Введение к работе
доктор биологических наук Пальчикова Н.А.
Актуальность проблемы. По прогнозам ВОЗ в мире к 2030 г. будет около 435 млн. больных сахарным диабетом (СД) и их лечение уже сейчас представляет серьезную экономическую проблему (Дедов И.И., 2010; Дедов И.И. и др., 2012; Roger V.L. et al., 2011). Нарушения углеводного обмена (НУО) являются общим патогенетическим звеном развития СД как 1, так и 2 типов, и лежат в основе развития осложнений этого заболевания (Балаболкин М.И., 2000; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2011; Battiprolu P.K. et.al., 2010). Так, в одном из самых масштабных и значимых исследований в области диабета UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study, 1998) доказано наличие прямой зависимости между уровнем гликемического контроля и вероятностью развития осложнений СД.
Гипергликемия при СД является следствием абсолютной или относительной недостаточности инсулина при 1 и 2 типах заболевания соответственно. В этой связи тактика лечения СД включает использование природных или синтетических препаратов инсулина (Ковельман И.З. и др., 2002; Кураева Т.Л., 2010). В последние годы разрабатывают способы обеспечения организма инсулином c использованием клеточных технологий (Возианов А.Ф., 2006; Phadnis S.M. et.al., 2009). Широко применяют препараты, способные повысить чувствительность тканей к инсулину и увеличить утилизацию глюкозы клетками тканей (Артюкова М.М., 2007; Балаболкин М.И. и др., 2008). Разрабатывают новые принципы лечения гипергликемии путем стимуляции глюкозурии (Шварц В.Я., 2012).
Исследованию других гормональных механизмов, также способствующих формированию гипергликемии при СД, уделяют значительно меньше внимания. К ним, в частности, относится усиление активности глюкокортикоидного звена адренокортикальной системы при СД, которое наблюдали как в клинических, так и в экспериментальных исследованиях (Баранов В.Г. и др., 1983; Мазурина Н.К., 2007; Chan O. et.al., 2002; Selyatitskaya V.G. et.al., 2012). Участие глюкокортикоидных гормонов в патогенезе СД обусловлено индукцией этими гормонами в гепатоцитах синтеза мРНК ключевых ферментов глюконеогенеза, ферментов переаминирования аминокислот и включения их в глюконеогенез, что, в итоге, приводит к усилению продукции глюкозы печенью (Мертвецов Н.П., 1986; Kotelevtsev Y. еt.al, 1997). В условиях гипоинсулинемии или инсулинорезистентности усиление глюконеогенеза можно расценить как компенсаторную реакцию на недостаток глюкозы в клетках (Roberge C. et.al., 2007; Sowers J.R. et.al., 2009), но, с другой стороны, эта же реакция способствует усугублению симптоматики СД и препятствует коррекции гипергликемии с использованием фармацевтических препаратов.
По мнению некоторых исследователей (Rosmond R., Bjorntorp P., 2000; Vicennati V., Pasquali R., 2000) СД 2 типа можно определить как заболевание, в основе которого лежит неадекватная или избыточная продукция глюкокортикоидных гормонов. Инсулинорезистентность, которую рассматривают как ведущее патогенетическое звено СД 2 типа, с этих позиций является лишь приспособительной реакцией, предназначенной для перераспределения потоков энергетических субстратов в клетки. Подтверждением важной роли глюкокортикоидных гормонов в механизмах формирования НУО служит также индуцированный стероидами диабет (Селятицкая В.Г. и др., 2002; Бабаджанова Г.Ю., 2003; Arnaldi G. et.al., 2003).
Несмотря на имеющийся экспериментальный и клинический материал, механизмы увеличения содержания глюкокортикоидных гормонов в крови при НУО до настоящего времени окончательно не выяснены. Повышение концентрации основного глюкокортикоидного гормона кортизола (или кортикостерона у крыс) в крови может быть связано с изменениями биосинтеза этого гормона в коре надпочечников. Однако активность каких этапов синтеза глюкокортикоидных гормонов меняется при НУО, неизвестно, поскольку регуляции могут подвергаться как ранние, так и поздние этапы этого процесса (Ehrhart-Bornstein M. et. al., 1998; Miller W. L., Auchus R.J., 2011).
Механизмы регуляции концентрации глюкокортикоидных гормонов в крови включают также реакции взаимного превращения физиологически активного гормона и его неактивной формы с помощью ключевого фермента пререцепторного метаболизма глюкокортикоидных гормонов 11-гидроксистероиддегидрогеназы (11-ГСД). Этот фермент проявляет активность в самом надпочечнике и в тканях (Shimojo M. et.al.,1996; Chapman K.E., et.al., 2009). Первая изоформа фермента (11b-ГСД-I) сопряжена с глюкокортикоидными рецепторами и осуществляет реакцию восстановления неактивного кортизона у человека (11-дегидрокортикостерона у крыс) в кортизол (кортикостерон) (Brem A.S. et.al., 1995; Napolitano A. et.al., 1998; Walker B.R., 2007). Увеличение активности 11b-ГСД-I в печени способствует локальному повышению содержания активных глюкокортикоидов в гепатоцитах и усилению процессов глюконеогенеза (Aoki K. et.al., 2001; Masuzaki H. et.al.,2001; Whorwood C.B. et.al., 2002; Liu Y. et.al., 2005; Draper N., Stewart P.M., 2005). Показано, что вклад 11-ГСД-I во вненадпочечниковый синтез кортизола составляет до 30% от его синтеза в надпочечнике здорового человека (Basu R. et.al., 2004).
Вторая изоформа фермента (11-ГСД-II) солокализована с минералокортикоидными рецепторами, осуществляет превращение активных глюкокортикоидных гормонов в неактивные метаболиты в тканях-мишенях альдостерона, обеспечивая тем самым селективность этих рецепторов (Slight S.H. et.al., 1996; Qin W. et.al., 2003; Lauterburg M. et.al., 2012). Так, основное количество неактивного кортизона у человека производится в почках (Whitworth J.A., 1989). Какой вклад дают изоформы фермента 11ГСД во вненадпочечниковый синтез глюкокортикоидных гормонов при нарушениях углеводного обмена неизвестно. Решение этого вопроса требует специального исследования.
Глюкокортикоидные гормоны оказывают множественные эффекты на функциональное состояние регуляторных систем организма (Reddy T.E. et.al., 2010). Так, известно их модулирующее влияние на активность ренин-ангиотензиновой системы, которую глюкокортикоидные гормоны осуществляют, действуя как через системную циркуляцию (Corvol P., Jeunemaitre X., 1997; Shelat S.G. et.al., 1999), так и паракринно, образуясь в тканях из своих обратимых метаболитов с помощью 11ГСД-I (Penning T.M., 2011). Важнейшим элементом ренин-ангиотензиновой системы является ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), играющий ведущую роль в развитии и прогрессировании артериальной гипертензии и сосудистых осложнений при сахарном диабете (Григорьев Ю.В. и др., 2005; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2011; Hayden M.R. et.al, 2011). Активация глюкокортикоидного звена адренокортикальной системы приводит к изменению активности АПФ, что позволяет рассматривать этот фермент как показатель тканевых эффектов глюкокортикоидных гормонов при СД, однако сведения об активности АПФ при нарушениях углеводного обмена отсутствуют.
Цель исследования: изучить активность и взаимоотношения синтеза и пререцепторного метаболизма кортикостерона, как основных системных механизмов регуляции его уровня в крови, при экспериментальных острых и хронических воздействиях, модулирующих углеводный обмен.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать выраженность нарушений углеводного обмена по содержанию в крови глюкозы и иммунореактивного инсулина у крыс при экспериментальных воздействиях: введение аллоксана (моделирование аллоксанового диабета), введение диоксида кремния здоровым крысам (моделирование хронического гранулематозного воспаления) или животным с аллоксановым диабетом (моделирование сочетания патологических процессов).
-
Изучить содержание кортикостероидных гормонов в крови и активность реакций стероидогенеза в надпочечниках крыс в динамике развития аллоксанового диабета, хронического гранулематозного воспаления, индуцированного введением диоксида кремния, и при их сочетании.
-
Исследовать активность изоформ 11-гидроксистероиддегидрогеназы в надпочечниках, крови, печени и почках крыс в динамике развития аллоксанового диабета, хронического гранулематозного воспаления и при их сочетании.
-
Изучить активность аминотрансфераз в печени и активность ангиотензинпревращающего фермента в крови, легких, печени и почках крыс в динамике развития аллоксанового диабета, хронического гранулематозного воспаления и при их сочетании.
-
Описать полученные результаты исследования синтеза, пререцепторного метаболизма и эффектов кортикостерона в тканях у крыс при экспериментальных острых и хронических воздействиях, модулирующих углеводный обмен, с позиций теории функциональных систем, используя методы корреляционного и факторного анализов.
-
Определить состояние исполнительных механизмов функциональной системы поддержания концентрации кортикостерона в крови и тканях-мишенях (синтез в надпочечниках и пререцепторный метаболизм) у крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией и нарушениями углеводного обмена.
Научная новизна работы. Впервые к описанию механизмов, обеспечивающих сохранение адекватной условиям жизнедеятельности концентрации кортикостерона в крови, применен подход, использующий основные принципы построения функциональных систем по П.К. Анохину. Функциональная система поддержания концентрации кортикостерона в крови и тканях-мишенях представлена звеньями: полезный приспособительный результат - концентрация кортикостерона в крови; акцепторы результата действия - эффекты кортикостерона в тканях-мишенях, в частности, активности АПФ и ферментов переаминирования аминокислот; исполнительные механизмы - синтез кортикостероидных гормонов в надпочечниках и пререцепторный метаболизм в тканях ферментом 11-ГСД.
С использованием корреляционного и факторного анализов выявлены изменения функциональной системы, характерные для нарушений углеводного обмена. При нормогликемии функциональная система характеризуется наличием устойчивых корреляционных взаимосвязей, а в четыре основных фактора, наиболее значимо влияющих на величины анализируемых переменных, входят в основном показатели синтеза кортикостероидов в надпочечниках и активность АПФ в крови и тканях. При аллоксановом диабете с гипергликемией и гипоинсулинемией функциональная система характеризуется резким снижением числа корреляционных связей и изменением структуры основных факторов. Первым и наиболее значимым становится фактор, в который входят показатели метаболизма и активности АПФ в легких, т.е. звено эффектов функциональной системы.
При гранулематозном воспалении с нормогликемией число корреляционных связей снижено, но в меньшей степени, чем при аллоксановом диабете, а основные факторы функциональной системы содержат показатели синтеза и циркуляции кортикостероидов. При гранулематозном воспалении на фоне аллоксанового диабета стабильность функциональной системы восстанавливается, усиливается взаимозависимость ее параметров, первый и третий факторы аналогичны таковым при нормогликемии, а второй – при аллоксановом диабете с гипергликемией.
Впервые раскрыт реализуемый через функциональную систему поддержания концентрации кортикостерона в крови и тканях-мишенях патофизиологический механизм сохранения гипергликемии при длительном течении аллоксанового диабета с гипоинсулинемией. Он представлен увеличением активности первой изоформы 11-ГСД-I в печени, что способствует локальному повышению содержания кортикостерона в гепатоцитах и обеспечивает усиление его активирующего влияния на глюконеогенез.
Эти же реакции активируются при хроническом гранулематозном воспалении, но в условиях нормоинсулинемии эффекты кортикостерона в печени направлены на поддержание нормогликемии на фоне резкого ингибирования синтеза кортикостерона в надпочечниках. Однако на длительных сроках хронического гранулематозного воспаления, развивающегося на фоне аллоксанового диабета, снижение синтеза кортикостерона в надпочечниках не сопровождается повышением активности 11-ГСД-I в печени, что, в свою очередь, приводит к снижению выраженности гипергликемии.
Впервые показано, что у крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией при эмоциональном стрессе одновременно активируются синтез кортикостерона в надпочечниках и локальное образование этого гормона в тканях ферментом 11-ГСД-I, что может являться одним из механизмов патогенеза ассоциированных со стресс-индуцируемой артериальной гипертензией нарушений углеводного обмена.
Теоретическая и практическая значимость работы. По результатам диссертационной работы предложена концепция функциональной системы поддержания концентрации кортикостерона в крови и тканях-мишенях, которая позволяет обеспечивать эффекты этого гормона при изменениях его синтеза в надпочечниках. Система включает два основных исполнительных механизма – синтез гормона в надпочечниках и его пререцепторный метаболизм в тканях, которые, взаимодействуя между собой, обеспечивают адекватный запросам организма уровень гормона в крови и тканях. Структура основных факторов, характеризующих деятельность функциональной системы, меняется в зависимости от выраженности нарушений гомеостатических параметров, в частности, нарушений углеводного обмена. Сформулированная концепция позволила выявить и доказать важный вклад пререцепторного метаболизма кортикостерона в регуляцию уровня этого гормона в крови и осуществление его эффектов в тканях при гипергликемии, охарактеризовать роль высокой активности 11-ГСД-I в сохранении гипергликемии при снижении продукции кортикостерона в надпочечниках. Полученные результаты расширяют современные представления о механизмах развития стойких нарушений углеводного обмена при сахарном диабете и могут служить научно-методической базой дальнейших исследований, включая поиск новых более эффективных подходов к коррекции гипергликемии при сахарном диабете.
Использование микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии при исследовании функционального состояния адренокортикальной системы позволяет оценить спектр гормонов, синтезируемых в надпочечнике, одновременно в одной пробе. Данный метод служит удобным инструментом для дифференциальной диагностики нарушений как биосинтеза гормонов в надпочечниках, так и их тканевого метаболизма. Так, с использованием метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии в плазме крови женщин с ожирением были одновременно определены кортизол, кортизон, 11-дезоксикортизол, кортикостерон и 17-гидроксипрогестерон, что позволило установить взаимосвязь тяжести нарушений углеводного обмена с уменьшением в крови концентрации 11-дезоксикортизола.
Разработанный метод определения активности АПФ в крови и тканях с использованием микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии позволил провести комплексный анализ активности фермента в динамике развития нарушений углеводного обмена у экспериментальных животных, а также при наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензии.
Методы определения кортикостероидных гормонов и активности ангиотензинпревращающего фермента в плазме крови человека с использованием микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии были предложены для клинического применения и утверждены Министерством здравоохранения СССР в качестве методических рекомендаций (решение №10-11/37 от 01.04.1991 г.)
Диссертационное исследование выполнено в рамках темы НИР лаборатории эндокринологии ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН «Изучить реактивность интегративных систем организма при функциональных нарушениях инсулярного аппарата поджелудочной железы, обусловленных воздействиями повреждающих факторов экзогенной и эндогенной природы, разработать подходы к коррекции инсулинорезистентности и гипоинсулинемии», № гос. регистрации 01200955649.
Положения, выносимые на защиту
1. Уровень кортикостерона в крови и его эффекты в тканях регулируются функциональной системой поддержания концентрации кортикостерона в крови и тканях-мишенях, включающей в качестве полезного приспособительного результата - концентрацию кортикостерона в крови, в качестве акцептора результата действия системы - эффекты кортикостерона в тканях, в качестве исполнительных механизмов - синтез кортикостерона в надпочечниках и его пререцепторный метаболизм в печени и почках ферментом 11-ГСД.
2. При аллоксановом диабете на фоне гипоинсулинемии в динамике развития патологического процесса изменение активности исполнительных механизмов функциональной системы направлено на сохранение гипергликемии. Так, начальный период заболевания сопровождается увеличением активности всех этапов синтеза стероидов в надпочечниках и высоким уровнем кортикостерона в крови, что способствует повышению активности ангиотензинпревращающего фермента в легких и ферментов переаминирования аминокислот в печени. На длительных сроках содержание глюкокортикоидных гормонов в крови и надпочечниках снижается относительно начала эксперимента, при этом увеличивается активность 11-ГСД-I в печени, что локально повышает содержание кортикостерона и активность аминотрансфераз, способствуя тем самым поддержанию гипергликемии.
3. Активность исполнительных механизмов функциональной системы при гранулематозном воспалении, индуцированном введением диоксида кремния, в условиях нормогликемии носит фазный характер ответа на стрессорное воздействие. Так, в первые сутки после индукции воспаления повышается синтез кортикостерона из имевшихся в надпочечниках предшественников, что приводит к значительному увеличению содержания этого гормона в крови. Начальная фаза гиперактивности меняется к 14 суткам на фазу ингибирования конечных этапов синтеза кортикостероидных гормонов – кортикостерона и альдостерона, в надпочечниках. При этом поддержание концентрации кортикостерона в крови осуществляется за счет активации первой изоформы 11-ГСД-I в надпочечниках и печени, а также ингибирования второй изоформы 11-ГСД-II в почках, превращающей кортикостерон в его неактивный метаболит 11-дегидрокортикостерон.
4. Активность исполнительных механизмов функциональной системы при индукции гранулематозного воспаления у крыс на фоне аллоксанового диабета с гипергликемией и гипоинсулинемией на начальных сроках воспаления соответствует таковой у крыс только с аллоксановым диабетом. На отдаленных сроках проявляется модулирующее влияние гранулематозного воспаления, сопровождающееся уменьшением содержания кортикостерона в надпочечниках и крови, снижением выраженности гипергликемии и активности аминотрасфераз в печени.
5. У крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией и нарушениями углеводного обмена стойкие изменения активности исполнительных механизмов функциональной системы затрагивают, в основном, активность пререцепторного метаболизма кортикостерона и проявляются в условиях острого стрессорного воздействия.
Апробация результатов исследования. Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, обсуждены на: XVII International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Firenze, Italy, 1999); VI конференции “Аналитика Сибири и Дальнего Востока” (Новосибирск, 2000); IY Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); Второй научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии” (Новосибирск, 2002); Всероссийском симпозиуме “Хроматография и хроматографические приборы” (Москва, 2004); VII конференции “Аналитика Сибири и Дальнего Востока” (Новосибирск, 2004); Второй Всероссийской конференции “Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты” (Новосибирск, 2004); ХIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); 20 Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007); YI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); Четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов” (Новосибирск, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Вопросы патогенеза типовых патологических процессов” (Новосибирск, 2010); III Всероссийской научной конференции с международным участием “Вопросы патогенеза типовых патологических процессов” (Новосибирск, 2011); Пятой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов” (Новосибирск, 2011); VII Съезде физиологов Сибири (Красноярск, 2012), Шестой Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием “Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов” (Новосибирск, 2013)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 научных работ, из них 22 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов исследований, проведенных в рамках выполнения диссертационных работ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 215 страницах машинописного текста и структурированы по разделам: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов исследования. Диссертация включает 4 рисунка и 37 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 516 источников, из них 427 иностранных.
