицит внимания и рабочей памяти) указывает на вовлечение других, отличных от дофаминовых, механизмов [Inta D. et al., 2009].
Глутаматергическая гипотеза в изначальной форме постулирует, что ги-поглутаматергические состояния и гипофункция NMDA рецепторов представляют основные элементы патофизиологии заболевания [Olney J. W., Farber N. В., 1995]. Недавно была предложена теоретическая модель изменений на уровне нейрональной сети, объясняющая когнитивные дефициты и негативные симптомы при шизофрении. Согласно этой концепции, дисфункции NMDA рецепторов, локализованных на парвальбумин-позитивных GABA-ергических интернейронах представляют собой ключевые элементы, определяющие как рас-тормаживание глутаматергических нейронов, так и нарушения осцилляции мозга [Lewis D. A., Moghaddam В., 2006; Lisman J. Е. et al., 2008]. В последнее время общий интерес к исследованиям глутаматергической системы при шизофрении многократно возрос в связи с успешными клиническими испытаниями антипсихотического вещества, действующего на метаботрофные глутамат-ные рецепторы [Patil S. Т. et al., 2007].
Несмотря на противопоставление дофаминергических и глутаматергических механизмов в историческом аспекте, ни одна унитарная нейротрансмит-терная гипотеза не может полностью объяснить это комплексное гетерогенное заболевание [IntaD. et al., 2009].
Фактически, глутаматная и дофаминовая системы тесно взаимодействуют как в регуляции нормальной кортикальной активности, относящейся к познанию [Durstewitz D. et al., 2000; Seamans J. К., Yang С. R., 2004], во взаимодействиях между префронтальной корой, средним мозгом и стриатумом, имеющим отношение к шизофрении [Sesack S. R. et al., 2003], так и в контексте генетического риска заболевания [Tan Н. W. et al., 2007]. Поэтому сейчас эти теории существуют не отдельно, а во взаимодействии, постулируя сбалансированность между ингибирующими дофаминергическими и ингибирующи-ми глутаматергическими нейронами. Дефицит глутаматной трансмиссии может приводить к дофаминовой дисфункции, ассоциированной с шизофренией, и дофаминовые изменения, в свою очередь, могут усиливать дефицит глутаматной трансмиссии.
Недавно опубликованные доказательства тесной связи между функционированием KCNQ (Kv7) калиевых каналов и дофаминергической нейротранс-миттерной активностью возможно трансформировать в современные парадигмы болезненных состояний, таких как шизофрения, характеризующихся повышенной дофаминергической активностью. Базальная активность дофаминергических нейронов угнетается KCNQ (Kv7) каналами [Hansen Н. Н. et al., 2006; Hansen Н. Н. et al., 2007], физиологическая роль которых заключается в стабилизации нейронального потенциала покоя [Jentsch Т. J. et al., 2000; Vervaeke К. et al., 2006; Ни H. et al., 2007]. Активация Kv7 каналов приводит к бимодальному ингибиторному эффекту на пресинаптическую дофаминергическую ней-ротрансмиссию в стриатуме, гиппокампе и коре, т.е. снижению как терминального синтеза, так и высвобождения дофамина [Mikkelsen J. D., 2004; Martire M. et al, 2004, 2007; Hansen H. H. et al, 2006; Hansen H. H. et al, 2007].
Известно, что KCNQ каналы требуют для своего открытия PIP2, а их ин-гибирование в основном происходит при снижении мембранных уровней РІРг [Delmas P., Brown D. A., 2005]. Модуляция KCNQ калиевых каналов может существенно влиять на дофаминергическую нейротрансмиссию при шизофрении [Gupta P. D. et al., 2004; Dalby-Brown W. et al., 2006]. Кроме того, модуляторы Kv7 каналов также влияют на высвобождение других нейротрансмиттеров, включая глутамат [Martire М. et al., 2004].
Многочисленные современные исследования сосредоточились на изучении молекулярных механизмов регуляции нейрональных транспортных систем, особенно нейронального глутаматного аминокислотного транспортёра ЕААТЗ, связанного с нейрональной активностью, который вовлечён в патофизиологию шизофрении [Smith R. Е. et al., 2001; McCullumsmith R. Е., Meador-Woodruff J. H., 2002; Kim J. H. et al, 2005; Huerta I. et al., 2006; Deng X. et al, 2007; Lang U. E. et al., 2007; Nudmamud-Thanoi S. et al., 2007].
Важная роль в нервной системе организма принадлежит нейростероиду дегидроэпиандростерону (ДГЭА). Многочисленные независимые исследования показали, что стероид и его сульфатный эфир (ДГЭАС) модулируют продолжительность жизни нейронов [Shin С. Y. et al., 2001; Kaasik A. et al., 2003; Kurata К. et al., 2004; Xilouri M., Papazafiri P., 2006], развитие мозга [Compagnone N. A., Mellon S. H., 1998], познание [Frye С A., Lacey E. H., 1999; Migues P. V. et al, 2002], поведение [Nicolas L. B. et al, 2001; Fedotova J., Sapronov N., 2004; Maayan R. et al., 2006], а также ассоциированы со многими психическими заболеваниями [Perez-Neri I. et al., 2008]. Эффекты ДГЭА и ДГЭАС на нервную систему опосредованы модуляцией нескольких нейротрансмиттерных систем, включая дофаминовую и глутаматную [Perez-Neri I. et al., 2008; Zheng P., 2009].
На молекулярном уровне нейроактивные стероиды могут присоединяться к внутриклеточным рецепторам и регулировать экспрессию генов. Также они действуют на уровне нейротрансмиттерных рецепторов и потенциал-зависимых ионных каналов, особенно GABAA, NMDA, АМРА, глициновых, серотонино-вых, никотиновых и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов [Rupprecht R. et al., 2001; Dubrovsky В., 2006; Strous R. D. et al, 2006], а также Ca2+, Na+, K+ и анионных каналов [Nakashima Y. M. et al., 1998; Nakashima Y. M. et al., 1999; Kelly M. J. et al., 2002; Carrer H. F. et al, 2003; Todorovic S. M. et al., 2004; Rbandi-Tonkabon R. et al., 2004; Pathirathna S. et al., 2005; Joksovic P. M. et al., 2007; Cheng Z. X. et al., 2008].
Результаты последних исследований подтверждают важную роль ДГЭА в патологии и лечении шизофрении [Pisu М. G., Serra М., 2004; Иванова С. А., Семке А. В., 2006; Marx СЕ. et al., 2006; MacKenzie Е. М. et al., 2007; Morrow A. L., 2007].
В связи с тем, что очень сложно исследовать in situ молекулярные сигнальные пути, принимающие участие в регуляции нейрональных ионных каналов и транспортёров, традиционно используется Xenopus laevis ооцитная экс-прессирующая модель. Сочетание биохимических, электрофизиологических и молекулярно-генетических методов, применяемых к единичному ооциту, создаёт исключительные условия для получения информации о биогенезе, струк-
турно-функциональных отношениях и модуляции плазматических мембранных белков [Stuhmer W., 1992; Tsiuriupa G. Р, Pashkov V. N., 1994; Romero M. F., 1998; Stuhmer W., 1998; Bezanilla F., Stefani E., 1998; Hilgemann D. W., Lu C, 1998; Kaneko S. et al., 1998; Stefani E., Bezanilla F., 1998; Sigel E., Minier F., 2005].
Кроме того, информативным методом изучения нейрональной активности является исследование уровня неиростероидов в сыворотке крови, поскольку они синтезируются как в мозге, так и на периферии [Friess Е. et al., 2000; Baulieu Е. Е. et al., 2001; Schumacher M. et al., 2000]. Более того, нейростероиды являются единственными гуморальными факторами, концентрация которых в плазме коррелирует с концентрацией в мозге [Yilmaz N. et al., 2007]. Поэтому нейростероидные аспекты нейрональной активности возможно тестировать по уровню неиростероидов в крови.
Судя по растущему списку РІРг-чувствительньїх ионных каналов и транспортёров [Suh В. С, НШе В., 2005], большинство из них, по крайней мере до некоторой степени, чувствительны к РІРг. Вместе с тем следует отметить, что функциональная активность РІР5К2А киназы и её мутантной формы (N251S)-РІР5К2А, ассоциированной с шизофренией, в отношении нейрональных калиевых KCNQ каналов и глутаматных ЕААТЗ транспортёров не изучена. Комплексного изучения динамики содержания нейростероида дегидроэпианд-ростерона сульфата у больных шизофренией в зависимости от клинических особенностей течения заболевания и применяемой терапии не было проведено. В связи с вышеизложенным были сформулированы цель и задачи диссертационной работы.
Цель работы: Изучить механизмы протеинкиназной регуляции нейрональных калиевых KCNQ каналов и глутаматных ЕААТЗ транспортёров и содержание неиростероидов на модели ДГЭАС при шизофрении.
Задачи исследования:
-
Изучить функциональную регуляцию нейрональных KCNQ калиевых каналов нейрональной PIP5K2A киназой в Xenopus laevis ооцитной экспресси-рующей системе.
-
Протестировать действие дифосфорилированных фосфоинозитидов на работу нейрональных KCNQ калиевых каналов в Xenopus laevis ооцитной экс-прессирующей системе.
-
Исследовать влияние мутантной формы (N251S)-PIP5K2A киназы, ассоциированной с шизофренией, на активность нейрональных KCNQ калиевых каналов в Xenopus laevis ооцитной экспрессирующей системе.
4. Изучить функциональную регуляцию нейрональных глутаматных
транспортёров ЕААТЗ нейрональной PIP5K2A киназой в Xenopus laevis ооцит
ной экспрессирующей системе.
5. Оценить влияние мутантной формы (N251S)-PIP5K2A киназы, ассо
циированной с шизофренией, на активность нейрональных глутаматных транс
портёров ЕААТЗ в Xenopus laevis ооцитной экспрессирующей системе.
-
Исследовать влияние дикого типа PIP5K2A киназы и мутантной формы (N251S)-PIP5K2A киназы, ассоциированной с шизофренией, на экспрессию ЕААТЗ белка на клеточной мембране человеческих эмбрионных почечных НЕК293 клеток.
-
Изучить регуляцию KCNQ4 калиевых каналов KCNE субъединицами в Xenopus laevis ооцитной экспрессирующей системе.
-
Протестировать уровень сывороточного нейростероида дегидроэпиан-дростерон-сульфата у больных шизофренией.
Положения, выносимые на защиту:
-
Нейрональная PIP5K2A киназа является функциональным модулятором гетеромерных нейрональных калиевых KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 каналов, в то время как гомомерные KCNQ2 и KCNQ5 подтипы нейрональных калиевых каналов не обладают чувствительностью к нейрональной PIP5K2A.
-
Выявлен новый механизм регулирования нейрональных глутаматных транспортёров ЕААТЗ нейрональной фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназой (тип 2 альфа).
-
Мутация (N251S)-PIP5K2A, ассоциированная с шизофренией, вносит вклад в формирование дофаминергического-глутаматергического дисбаланса при шизофрении. Мутация (N251S)-PIP5K2A нарушает функциональную регуляцию нейрональных калиевых KCNQ каналов, что способствует повышенной дофаминергической нейротрансмиссии при шизофрении и препятствует нормальной функциональной регуляции нейрональных глутаматных транспортёров ЕААТЗ, что играет роль в нарушении метаболизма глутамата в мозге у больных шизофренией, носителей этой мутации.
-
Трёхмерная модель мутантной формы (N251S)-PIP5K2A демонстрирует изменение структурно-функциональной интегрированности каталитического домена киназы, ответственное за нарушение каталитической функции фермента.
-
Уровень сывороточного нейростероида ДГЭАС у больных шизофренией сопряжен с клиническим полиморфизмом, характеристиками течения заболевания и применяемой терапией.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено комплексное исследование функциональной регуляции нейрональной PIP5K2A киназой и её мутантной формы (N25IS)- PIP5K2A, ассоциированной с шизофренией нейрональных KCNQ калиевых каналов и глутаматных ЕААТЗ транспортёров в Xenopus laevis ооцитной экспрессирующей системе. Обнаружено значительное увеличение амплитуды токов гетеромерных нейрональных KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 калиевых каналов при коэкспрессии с PIP5K2A, не сопровождаемое заметными изменениями в кинетике работы каналов (без сдвига потенциальной зависимости и изменения временного цикла активации - дезактивации). Выявлено, что гомомерные KCNQ2 и KCNQ5 подтипы нейрональных калиевых каналов не обладают чувствительностью к нейрональной PIP5K2A.
Впервые обнаружено, что мутантная форма (N251S)-PIP5K2A киназы не оказывает стимулирующего эффекта на работу нейрональных гетеромерных KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 калиевых каналов. Обнаружено угнетающее действие мутантной киназы на KCNQ2 и KCNQ2/KCNQ3 токи.
Впервые показано, что дифосфорилированные фосфоинозитиды активируют гетеромерные нейрональные KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 каналы в Xenopus laevis ооцитной экспрессирующей системе неспецифическим образом.
Впервые выявлена модуляция экспрессии белка глутаматных ЕААТЗ транспортёров нейрональной PIP5K2A киназой и её мутантной формы (N251S)-PIP5K2A, ассоциированной с шизофренией, на мембране Xenopus laevis ооци-тов и в культуре человеческих эмбрионных почечных НЕК293 клеток.
Доказано, что PIP5K2A является новым сигнальным элементом в регуляции активности ЕААТЗ. Сравнительное изучение функциональной регуляции PIP5K2A и её мутантной формы (N251S)-PIP5K2A, ассоциированной с шизофренией, позволило выявить стимулирующий эффект PIP5K2A киназы на работу нейрональных глутаматных ЕААТЗ транспортёров в Xenopus laevis ооцитной экспрессирующей системе и нарушение этой функции у мутантной формы (N251S)-PIP5K2A.
Впервые показано, что дифосфорилированный фосфоинозитид Р1(4,5)Р2 стимулирует электрогенный глутаматный транспорт в ЕААТЗ экспрессирующих Xenopus laevis ооцитах. Эффекты Р1Р2 и Р1Р5К2А-коэкспрессии на активность ЕААТЗ не являются кумулятивными.
Впервые построена трёхмерная модель мутантной формы (N251S)-PIP5K2A, демонстрирующая нарушение структурно-функциональной интегри-рованности каталитического домена киназы.
Обнаружена модуляция ряда свойств KCNQ4 каналов KCNE (3-субъединицами, включая зависимость активации от потенциала, амплитуду тока, ионную селективность и содержание белка в Xenopus laevis ооцитах.
Обнаружено снижение уровня сывороточного нейростероида ДГЭАС у больных шизофренией по сравнению с психически и соматически здоровыми лицами.
Впервые выявлены корреляции уровня ДГЭАС в сыворотке крови у больных шизофренией с длительностью заболевания, преобладанием негативной или позитивной симптоматики и проводимой фармакотерапией.
Впервые доказано, что снижение содержания нейростероида ДГЭАС до проведения фармакотерапии атипичным нейролептиком кветиапином является прогностически неблагоприятным признаком отвечаемости на терапию.
Практическая значимость.
В работе показаны выраженные функциональные нарушения регуляции нейрональных KCNQ калиевых каналов и глутаматных ЕААТЗ транспортёров мутантной, ассоциированной с шизофренией (N251S)-PIP5K2A киназой, объясняющие повышение мезенцефалического дофаминового потенциала действия у больных шизофренией (носителей этой мутации), а также нарушение метаболизма глутамата в мозге у больных.
Обнаружено снижение уровня сывороточного нейростероида ДГЭАС у больных шизофренией по сравнению с психически и соматически здоровыми лицами. Установлено, что группы пациентов, сформированные по принципу преобладания позитивной либо негативной симптоматики, существенно различаются между собой по уровню ДГЭАС в сыворотке крови. Показано восстановление концентрации ДГЭАС в сыворотке крови у больных резидуальной шизофренией после фармакотерапии атипичным нейролептиком кветиапином до нормальных значений.
Полученные данные могут быть использованы в качестве параклинических критериев для прогноза течения заболевания и применения обоснованной индивидуальной терапевтической тактики.
Получен патент на изобретение «Способ прогнозирования эффективности лечения резидуальной шизофрении атипичными нейролептиками» // Патент (РФ) №2006108350/15, опубл. Бюл. № 27 от 27.09.2007.
Основные результаты диссертационной работы включены в программу обучения врачей-ординаторов и аспирантов Учреждения РАМН НИИПЗ СО РАМН и в учебные программы для студентов, интернов, клинических ординаторов и врачей-психиатров кафедры психиатрии, наркологии и психотерапии Сибирского государственного медицинского университета. Результаты внедрены в клиническую практику и используются в клиниках НИИ психического здоровья, а также в Томской областной клинической психиатрической больнице.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на: the 7 World Congress of Biological Psychiatry (Berlin, Germany, 2001); the XIth Biennial Winter Workshop on Schizophrenia (Davos, Switzerland, 2002); Российско-немецком семинаре «Патофизиология психических расстройств» (Томск, 2006); the 2nd International Congress of Biological Psychiatry (Santiago, Chile, 2007); XVII научной отчетной сессии НИИ психического здоровья СО РАМН «Актуальные вопросы психиатрии» (Томск, 2007); the 86 Annual Meeting of German Physiological Society (Hannover, Germany, 2007); Российско-Голландском симпозиуме «Schizophrenia in a Dutch-Siberian perspective», (Groningen-Rotterdam, Netherlands, 2007); XVIII научной отчетной сессии НИИ психического здоровья СО РАМН «Актуальные вопросы психиатрии» (Томск, 2008); the XIV Biennial Winter Workshop on Schizophrenia and Bipolar Disorders (Montreux, Switzerland 2008); Второй всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008); the 21 ECNP Congress (Barcelona, Spain, 2008); XIX научной отчетной сессии НИИ психического здоровья СО РАМН «Актуальные вопросы психиатрии» (Томск, 2009); the 88th Annual Meeting of the European Physiological Societies (Giessen, Germany, 2009).
Исследования поддержаны грантом INTAS YS Fellowship «Deranged regulation of the serum and glucocorticoid inducible kinase family and genetic basis of psychiatric disease» (2004-2006) I «Нарушение регуляции семейства сыворотко- и глюкокортикоид индуцируемых киназ и генетические основы психических расстройств» (Ref. No. 04-83-3764); государственным контрактом № 06/957 (2007) «Клинико-иммунологические, иммунофизиологические
и молекулярно-биологические механизмы патогенетической терапии психических расстройств» в рамках подпрограммы «Психические расстройства» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007-2011 гг.)».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 14 статей в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получен патент на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка, 3 приложений. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 49 рисунками. Библиографический список включает 472 источника: 20 отечественных и 452 зарубежных авторов.
