Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Структура воспалительного процесса и механизмы его регуляции 13
1.2. Интерлейкин-1, интерлейкин-10, глюкокортикоиды и тироксин в регуляции воспалительного процесса 20
1.3. Факторы патогенности S.aureus 29
1.4. Нарушение механизмов регуляции воспаления - патофизиологическая основа заболеваний 31
1.5. Влияние азоксимера бромида на воспалительный процесс 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Объект и материалы исследования 38
2.2. Методы исследования 40
2.2.1. Морфологические методы исследования 40
2.2.2. Определение лейкоцитарной формулы крови 42
2.2.3. Определение фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса 43
2.2.4. Электронномикроскопическое исследование 43
2.2.5. Определение цитокинов в плазме крови 44
2.2.6. Определение кортикостерона, тироксина, свободного тироксина в плазме крови 45
2.2.7. Статистические методы исследования 46
Результаты собственных исследований 47
Глава 3. Показатели клеточных реакций в очаге асептического воспаления 47
Глава 4. Показатели клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком 53
Глава 5. Показатели клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком с коррекцией азоксимера бромидом 65
Глава 6. Динамика содержания ИЛ-1В, ИЛ-10, кортикостерона, тироксина в плазме крови животных с экспериментальным воспалением 77
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 85
Заключение 104
Выводы 110
Список литературы 112
- Интерлейкин-1, интерлейкин-10, глюкокортикоиды и тироксин в регуляции воспалительного процесса
- Показатели клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком
- Показатели клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком с коррекцией азоксимера бромидом
- Динамика содержания ИЛ-1В, ИЛ-10, кортикостерона, тироксина в плазме крови животных с экспериментальным воспалением
Введение к работе
Актуальность проблемы: Воспаление является универсальной защитно-приспособительной реакцией, развивающейся в ответ на повреждение и относящейся к старейшим типам защитных реакций организма (Серов В. В., 1995; Куликова А. Н., 2007). Воспаление относится к адаптивным и индуктивным процессам, зависящим от суммы клеточных и гуморальных факторов, многие из которых продуцируются в ответ на действие воспалительных стимулов. Их образование требует активной работы клеток, которая проявляется в синтезе молекул, направленных на возбуждение, развитие и купирование воспалительной реакции (Маянский А. Н., 2007).
В последние годы особую актуальность приобретает изучение цитокинов – важнейших медиаторов воспалительного ответа, являющихся мощными про- и антивоспалительными агентами (Таджиханова Д. П., 2010; Liles W. C., Van Voorhis W. C., 1995), вовлеченными фактически во все этапы воспалительных и иммунных реакций (Симбирцев А. С., 2004; Калинина Н. М., 2005). Также контроль воспалительного ответа осуществляется эндокринной системой с помощью гормонов, оказывающих ингибирующее и стимулирующее действия (Добротина Н. А., 2007). Воспаление сопровождается взаимосвязанным изменением профиля цитокинов и уровня синтеза гормонов. Цитокины, воздействуя на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось, изменяют продукцию гормонов, оказывая влияние на защитные функции организма (Зайнутдинова Г. Х., 2011; Azmi A. S., Mohammad R. M., 2009).
Воспаление является основным звеном патогенеза большинства заболеваний. В неблагоприятных условиях воспалительный процесс может протекать атипично с тенденцией к хронизации (Майборода А. А., 2001; Семинский И. Ж., 2003). Прогностическое значение в протекании воспаления имеет уровень про- и противовоспалительных цитокинов, их соотношение отражает интенсивность, динамику и прогрессирование заболевания (Останин А. А., 2002; Родионова О. Н., 2011). В настоящее время активно исследуются методы воздействия на цитокиновый профиль с лечебной целью. Поэтому возникает необходимость сравнительного изучения разных форм воспаления и механизмов их регуляции с возможностью их патогенетической коррекции лекарственными препаратами.
Цель исследования: оценить интенсивность клеточных реакций и механизмы их регуляции под влиянием иммуномодулятора азоксимера бромида на модели асептического и микробного воспаления.
Задачи исследования:
-
Определить интенсивность клеточных реакций в очаге асептического воспаления с исследованием динамики провоспалительного (ИЛ-1) и противовоспалительного (ИЛ-10) интерлейкинов, кортикостерона и тироксина в плазме крови крыс.
-
Выявить особенности протекания клеточных фаз и изменения концентраций регуляторных цитокинов и гормонов в плазме крови животных при микробном воспалении.
-
Оценить нарушение баланса интерлейкина-1, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина при хронизации воспалительного процесса.
-
Установить закономерности изменения клеточных реакций в очаге микробного воспаления под влиянием иммуномодулятора азоксимера бромида.
-
Исследовать изменение уровней интерлейкина-1, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина в плазме крови крыс при микробном воспалении с коррекцией азоксимера бромидом в сравнении с микробным без коррекции и асептическим воспалительными процессами.
Научная новизна работы.
Впервые на унифицированной модели асептического и микробного воспаления у крыс при проведении комплексного изучения уровней интерлейкина-1, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина с выявлением закономерностей протекания регулируемых ими клеточных фаз воспалительного процесса установлены различия в содержании цитокинов и гормонов при разных формах воспаления. Выявлено, что асептический воспалительный процесс сопровождался разнонаправленными изменениями содержания интерлейкинов: по мере увеличения концентрации интерлейкина-1, интерлейкин-10 убывал, и наоборот. Синтез кортикостерона находился в прямой зависимости с уровнем провоспалительного интерлейкина-1.
Показано, что при микробном воспалении содержание цитокинов и гормонов резко отличалось от аналогичных показателей при асептическом воспалительном процессе. Выявлено, что увеличение и снижение концентраций интерлейкинов и кортикостерона в плазме крови животных были сочетанными, при этом уровень глюкокортикоида находился ниже показателей, полученных у интактных крыс, на протяжении всего периода исследований. Продолжительность клеточных реакций при этом значительно увеличивалась. Таким образом, впервые установлено, что дисбаланс цитокинов и гормонов, который регистрировался при микробном воспалении, приводил к хронизации процесса. Выявлены механизмы и точки приложения интерлейкинов и гормонов на клетки, реализующие воспалительный процесс.
Впервые применение азоксимера бромида в унифицированной модели микробного воспаления позволило проследить оптимизацию регуляторных механизмов клеточных реакций воспалительного процесса с определением их морфологических характеристик. Приоритетными являются данные о том, что микробное воспаление с коррекцией иммуномодулятором сопровождалось наиболее выраженным увеличением содержания противовоспалительных интерлейкина-10 и кортикостерона в плазме крови крыс, по сравнению с асептическим и стафилококковым воспалением, повышение уровня интерлейкина-1 было менее интенсивным, чем в серии с микробным воспалительным процессом. При этом максимум концентрации провоспалительного интерлейкина-1 регистрировался через 1 сутки от начала воспаления, то есть был приближен к срокам его выработки при асептическом процессе. Длительность клеточных фаз микробного воспаления при использовании азоксимера бромида была сокращена по сравнению с микробным воспалением. Таким образом, установлено, что применение азоксимера бромида значительно улучшало течение микробного воспаления, препятствуя его хронизации.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты исследования дополняют знания врачей о патогенезе воспалительной реакции, в частности, конкретизируют представление о роли цитокинов и гормонов на этапах клеточных фаз воспаления. Полученные данные показывают, что дисбаланс цитокинов и гормонов является одним из механизмов хронизации воспаления.
Использование азоксимера бромида для коррекции микробного воспаления открыло новые аспекты клинического применения этого препарата
в предупреждении хронизации воспалительного процесса.
Результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс кафедр факультетской терапии и фармакологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минзравсоцразвития России.
Положения, выносимые на защиту:
-
Асептическое воспаление у крыс сопровождается незначительным повышением провоспалительного интерлейкина-1 и кортикостерона с пиком концентраций на срок 12 часов и дальнейшим их снижением на фоне противоположных изменений в содержании противовоспалительного интерлейкина-10, что обеспечивает адекватную интенсивность клеточных реакций.
-
Микробное воспаление, вызванное золотистым стафилококком, характеризуется нарушением баланса про- и противовоспалительного цитокинов и гормонов, что способствует хронизации воспалительного процесса. Повышение и снижение уровней интерлейкинов происходят параллельно с максимумом значений через 2 суток от начала процесса, без преемственности, необходимой для адекватной регуляции воспалительного процесса. Значительное повышение содержания интерлейкина-1 сопровождается двукратным увеличением уровня интерлейкина-10 на фоне угнетения синтеза кортикостерона.
-
Иммуномодулятор азоксимера бромид сокращает течение микробного воспаления, препятствуя его хронизации путем воздействия на регуляторные механизмы клеточных фаз, приближая их к показателям асептического процесса. Увеличение содержания провоспалительного интерлейкина-1 через 1 сутки сопровождается двукратным повышением уровня кортикостерона. На фоне снижения интерлейкина-1 и кортикостерона противовоспалительный интерлейкин-10 возрастает в 4 раза через 2 суток процесса. Применение азоксимера бромида активирует противовоспалительные и оптимизирует провоспалительные регуляторные механизмы воспаления.
Апробация материалов диссертации.
Основные положения работы доложены и обсуждены на проблемной комиссии «Общая патология, морфология, физиология» Иркутского государственного медицинского университета (2008, 2009, 2010), Центральной проблемной комиссии Иркутского государственного медицинского университета (2011), межкафедральной конференции Иркутского государственного медицинского университета (2012), Х Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (2012).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 статей, в том числе 8 – в рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 44 рисунками и 11 таблицами. Библиографический справочник содержит 244 источника, из которых – 155 отечественных и 89 зарубежных авторов.
Интерлейкин-1, интерлейкин-10, глюкокортикоиды и тироксин в регуляции воспалительного процесса
Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма [47]. Все цитокины имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик: плейотропиость и взаимозаменяемость биологического действия, отсутствие антигенной специфичности, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети [118, 130, 153]. В связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции функций организма, существующую наряду с нервной и гормональной регуляцией [118]. При этом цитокиновая сеть является коммуникатором, осуществляющим связь между нейроэидокринной, иммунной, кроветворной и другими системами, служит для их вовлечения в организацию и регуляцию единой защитной реакции [73]. Известно участие гормонов, нейропептидов, медиаторов иммунитета и цитокинов в двусторонней передаче сигналов между нейроэидокринной и иммунной системами. Определено структурное сходство между рецепторами для АКТГ, эндорфинов и ИЛ-1 [75].
Цитокины регулируют рост, диффереицировку и функции лимфоцитов, фагоцитов и других клеток аутокринным, паракринным и эндокринным образом [55, 68, 117, 130, 156]. Принято считать, что при аутокринной регуляции клетки секретируют растворимый рсгуляторный фактор, который взаимодействует со специфическими рецепторами, экспрессирующимися на тех же самых клетках. Формируется эффективная аутогенная регуляторная дуга, где продукт осуществляет механизм обратной связи в отношении клетки, которая его продуцировала. Результатом такого взаимодействия является продолжающийся ответ клетки на внешнее регуляторное воздействие. В основе паракринных механизмов лежит действие цитокинов, продуцированных одними клетками, на другие клетки, расположенные поблизости. Наличие у некоторых цитокинов системных, генерализованных эффектов, т.е. попадание цитокинов в циркуляцию и возможность реализации их действия на клетки многих органов, говорит об эндокринном виде в механизме действия цитокинов [55], вследствие чего стал общепринятым взгляд на циркулирующие цитокины как на эндокриноподобные факторы [22, 93, 218].
Биологические эффекты цитокинов опосредуются через специфические клеточные рецепторные комплексы [54, 117], связывающие цитокины с очень высокой аффинностью [117, 130], причем отдельные цитокины могут использовать общие субъединицы рецепторов [117]. К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы, хемокины, трансформирующие ростовые факторы, фактор некроза опухолей, интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми номерами [68, 118, 154]. Проблема изучения роли цитокинов все усложняется, учитывая, что общее количество идентифицированных цитокинов превышает 300, а число интерлейкинов достигло 32 [12].
В зависимости от характера воздействия на воспалительный процесс цитокины подразделяются на провоспалительные (ИЛ-1, ИЛ-8, др.) и противовоспалительные (ИЛ-10, др.) [30, 33]. Ключевым провоспалительным цитокином является ИЛ-1 [60], основным противовоспалительным - ИЛ-10 [160].
Интерлейкин-1 подразделяется на 2 фракции - ИЛ-1а и ИЛ-1р\ имеющие одинаковую молекулярную массу 17,5 кДа [3, 16, 49, 187]. Оба цитокина кодируются разными ієнами, но имеют гомологию в аминокислотной последовательности 26 %, обладают практически одинаковым спектром биологической активности и конкурируют за связывание с одними и теми же рецепторами [90, 80, 114, 166, 180]. Кроме того, открыт третий белок со сходной структурой, обладающий способностью специфически связываться с рецепторами ИЛ-1 без проявления биологической активности. Конкурируя с ИЛ-1 за один и тот же рецептор, он блокирует биологическую активность ИЛ-1 и из-за наличия подобных свойств получил название «рецепторный антагонист ИЛ-1» (РАИЛ) [166, 180, 192].
ИЛ-1 вырабатывается многими клетками организма. Главными его источниками в организме являются моноциты и макрофаги [106, 114, 187], а также клетки Лангерганса, купферовские клетки в печени, эндотелиальные клетки, фибробласты, клетки микроглии, натуральные киллеры, пейтрофилы, эпителиоциты, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, кроме Т-хелперов, дендритные клетки и др. [16, 47, 66, 68, 83, 90]. Индукция синтеза ИЛ-1 может быть вызвана целым рядом биологически активных веществ, главными из которых являются компоненты клеточных стенок бактерий (липополисахариды и пептидогликаны) [114], а также антигены, иммунные комплексы, цитокины, продукты клеточного распада [26, 28, 118, 128, 153].
Продукция ИЛ-1 значительно повышается в очаге, начиная с ранних стадий воспалительного процесса [230]. Кинетика накопления мРНК для ИЛ-1а и ИЛ-13 различается. Стимуляция моноцитов человека липополисахаридом приводит к быстрому (в течение 15 мин.) появлению мРНК ИЛ-ір, уровень которой достигает максимума через 3 - 4 ч, тогда как содержание мРНК для ИЛ-1 а достигает максимума к 10 - 12 ч после стимуляции. У человека ИЛ-1[3 является главной формой секреторного ИЛ-1 в окружающую среду, что объясняется преимущественным нахождением ИЛ-1а в виде мембранной формы [114]. В настоящее время открыт фермент ИЛ-1-конвертаза, превращающий предшественник ИЛ-lp в зрелую биологически активную форму путем расщепления полипептидной цепи молекулы между аминокислотными остатками аспарагина и аланина [53, 81]. Данный фермент обнаружен в макрофагах и макрофагоподобных клетках. Он специфичен лишь в отношении ИЛ-1(3 и не действует на предшественник ИЛ-1а.
Все известные биологические эффекты ИЛ-1 осуществляются посредством его связывания со специфическими мембранными рецепторами, экспрессирующимися на различных типах клеток-мишеней. Известны три типа рецепторов ИЛ-1, обозначаемых рецепторами ИЛ-1 I и II типов, и акцессорный белок рецептора ИЛ-1 [114], роль которого определяется поддержанием конформации комплекса рецептор-лиганд [4]. Все три рецепторных белка экспрессируются клетками конститутивно, но их число может увеличиваться под влиянием целого ряда бактериальных индукторов, цитокинов, гормонов и других биологически активных веществ [114]. Рецепторы ИЛ-1 I типа находятся на Т-клетках, кератиноцитах, хондроцитах, гепатоцитах, фибробластах, эндотелиальных и синовиальных клетках [4, 90, 231] и служат для передачи сигнала. Рецептор ИЛ-1 II типа присутствует па В-лимфоцитах, пейтрофилах, клетках костного мозга, макрофагах [4, 89, 187] и существует исключительно для связывания ИЛ-1. Биологическое действие ИЛ-1 может быть заблокировано только моноклональными антителами к рецептору I типа, но не антителами к рецептору II типа. Очевидно, рецептор II типа служит для блокады биологических эффектов, связанных с гиперпродукцией ИЛ-1. Из-за подобных свойств рецептор ИЛ-1 II типа получил название «рецептора-ловушки» [4, 114]. Показано, что на некоторых типах клеток, в частности на В-лимфоцитах, могут одновременно экспрессироваться рецепторы и I, и II типа.
Для ИЛ-1 характерно, что ответ клеток на его действие развивается при наличии минимального числа занятых специфических рецепторов и крайне низких концентраций лиганда. Плейотропный тип биологического действия ИЛ-1 проявляется, начиная с молекулярного внутриклеточного уровня. Даже несмотря на минимальное число экспрессируемых рецепторов и исчезающие пикомолярные концентрации самого ИЛ-1, запускается клеточный ответ, что в конечном итоге ведет к экспрессии генов около 100 цитокинов, гормонов, ферментов, ростовых факторов, других биологически активных веществ и их рецепторов. Поэтому все многочисленные биологические эффекты ИЛ-1 в организме определяются уже на субклеточном уровне [114]. Клетками-мишенями для ИЛ-1 являются Т- и В-лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, дендритные клетки, базофилы, фибробласты, остеокласты, гепатоциты и другие клетки [4, 66, 71, 83], т. е. мишенями служат клетки практически всех органов и тканей [114].
Показатели клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком
Через 12 часов после введения камер со взвесью стафилококка в очаге воспаления толщина клеточного вала вокруг камеры составляла 184 ± 23 мкм с концентрацией клеток 26,8 ± 1,1 на 1000 мкм"". В клеточном вале преобладали нейтрофилы, соотношение нейтрофил : макрофаг = 3:1. Наблюдались фигуры фагоцитоза, одна треть нейтрофилов находилась в состоянии дегрануляции и аутолиза. Макрофаги располагались в основном по периферии лейкоцитарного вала. Имелись значительные отложения фибрина, соединительная ткань этой области была отечна. Показатели фагоцитоза составляли: ФИ = 52 ± 4 %, ФЧ = 5,1 ± 0,6 микробных тел на клетку (табл. 2), В периферической крови на этот срок наблюдался нейтрофильный сдвиг лейкоцитарной формулы влево. Процентное соотношение нейтрофилов по отношению к моноцитам возрастало в 1,5 раза по сравнению с нормой (р 0,05).
В отдаленной зоне очага воспаления на этот срок концентрация нейтрофилов составляла 5,1 ± 1,1 на 1000 мкм2, моноцитов 4,8 ± 1,3 на 1000 мкм". Наблюдалось значительное расширение и полнокровие микрососудов, диапедез и периваскулярная инфильтрация лейкоцитов. Соединительная ткань области воспаления была отечна, наблюдались значительные отложения фибрина. В периферической зоне очага воспаления появлялись единичные малодифференцированные фибробласты. Ультраструктура лейкоцитов соответствовала их функциональным проявлениям, регистрировались захват и переваривание стафилококка, образование фаголизосом. Часть иейтрофилов находилась в стадии деградации, что сопровождалось нарушением целостности внутриклеточных структур. Эндотелий сосудов в очаге воспаления содержал вакуоли и микровезикулы. Регистрировалось краевое стояние и диапедез лейкоцитов, межэндотелиальные щели были расширены.
Через 1 сутки от момента введения камер со стафилококком вокруг них сохранялся лейкоцитарный вал толщиной 328 ± 9 мкм с плотностью клеток 27,0 ± 0,4 на 1000 мкм". В вале по-прежнему преобладали лейкоциты, 50 % из которых подвергались дегрануляции и аутолизу. Показатели фагоцитоза на этот срок составляли: ФИ = 62,0 ± 6,2 %, ФЧ = 5,5 ± 1,0 микробных тел на клетку (рис. 10 а, б; рис. 15 а, б). В периферической крови на этот срок нейтрофилы составляли 14 %, моноциты - 10 %.
В периферической зоне очага воспаления продолжалась сосудистая реакция: миграция лейкоцитов (соотношение нейтрофил : моноцит =1:1), отек, периваскулярная инфильтрация, отложение нитей фибрина. Количество малодифференцированных фибробластов нарастало и составляло 2,1 ± 0,6 на 1000 мкм2. На электрониограммах наблюдались как активные лейкоциты, так и клетки со сниженной функцией в стадии разрушения, регистрировались нити фибрина и отек межклеточного вещества. Непосредственно у стенки камеры образовался нейтрофильный детрит.
Через 2 суток после начала воспалительного процесса толщина клеточного вала вокруг камеры 343,8 ± 46,1 мкм с плотностью клеток 24,7 ± 1,3 на 1000 мкм2. Соотношение нейтрофил : макрофаг представляло 1:1, происходила массовая гибель иейтрофилов в вале, которая сопровождалась фагоцитированием их макрофагами. Состояние фагоцитоза лейкоцитов было следующее: ФИ = 49 ± 10 %, ФЧ = 4,6 ± 1,0 микробных тел на клетку. В периферической крови наблюдалось относительное снижение нейтрофильных форм и повышение мононуклеарных форм клеток.
В отдаленной зоне на этот срок наблюдались расширение и полнокровие сосудов, периваскулярная инфильтрация, моноциты начинали преобладать над нейтрофилами. Концентрация лейкоцитов составляла 8,1 ± 1,1 на 1000 мкм", продолжалось накопление малодифференцироваиных фибробластов. Синтетический аппарат фибробластов был мало выражен, коллагеногенез не происходил, количество отростков 1 - 2.
Через 3 суток после введения камер непосредственно около их стенок продолжалось накопление лейкоцитов, плотность которых составляла 22,3 ±1,1 клеток на 1000 мкм", толщина лейкоцитарного вала была 349,4 ± 40,3 мкм (рис. 11). Продолжался интенсивный аутолиз нейтрофилов (рис. 16), фагоцитоз нейтрофильного детрита макрофагами. Соотношение нейтрофил : макрофаг = 1 : 1. В периферической крови повышалось соотношение моноцит : нейтрофил.
По периферии лейкоцитарного вала появилась тонкая фибробластическая капсула толщиной 157,5 ± 12,5 мкм, состоящая из 3 - 4 рядов параллельно ориентированных фибробластов. Плотность фибробластов составляла 3,1 ± 0,3 на 1000 мкм".
В отдаленной зоне очага воспаления часть микрососудов запустевала, снижалась интенсивность диапедеза и периваскулярпой инфильтрации (рис. 14). Регистрировалось небольшое количество моноцитов и лимфоцитов, плотность которых составляла 6,4 ± 1,8 на 1000 мкм". Наблюдалась миграция в очаг воспаления малодифференцироваиных фибробластов, плотность которых была равна 2,5 ± 0,5 на 1000 мкм". Ультраструктура фибробластов в очаге воспаления начинала соответствовать зрелым формам, увеличилась площадь вакуолярно-лизосомального аппарата, наблюдался фибриллогенез коллагена.
Через 5 суток после начала воспалительного процесса толщина лейкоцитарного вала вокруг камер стала уменьшаться и составила 274,4 ± 41,6 мкм, плотность лейкоцитов в вале также снижалась и составляла 20,9 ± 0,6 на 1000 мкм". Большая часть нейтрофилов была разрушена, макрофаги активно фагоцитировали погибшие нейтрофилы, стафилококк (рис. 17, 18). Соотношение нейтрофил : макрофаг представляло 1 : 2. В периферической крови наблюдалось повышение процентного уровня моноцитов и снижение процентного уровня нейтрофилов.
В целом на этот срок в области воспаления наблюдалась следующая картина: непосредственно к стенке камеры прилежал нейтрофильный детрит, затем располагался вал из неповрежденных лейкоцитов, где преобладали мононуклеары, фагоцитирующие девитализированные ткани, остатки фибрина, аутолизированные нейтрофилы.
В периферической зоне очага воспаления продолжалось формирование фибробластической капсулы, состоящей к этому сроку из 4 - 5 слоев фибробластов, между которыми имелись значительные расстояния. Между фибробластами регистрировались макрофаги и лимфоциты. Толщина капсулы на этот срок составляла 239,4 ±21,5 мкм, плотность фибробластов была крайне низка - 3,8 ± 0,3 на 1000 мкм2. Продолжалась сосудистая реакция, которая проявлялась в виде периваскулярной инфильтрации лейкоцитов с преобладанием моноцитов над нейтрофилами. Плотность лейкоцитов составляла 7,1 ± 2,0 на 1000 мкм"". Ультраструктура нейтрофилов, моноцитов, фибробластов в отдаленной зоне очага воспаления соответствовала предыдущему сроку.
Через 7 суток от момента введения камер толщина лейкоцитарного вала продолжала снижаться и составляла 208,7 ± 28,4 мкм. В вале макрофаги начинали преобладать над нейтрофилами, соотношение их составляло 2 : 1 (рис. 12). Плотность клеток вала начинала снижаться до 18,9 ± 0,7 на 1000 мкм". Объем нейтрофильного детрита уменьшался за счет его фагоцитоза макрофагами. Макрофаги продвигались от периферии вала непосредственно к стенке камеры. В периферической крови на этот срок регистрировался повышенный уровень моноцитов по отношению к нейтрофилам.
В периферической зоне очага воспаления на этот срок продолжалось формирование фибробластической капсулы, ее толщина составляла 245,0 ± 37,8 мкм с числом рядов фибробластов 4,4 ± 1,0. Большинство фибробластов являлось малодифференцированными формами, синтез коллагена осуществлялся слабо. Плотность фибробластов была равна 4,4 ± 0,3 на 1000 мкм". Лейкоциты этой зоны на 90 % были представлены моноцитами с плотностью 7,5 ± 1,7 на 1000 мкм", которые мигрировали в сторону инородного тела.
Через 10 суток от момента имплантации камер вокруг них наблюдалось значительное снижение объема клеточного вала, толщина которого составляла 167 ± 11 мкм. Плотность клеток также снизилась, по сравнению с предыдущим сроком, до 16,8 ± 0,5 на 1000 мкм". Соотношение клеток в вале составляло 3 : 1 с преобладанием макрофагов. Макрофаги по-прежнему активны, на ультраструктурном уровне регистрировались фигуры завершенного фагоцитоза. Фаголизосомы содержали фрагменты стафилококка, нейтрофилов, фибрина. В периферической крови на этот срок процентное содержание моноцитов составляло 14 %, нейтрофилов - 22 %.
Показатели клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком с коррекцией азоксимера бромидом
Через 12 часов от момента введения камер со стафилококком на фоне коррекции азоксимера бромидом вокруг них сформировался мощный лейкоцитарный вал толщиной 328 ± 55 мкм. Концентрация клеток в вале составляла 25,4 ± 0,8 клетки на 1000 мкм2. Соотношение клеточных форм нейтрофил : макрофаг = 5:1. Клетки лежали плотно, наблюдался фагоцитоз нейтрофилами стафилококков, разрушенных фрагментов соединительной ткани и фибрина. Часть нейтрофилов дегранулировала, регистрировались фрагменты разрушенных нейтрофилов. Небольшое количество макрофагов окружало нейтрофильный вал. Они залегали более свободно, наблюдался фагоцитоз макрофагами фибриновых нитей. Зона очага воспаления была отечна. Основные показатели фагоцитоза нейтрофилов составляли: ФИ = 62,5 ± 7,4 %, ФЧ = 8,3 ± 1,3 микробных тел на клетку (табл. 4).
Лейкоцитарная формула периферической крови на этот срок представляла: лимфоциты - 55 %, нейтрофилы - 28 %, моноциты - 15 %, эозинофилы - 1 %, базофилы - 1 %. Наблюдались выраженный нейтрофилез (р 0,05) и умеренный моноцитоз. В периферической зоне очага воспаления на этот срок концентрация нейтрофилов составляла 5,8 ± 1,2 на 1000 мкм2, моноцитов - 5,1 ± 1,3 на 1000 мкм". Регистрировалась выраженная сосудистая реакция подкожной соединительной ткани: вазодилатация, полнокровие микрососудов, диапедез лейкоцитов и их периваскулярная инфильтрация. В периферической зоне очага воспаления наблюдалось незначительное количество малодифференцированных форм фибробластов.
Электрошюмикроскопическое исследование клеток лейкоцитарного вала показало их высокую функциональную активность. Нейтрофилы и макрофаги фагоцитировали фрагменты разрушенных тканей, аутолизированные нейтрофилы, фибрин, стафилококк. В фагоцитах был хорошо развит вакуолярно-лизосомальный аппарат. Эндотелий микрососудов в очаге воспаления содержал множество вакуолей, микропузырьков. Межэндотелиальные щели были расширены, имелись признаки дестабилизации базальной мембраны капилляров.
На срок 1 сутки после введения камер со стафилококком вокруг них продолжалась лейкоцитарная реакция, толщина лейкоцитарного вала составляла 340,0 ± 42,4 мкм, плотность клеток составляла 26,8 ± 1,7 на 1000 мкм" (рис. 23). Соотношение нейтрофил : макрофаг = 3:1. Большая часть нейтрофилов была аутолизирована и представляла клеточный детрит, который активно фагоцитировался макрофагами. Показатели фагоцитоза на этот срок составляли: ФИ = 73,0 ± 8,3 %, ФЧ = 11,0 ± 2,7 микробных тел на клетку (рис. 21 а, б). В периферической крови было повышено процентное содержание нейтрофилов, значительно повышено количество моноцитов (22 %) (р 0,05), относительно снижено количество лимфоцитов.
В периферической зоне очага воспаления наблюдалась активная сосудистая реакция, степень периваскулярнои инфильтрации сохранялась на прежнем уровне. Соотношение нейтрофил : моноцит в этой зоне составляло 1 : 1. Плотность лейкоцитов — 4,1 ± 0,9 на 1000 мкм". Незначительно нарастала концентрация малодифференцированных фибробластов до 2,6 ± 0,3 на 1000 мкм". Ультраструктура лейкоцитов отражала их функциональную активность: в клетках образовались фаголизосомы, внутри которых регистрировались фрагменты разрушенных нейтрофилов, стафилококка и тканевого детрита. Большинство нейтрофилов в вале находилось в стадии аутолиза.
Через 2 суток от начала воспаления толщина лейкоцитарного вала вокруг стенки камер начинала снижаться и составляла 307,5 ± 55,3 мкм. Плотность лейкоцитов в вале оставалась прежней 26,6 ± 1,4 на 1000 мкм . Непосредственно вблизи стенки камеры располагался нейтрофильный детрит и нейтрофилы в стадии аутолиза и дегрануляции. Макрофаги регистрировались по периметру нейтрофилов, соотношение нейтрофил : макрофаг представляло 1 : 1. Фагоцитоз погибших клеток и стафилококка продолжался: ФИ = 74,3 ± 4,3 %, ФЧ = 8,6 ± 0,8 микробных тел на клетку (рис. 27 а, б). Для нейтрофилов был характерен незавершенный фагоцитоз с последующей гибелью клеток, макрофаги полностью переваривали захваченные фагоцитарные частицы. Лейкоцитарная формула периферической крови на этот срок составляла: лимфоциты - 54 %, нейтрофилы - 21 %, моноциты - 25 % (р 0,05), эозинофилы - 0 %, базофилы - 0 %.
В периферической зоне очага воспаления регистрировалось незначительное уменьшение сосудистой реакции, плотность клеток составляла 6,6 ± 1,1 на 1000 мкм2 с преобладанием моноцитов, которые мигрировали в сторону камеры. Продолжалось накопление малодифференцированных фибробластов, концентрация их составляла 2,5 ± 0,3 на 1000 мкм2. Ультраструктурные характеристики фибробластов свидетельствовали о преобладании двигательных потенций над синтетическими, количество отростков 1 -2.
Через 3 суток после введения камер со стафилококком на фоне лечения иммуномодулятором толщина лейкоцитарного вала составляла 300,0 ± 33,7 мкм, плотность клеток в вале продолжала оставаться высокой 25,1 ± 1,5 на 1000 мкм". Соотношение нейтрофил : макрофаг было 1:1. Большая часть нейтрофилов находилась в стадии деградации, основной фагоцитирующей клеткой стал макрофаг (рис. 28 а, б). Свободно лежащих колоний стафилококка не обнаруживалось. Степень отечности и количество отложений фибрина снижались. В периферической крови на этот срок регистрировался относительный рост моноцитов по отношению к нейтрофилам.
По периферии очага воспаления на границе с лейкоцитарным валом появилась тонкая соединительнотканная капсула, состоящая из 3,0 ± 0,3 слоев фибробластов, толщиной 96,0 ± 13,7 мкм с плотностью клеток 3,0 ± 0,5 на 1000 мкм". Фибробласты ориентировались в параллельные ряды, контактировали отростками, регистрировалось незначительное количество коллагеновых волокон. В отдаленной зоне очага воспаления снижалась интенсивность сосудистой реакции, большинство сосудов приходило в нормальное состояние, уменьшалась интенсивность диапедеза лейкоцитов и периваскулярной инфильтрации. В соединительной ткани имелось небольшое количество лейкоцитов, большинство из которых было представлено моноцитами (рис. 26). В этой же зоне регистрировались малодифференцированные фибробласты, плотность которых составляла 3,1 ± 0,6 на 1000 мкм".
На срок 5 суток от начала воспаления около стенки камер сохранялся лейкоцитарный вал толщиной 306 ± 48 мкм, плотность клеток закономерно снижалась до 21,1 ± 2,4 на 1000 мкм2 (рис. 24). Практически все нейтрофилы были разрушены с образованием детрита, состоящего из фрагментов клеток, которые фагоцитировались макрофагами. Макрофаги значительно преобладали над нейтрофилами с соотношением 1 : 3 в пользу макрофагов. Лейкоцитарная формула периферической крови на этот срок состояла: лимфоциты - 77 %, нейтрофилы - 14 %, моноциты - 8 %, базофилы - 1 %, эозинофилы - 0 %. Основной фагоцитирующей клеткой в очаге воспаления становился макрофаг, ультраструктура клеток соответствовала высокой функциональной активности. В фаголизосомах регистрировались все стадии фагоцитоза. В периферической зоне очага воспаления сосудистая реакция снижалась по сравнению с предыдущим сроком. Плотность лейкоцитов, лежащих вне сосудов, составляла 5,8 ± 1,0 клеток на 1000 мкм2, 90 % из них было представлено макрофагами, 10 % - нейтрофилами. Вокруг клеточного вала продолжала образовываться фибробластическая капсула толщиной 230 ± 45 мкм. Капсула имела 4-5 рядов фибробластов, которые ориентировались в параллельные ряды вдоль длиной оси, плотность фибробластов составляла 3,3 ± 0,4 клеток на 1000 мкм". Характеристика внутриклеточных структур фибробластов позволила отнести их к коллагенобластам 2 типа. Синтезированные коллагеновые волокна лежали свободно, внеклеточный матрикс (гликозаминогликаны) в виде аморфного вещества заполнял пространство между фибробластами и коллагеном.
На 7 сутки от начала воспалительного процесса при введении иммуномодулятора в зоне очага воспаления сохранялся достаточно мощный клеточный вал толщиной 293,6 ± 30,6 мкм с плотностыо клеток 19,9 ± 1,1 на 1000 мкм", 90 % которых было зрелыми макрофагами с практически прежней активностью: осуществляли фагоцитоз нейтрофилов, продуктов деградации соединительной ткани. Свободно лежащих колоний стафилококка не регистрировалось. В периферической крови наблюдались повышенный уровень моноцитов и нейтрофилов и относительное снижение лимфоцитов. Соединительнотканная капсула вокруг инородного тела закономерно модифицировалась: становилась более зрелой, нарастало число слоев фибробластов (6 - 7), усиливался синтез коллагена и гликозаминогликанов. Толщина ее на этот срок составляла 278,0 ± 17,5 мкм с плотностыо клеток 4,0 ± 0,4 на 1000 мкм". Большинство фибробластов в вале синтезировало компоненты основного вещества соединительной ткани, преимущественно нити коллагена. В фибробластической капсуле сохранялось незначительное количество моноцитов с плотностыо 4,8 ± 1,1 на 1000 мкм".
Динамика содержания ИЛ-1В, ИЛ-10, кортикостерона, тироксина в плазме крови животных с экспериментальным воспалением
Через 12 часов после введения камер с физиологическим раствором содержание ИЛ-ір в плазме крови животных составляло 1,7 ± 0,4 пг/мл. Затем происходило закономерное падение уровня ИЛ-1(3, содержание которого через 1 сутки составляло 1,2 ± 0,2 пг/мл, через 2 суток - 0,8 ± 0,2 пг/мл. Начиная с 3 суток ИЛ-1(3 в плазме крови не определялся. Содержание ИЛ-10 в плазме крови у животных этой серии через 12 часов снижалось относительно фоновых показателей до 3,6 ± 0,6 пг/мл, затем уровень ИЛ-10 медленно повышался до 5 суток (1 сутки - 10,3 ± 1,4 пг/мл; 2 сутки - 13,1 ± 1,7 пг/мл; 3 сутки - 15,2 ± 1,6 пг/мл; 5 сутки — 15,6 ± 3,2 пг/мл) (табл. 6).
Через 12 часов у животных с асептическим воспалением уровень тироксина в плазме крови животных составлял 89,1 ± 10,9 нмоль/л. Через 1 сутки после начала воспаления регистрировался незначительный подъем уровня тироксина до 93,5 ± 7,3 нмоль/л. Через 2 суток уровень тироксина падал до 65,3 ± 7,9 нмоль/л с дальнейшим подъемом: на 3 сутки его концентрация составляла 86,6 ± 5,3 нмоль/л, на 5 сутки - 104,0 ± 13,6 нмоль/л (рис. 31 б). Уровень свободного тироксина (свободный Т4) у крыс данной серии исследования через 12 часов был равен 15,2 ± 1,3 пмоль/л. Через 1 сутки у животных наблюдалась максимальная концентрация свободного Т4, которая составляла 18,9 ± 1,6 пмоль/л. Через 2 суток после начала воспаления регистрировалось падение уровня свободного Т4 до 12,2 ± 2,4 пмоль/л. В дальнейшем концентрация свободного Т4 возрастала: на 3 сутки - 16,0 ± 2,2 пмоль/л, на 5 сутки - 14,9 ± 0,6 пмоль/л.
У животных, которым вводили камеры со стафилококком, регистрировался подъем уровня ИЛ-1В в плазме крови через 12 часов от начала воспаления, который продолжался и достигал максимума на сроке 2 суток (12 часов - 5,6 ± 0,9 пг/мл; 1 сутки - 11,9 ± 1,9 пг/мл; 2 сутки - 28,9 ± 1,7 пг/мл). Затем уровень ИЛ-1В равномерно снижался к 5 суткам после начала воспаления до фоновых показателей (3 сутки - 7,8 ± 1,6 пг/мл; 5 сутки - 1,1 ±0,3 пг/мл) (табл. 8). Через 12 часов после начала микробного воспаления, вызванного введением камер со стафилококком, концентрация ИЛ-10 падала, по отношению к фоновым показателям, до 4,4 ± 1,0 пг/мл. Затем регистрировался рост уровня ИЛ-10 в плазме крови: 1 сутки - 23,0 ± 6,9 пг/мл, 2 сутки - 50,6 ± 5,9 пг/мл. Далее происходило снижение концентрации ИЛ-10, которая составляла на 3 сутки 27,8 ± 7,4 пг/мл, на 5 сутки - 23,7 ± 6,3 пг/мл (рис. 32).
Концентрация кортикостерона в плазме крови крыс, которым имплантировали камеры со стафилококком, снижалась через 12 часов, по сравнению с фоновыми показателями, до 29,4 ± 3,8 нмоль/л. Затем в течение 1 -2 суток уровень глюкокортикоида достигал нормы, а далее на 3 сутки снижался до 19,9 ± 5,9 пмоль/л. Через 5 суток после начала воспаления содержание кортикостерона в плазме крови составляло 26,6 ± 2,9 нмоль/л (табл. 9). Через 12 часов после введения камер со стафилококком наблюдался незначительный подъем уровня тироксина до 90,9 ± 16,5 нмоль/л. Далее концентрация тироксина снижалась и составляла: на 1 сутки - 78,3 ± 12,9 нмоль/л; на 2 сутки - 51,4 ± 11,3 нмоль/л. Затем концентрация тироксина в плазме крови возрастала: на 3 сутки - 70,7 ± 12,6 нмоль/л, на 5 сутки - 81,9 ± 7,0 нмоль/л (рис. 33). У животных, которым моделировали стафилококковое воспаление, концентрация свободного Т4 возрастала через 12 часов от начала воспалительного процесса, по отношению к фоновым показателям, до 15,0 ± 1,2 пмоль/л. Максимальный уровень свободного Т4 у этой группы животных регистрировался на срок 1 сутки от начала воспаления и составлял 15,9 ± 1,5 пмоль/л. На 2 суток регистрировалось снижение уровня свободного Т4 до 11,5 ± 1,7 пмоль/л. Затем концентрация свободного Т4 медленно нарастала: на 3 сутки - 12,8 ± 2,1 пмоль/л, на 5 сутки - 13,9 ± 1,4 пмоль/л.
Через 12 часов от начала воспаления, вызванного введением камер со стафилококком на фоне коррекции азоксимера бромидом, концентрация ИЛ-ір в плазме крови животных составляла 9,4 ± 3,0 пг/мл, максимум регистрировался на срок 1 сутки - 21,2 ± 2,8 пг/мл, затем уровень ИЛ-ір снижался, но оставался достаточно высоким до 5 суток (2 сутки - 16,3 ± 1,6 пг/мл, 3 сутки - 11,0 ± 1,5 пг/мл, 5 сутки - 5,7 ± 0,9 пг/мл) (табл. 10). Подъем концентрации ИЛ-10 в плазме крови крыс, которым моделировали микробное воспаление с лечением иммуномодулятором, регистрировался через 12 часов до 41,1 ± 8,4 пг/мл по сравнению с фоновыми показателями. Через 1 сутки наблюдалось небольшое падение уровня ИЛ-10 до 31,3 ± 6,7 пг/мл. На срок 2 суток от начала воспаления наблюдалась максимальная концентрация ИЛ-10 в плазме крови животных, которая составляла 84,4 ± 5,8 пг/мл. На сроки 3 и 5 сутки имелось снижение содержания ИЛ-10, хотя уровень его значительно превышал фоновые значения: 3 сутки - 64,8 ± 6,3 пг/мл, 5 сутки - 56,1 ± 4,7 пг/мл (рис. 34). У животных, которым моделировали стафилококковое воспаление с коррекцией азоксимера бромидом, через 12 часов наблюдался значительный подъем уровня кортикостерона до 55,9 ± 6,4 нмоль/л по сравнению с фоновыми показателями. Максимальная концентрация кортикостерона у этой группы животных регистрировалась через 1 сутки после имплантации камер и составляла 64,6 ± 4,7 нмоль/л. Через 2 суток уровень кортикостерона снижался до 42,0 ± 5,6 нмоль/л. Через 3 суток он составлял 46,8 ± 7,5 нмоль/л, через 5 суток уровень гормона приходил к норме - 36,3 ± 4,6 нмоль/л (табл. 11; рис. 35 а).
У крыс со стафилококковым воспалением при коррекции азоксимера бромидом концентрация тироксина в плазме крови в течение 3 суток практически не отличалась от фоновых показателей: 12 часов - 68,8 ± 9,5 нмоль/л, 1 сутки - 68,6 ± 7,3 нмоль/л, 2 сутки - 75,2 ± 10,7 нмоль/л, 3 сутки -71,0 ± 8,8 нмоль/л. На 5 сутки регистрировалось снижение концентрации тироксина в плазме крови до 39,9 ± 5,8 нмоль/л (рис. 35 б). Также до 3 суток воспаления у животных этой серии уровень свободного Т4 практически не отличался от фоновых показателей: 12 часов - 12,8 ± 3,3 пмоль/л, 1 сутки - 12,7 ± 3,1 пмоль/л, 2 сутки - 11,1 ± 1,5 пмоль/л, 3 сутки - 12,0 ± 1,1 пмоль/л. Незначительный подъем уровня свободного Т4 наблюдался на срок 5 суток и составлял 14,5 ± 4,0 пмоль/л.
Таким образом, при асептическом воспалении наблюдалась противоположная динамика выработки одних из ключевых интерлейкинов, синтез корти костерона находился в прямой зависимости с ИЛ-13 с максимальной концентрацией через 12 часов от начала асептического воспаления, концентрации же тироксина практически не отличались от фоновых значений. Выявленные изменения в содержании цитокинов и гормонов при экспериментальном асептическом воспалении обусловили своевременную смену и адекватную продолжительность клеточных реакций.
При стафилококковом воспалении динамика секреции цитокинов и кортикостерона была однонаправленной, при этом выработка глюкокортикоида была угнетена во все сроки исследования, что привело к затягиванию во времени всех клеточных фаз воспалительного процесса. Тиреоидные гормоны у животных этой серии увеличивали концентрации по мере убывания интерлейкинов и кортикостерона. Применение азоксимера бромида приблизило сроки выработки биологически активных веществ у крыс к таковым при асептическом воспалении, при этом синтез противовоспалительных медиаторов был значительно увеличен по сравнению с другими сериями экспериментального воспаления.
