Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Интерлейкин-2: строение, функции, механизмы влияния на жизнедеятельность клетки-мишени 13
1.2. Молекулярные аспекты регуляции апоптоза, опосредованного IL-2 24
1.3. Механизмы дизрегуляции IL-2 - опосредованного апоптоза 34
Глава 2. Материал и методы исследования 47
2.1 Материал исследования 47
2.1.1 Экспериментальный блок исследования 48
2.1.2 Клинический блок исследования 48
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Выделение лимфоцитов крови 53
2.2.2. Культивирование лимфоцитов крови 53
2.2.3. Оценка продукции интерлейкина-2 лимфоцитами 54
2.2.4. Оценка количества лимфоцитов крови, несущих рецептор к IL-2 55
2.2.5. Оценка реализации апоптоза лимфоцитов крови 56
2.2.6. Оценка количества клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальной мембраны 58
2.2.7. Оценка содержания активных форм кислорода в лимфоцитах крови... 60
2.2.8. Оценка уровня факторов транскрипции и белков-регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови 60
2.2.9. Статистический анализ результатов 62
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Исследование IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов 63
3.1.1. Особенности реализации программированной гибели лимфоцитов крови при действии рекомбинантного IL-2 63
3.1.2. Состояние элементов системы IL-2-IL-2R и особенности реализации апоптотической гибели лимфоцитов при клещевом энцефалите 67
3.2. Молекулярные механизмы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов 70
3.2.1. Исследование количества лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и внутриклеточного содержания активных форм кислорода в условиях культивирования с рекомбинантным IL-2 и при клещевом энцефалите 70
3.2.2. Оценка уровня белков семейства Вс1-2 в лимфоцитах крови в условиях культивирования с рекомбинантным IL-2 и при клещевом энцефалите 73
3.2.3. Исследование уровня транскрипционных факторов NFkB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в лимфоцитах в условиях культивирования с рекомбинантным IL-2 и при клещевом энцефалите 80
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 86
Выводы 111
Список литературы 113
- Молекулярные аспекты регуляции апоптоза, опосредованного IL-2
- Механизмы дизрегуляции IL-2 - опосредованного апоптоза
- Оценка количества клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальной мембраны
- Молекулярные механизмы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность исследования
К ключевым системам, обеспечивающим стратегию ^ адаптации макроорганизма к постоянно изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, относится система иммунитета. Одним из фундаментальных механизмов регулирования иммунных реакций является апоптотическая гибель иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 2002], необходимая для установления баланса между их эффективным функционированием, с одной стороны, и своевременным и безопасным удалением — с другой.
Регуляция выживания и гибели иммунокомпетентных клеток осуществляется через цитокиновую сеть, представляющую собой систему клеточных медиаторов и их рецепторов, к числу которых относят игттерфероны, колониестимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины и интерлейкины [Симбирцев А.С., 2004; Prasad T.S. et al., 2009].
Одним из ведущих цитокинов, определяющих жизнедеятельность иммунокомпетентных клеток, является интерлейкин-2 (IL-2), в течение долгого времени известный как ростовой фактор для Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, обеспечивающий их функциональную активацию [Сенников СВ. и соавт., 2004; Лебедев Л.Р. и соавт., 2007]. К настоящему времени установлено, что модулирующее влияние данного клеточного медиатора на танатогенную программу носит двойственный характер. Для объяснения выбора про- или антиапоптотического пути воздействия IL-2 была предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов, согласно которой указанный цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [Потапнев М.П., 2002]. Исход жизни клетки зависит от уровня антигенного и костимулирующего воздействия. В случае его отсутствия экспрессия IL-2 и его клеточного рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. При избытке антигенного
7 воздействия может наступить антигениндуцированный апоптоз Т-клеток, обусловленный связыванием антигена с рецептором и опосредованный воздействием на активированный Т-лимфоцит Fas-лиганда и фактора некроза опухоли a [WalczakH. et al., 1997].
Изменение продукции IL-2 и связанное с этим нарушение реализации танатогеннои программы является причиной многих патологических процессов. Так, избыточная экспрессия IL-2 и IL-2R обнаруживается у большинства опухолевых клеток, потерявших способность к апоптозу, что дает основания рассматривать данный цитокин в качестве одного из факторов малигнизации [Reichert Т.Е. et al., 1998; Eriksen К. et al., 2001]. Высокая интенсивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции IL-2, наблюдается при инфекционной патологии. К примеру, при гепатите С происходит изменение содержания цитозольного Са" , определяющего активность транскрипционного фактора NFAT и, соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice СМ., 2001; Jerome K.R., 2008]. При коровьей оспе отмечается блокирование TcR-индуцированной активации NFAT/AP 1 элемента промотора гена IL-2 [Alonso A.S. et al., 2003].
Для моделирования дисбаланса системы IL-2-IL-2R используются различные приемы, к числу которых относятся нокаутирование гена IL-2 и его рецептора, конструирование генов Р- и у-субъединиц IL-2R и др. [Fanzo J.С. et al., 2006]. Доступным методом, позволяющим изучать молекулярные механизмы проведения сигнала от данного рецепторного комплекса, является культивирование лимфоцитарных клеток в присутствии рекомбинантного IL-2.
Следует признать, что в настоящее время молекулярные ' механизмы дизрегуляции системы IL-2-IL-2R изучены недостаточно, а имеющиеся в литературе данные в рамках обсуждаемой проблемы носят весьма неоднозначный характер. В связи с этим принципиально важным становится исследование молекулярных механизмов IL-2-опосредованных нарушений апоптоза лимфоцитов для поиска новых патогенетически обоснованных технологий управления гибелью клеток.
Цель исследования: выявить роль и молекулярные механизмы участия интерлейкина-2 в регуляции апоптоза лимфоцитов крови.
Задачи исследования:
Установить особенности реализации апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro в концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл.
Оценить внутриклеточный уровень активных форм кислорода и состояние трансмембранного потенциала митохондрий при интерлейкин-2-зависимой гибели лимфоцитов крови.
Определить роль белков семейства Вс1-2, транскрипционных факторов NFkB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в регуляции апоптоза, опосредованного интерлейкином-2.
Провести сравнительную оценку состояния молекулярных механизмов интерлейкин-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов при добавлении рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro и при патологическом процессе, сопровождающемся нарушениями в системе интерлейкина-2 человека (у пациентов с клещевым энцефалитом).
Научная новизна
Получены новые данные фундаментального характера о влиянии интерлейкина-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов крови в зависимости от концентрации цитокина и условий культивирования, а также впервые определены молекулярные мишени интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели. Установлено, что рекомбинантный интерлейкин-2 в конечных концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл дозозависимо оказывает проапоптотическое действие на лимфоциты крови и проявляет протективный эффект в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза данных клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов у здоровых доноров, инкубированных с
9 0,1 нг/мл рекомбинантного интерлейкина-2, повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне накопления в них активных форм кислорода, снижения уровня антиапоптотических белков-регуляторов Вс1-2 и Bcl-XL, активации транскрипционных факторов NFlcB и Р53.
Впервые выявлено, что индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией и сниженной рецепцией лимфоцитами интерлейкина-2, обусловлена участием NFkB, Р53 и митохондриальных факторов (увеличение числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода, дисбаланс белков семейства Вс1-2).
Показана унификация молекулярных механизмов апоптоза иммунокомпетентных клеток как при дисбалансе системы интерлейкина-2 в условиях in vitro, так и при инфекционном процессе (клещевой энцефалит).
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере изменений программированной гибели клеток под действием рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека в зависимости от его концентрации и состояния клеточного микроокружения. Полученные фактические данные раскрывают молекулярные механизмы интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели лимфоцитов, связанные с активацией митохондриального пути и обусловленные участием транскрипционных факторов (NFlcB и Р53) и белков семейства Вс1-2. Основные положения исследования могут служить основой для создания молекулярных технологий управления функциями иммунокомпетентных клеток с использованием цитокинов.
10 Положения, выносимые на защиту:
Рекомбинантный интерлейкин-2 человека оказывает дозозависимые эффекты на реализацию апоптоза иммунокомпетентных клеток: количество апоптотических клеток в культуре лимфоцитов изменяется однонаправленно с концентрацией цитокина в диапазоне 0,1-1,0 нг/мл и обратнопропорционально его дозе на фоне действия дексаметазона.
Дисбаланс системы интерлейкина-2 при культивировании лимфоцитов крови здоровых доноров с рекомбинантной формой данного цитокина и при клещевом энцефалите сопровождается модуляцией апоптотической гибели лимфоцитов крови, реализующейся при участии митохондриальных факторов, активных форм кислорода, NFkB, Р53 и обусловленной смещением баланса Bcl-2-белков в сторону проапоптотических.
Апробация материалов диссертации
Результаты исследования были доложены и обсуждены на VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2009), XIII и XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009), IV Объединенном иммунофоруме (Санкт-Петербург, 2008), X Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), IV Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009).
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунной системы», «Воспаление»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (раздел «Инфекция и иммунитет») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического* комплекса России на 2007-2012 годы» по темам «Работа по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285), «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» (ГК № 02.740.11.0311), а также при финансировании РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (№ 09.04.99025) и Совета по грантам при Президенте РФ по государственной поддержке научных исследований молодых российских ученых-докторов наук по теме «Молекулярные механизмы цитокинопосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по ТЫ- или Тп2-пути» (МД-3842.2009.7) и ведущих научных школ РФ по теме «Роль генетически детерминированной реакции системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения,
12 заключения, выводов и списка литературы, включающего 280 источников, из которых 226 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 24 рисунками.
Молекулярные аспекты регуляции апоптоза, опосредованного IL-2
Взаимодействие между IL-2 и его высокоаффинным рецептором представляет собой один из наиболее тонко контролируемых процессов. Несмотря на значительные достижения в исследовании структуры и функционирования данной системы, молекулярные механизмы, которые управляют сигнальной трансдукцией сигналов, исходящих от IL-2. во многом не определены. Для объяснения выбора про- или антиапоптотического пути воздействия IL-2 предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов [Leonardo M.J., 1991]. Согласно этой теории, IL-2 вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу. Дальнейший путь клетки зависит от уровня антигенного и костимулирующего воздействия. В случае отсутствия антигенного воздействия (через TCR) количество секретируемого IL-2 и его клеточного рецептора падает, в результате этого клетки подвергаются «пассивному» апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после гибели патогена. «Пассивный» апоптоз Т-клеток может быть снижен или отменен цитокинами, рецепторы которых имеют общую у-цепь (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-21) [Фрейдлин И.С., 2001; Симбирцев А.С., 2004]. В случае избытка антигенного воздействия имеет место «активный», или антигениндуцированный апоптоз Т-клеток.
Он обусловлен связыванием антигена с TCR, опосредуется воздействием на активированную Т-клетку FasL и TNFa, блокируется c-FLIP, экспрессия которого подавляется под действием IL-2 [Потапнев М.П., 2002]. В подтверждение данной концепции показано, что IL-2 в высоких концентрациях проявляет антиапоптотический эффект, обеспечивая жизнеспособность активированных Т-лимфоцитов (преимущественно CD8+ Т-клеток), а в комбинации с TGF3 — Th2- и ТЫ-клеток [Singh V., Agrewala J.N., 2006]. При этом Тп2-лимфоциты более устойчивы к апоптотической гибели из-за конститутивной экспрессии большего количества Fas-ассоциированной фосфатазы-1/FAP, которая участвует в дефосфорилировании цитоплазматической части Fas, защищая клетку от Fas-опосредованного апоптоза [Wigginton S. et al., 2001]. Установлено, что тирозинкиназы JAK1 и JAK3, ассоциированые с IL-2RP и IL-2Ry, являются ключевыми медиаторами сигнальной трансдукции антиапоптотического сигнала, опосредованной IL-2 [Boytim M.L. et al., 2000; Lindemarm M.J., 2003]. В работе М. D. Marmor и М. Julius [2001] сообщалось, что поверхность IL-2Ra окружена липидными рафтами — микродоменами плазматической мембраны, богатыми ганглиозидами и холестеролом. В свою очередь, IL-2RJ3 и IL-2Ry, а также JAK1 и JAK3 находятся в растворимых фракциях мембраны, где осуществляется гетеродимеризация данных субъединиц рецептора и активация киназ. Изоляция IL-2Ra внутри липидных микродоменов является фактором, ограничивающим межмолекулярные взаимодействия данной субъединицы, а также ослабляет её ассоциацию с IL-2RP и IL-2Ry, регулируя передачу сигнала [O Shea JJ. et al., 2002]. Лигандиндуцированная агрегация субъединиц IL-2R приводит к совмещению JAK1 и JAK3, обусловливая их фосфорилирование и активацию [Marmor M.D., Julius М., 2001; Moriguchi М. et al., 2005]. Последующее фосфорилирование тирозиновых остатков субъединиц рецептора необходимо для создания сайтов взаимодействия семейства транскрипционных факторов, обозначаемых как сигнальные трансдукторы и транскрипционные активаторы (STATs). Связывание IL-2R с Sm-доменами STAT5a, STAT5b и STAT3 опосредует димеризацию этих белков и транслокацию в ядро, где они регулируют транскрипцию генов-мишеней IL-2 [Sporri В., 2000; Hebenstreit D., 2005] (рис. 5). Одним из таких генов является bcl-2 [Aqeilan R. et al., 2003].
Механизмы дизрегуляции IL-2 - опосредованного апоптоза
Согласно современным представлениям, апоптотическая смерть клетки является фундаментальным процессом регулирования иммунных реакций. Дисбаланс между пролиферацией клеток и их программированной гибелью приводит к развитию иммунопатологических состояний [Ярилин А.А., 2001]. Показано, что ингибирование апоптоза является одним из патогенетических аспектов опухолевой трансформации [Arbuthnot P., Kew М., 2001], а также аутоиммунных и атопических заболеваний [Бойчук СВ., Мустафин И.Г., 2001]. Напротив, неадекватное его усиление имеет место при нейродегенеративных, диспластических процессах и ишемических повреждениях различных органов [Nikitakis N.G. et al., 2004]. Нарушение реализации апоптоза является также основой формирования хронических инфекционных процессов [Бу веров А.О. и соавт., 2000; Дмитриева Е.Ю. и соавт., 2002; Hay S., Kannourakis G., 2002].
Известно, что IL-2, являясь важным цитокином, регулирующим жизнедеятельность иммунокомпетентных клеток, обладает двойственным влиянием на реализацию танатогенной программы [Hildeman D.A. et al., 2002]. Поэтому изменение экспрессии данного клеточного медиатора различными факторами можно рассматривать как один из механизмов дизрегуляции программированной клеточной гибели. В связи с этим не вызывает сомнения необходимость изучения молекулярных аспектов IL-2-опосредованноі о апоптоза как возможной перспективы для разработки путей профилактики и патогенетически обоснованной коррекции заболеваний.
Примером патологических состояний, обусловленных усилением гибели иммунокомпетентных клеток, являются иммунодефициты. Наибольшая часть этих нарушений сопряжена с поражением иммунокомпетентных клеток бактериальными и вирусными агентами, а также изменением" продукции цитокинов или структуры их рецепторов. Показано, что у мышей с отсутствием IL-2RJ3 наблюдаются спонтанная активация Т-лимфоцитов и, как следствие, интенсивная дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки с повышенным образованием аутоантител и развитием гемолитической анемии. У этих животных был значительно снижен ответ на вирусную инфекцию, что связано с дефектом как клеточного, так и гуморального звеньев противовирусного иммунитета [Chen Y. et al., 2005].
Экспериментальное удаление гена IL-2Ry приводило к тяжелому иммунодефициту, затрагивающему процессы созревания и функционирования лимфоцитов. У человека мутации в гене IL-2Ry, ведущие к делеции аминокислотных остатков в положениях 62 и 81, связаны с развитием патологического состояния, известного как сцепленный с Х-хромосомой синдром комбинированной иммунной недостаточности. Это заболевание характеризуется отсутствием или значительным снижением содержания Т-лимфоцитов и резко угнетенными показателями клеточного и гуморального иммунитета [Lindemann M.J., 2002]. Представляет интерес тот факт, что в данном случае в системе цитокиновой регуляции иммунитета не оказалось компенсаторных механизмов, обеспечивающих сохранение функции при дефиците одного из компонентов, как это происходит в отношении многих цитокинов, обеспечивающих функциональную взаимозаменяемость друг друга. Это обусловлено тем, что IL-2Ry фокусирует на себе действие нескольких важнейших цитокинов и её отсутствие не может быть заменено другими рецепторами [Симбирцев А.С., 1998].
Развитие иммунодефицита на фоне дефектной структуры а- и р-цепей IL-2R связано с невозможностью передачи сигнала от данного цитокина на киназы JAK1 и JAK3, в норме ассоциированные с IL-2R[3 и IL-2Ry и являющиеся ключевыми медиаторами сигнальной трансдукции антиапоптотического сигнала, опосредованного IL-2 [Boytim M.L. et al., 2000; Lindemann M.J., 2003]. Этот факт обусловлен тем, что мутации JAK3 являются причиной аутосомно-рецессивного варианта тяжелого комбинированного иммунодефицита, характеризующегося отсутствием Т- и NK-клеток [Frucht D.M., 2001]. Эти мутации сопровождаются минимальным уровнем1" экспрессии функционально активной JAK3, приводящей к дефективной передаче цитокинопосредованного сигнала. Активированные Т-лимфоциты таких пациентов несут на своей поверхности ассиметричный Т-клеточный рецептор (TcR) и оказываются неспособными экспрессировать FasL в ответ на действие IL-2. Предполагается, что остаточная активность JAK3 обеспечивает созревание тимоцитов, но недостаточна для поддержания опосредованного IL-2 гомеостаза периферических Т-клеток через взаимодействие Fas/FasL [Waldman Т., 2001]. IL-2, играя ведущую роль в регуляции клеточной гибели, вовлечен в процесс поддержания периферической толерантности через элиминацию аутореактивных Т-клеточных клонов [Nelson В.Н., 2002]. В связи с этим становится очевидным, что нарушение баланса в системе IL-2-IL-2R способно привести к формированию аутоиммунных заболеваний. Установлено, что у мышей, лишенных гена IL-2Ra, происходит значительное увеличение лимфоузлов вследствие поликлональной активации Т- и В-лимфоцитов с последующим развитием аутоиммунного синдрома, характеризующегося гемолитической анемией и язвенной болезнью кишечника [Симбирцев А.С., 1998].
Сведения, касающиеся дисбаланса IL-2-опосредованной регуляции апоптоза у пациентов с аутоиммунной патологией, представляются весьма противоречивыми. Так, при системной красной волчанке в острый период заболевания наблюдается избыточная экспрессия IL-2, сопровождающаяся угнетением клеточной гибели синовиоцитов [Graninger W.B. et al., 1999]. С другой стороны, установлено, что усиление наработки мРНК IL-2 и sIL-2R является характерным для начального периода аутоиммунного артрита и не встречается на поздних стадиях развития заболевания [Corrigan V.M. et al., 2001]. Аналогичная картина типична для коллагениндуцированного артрита, модели ревматоидного артрита, воспроизводимой на животных [Thornton S. et al., 2000; Frode T.S. et al., 2002]. В то же время А.И. Дубиковым и соавт. [2006] обнаружен закономерный стереотип экспрессии Вс1-2 в зависимости от стадии ревматоидного артрита: от гиперэкспрессии на ранней стадии до гипоэкспрессии на поздней. Можно полагать, что данный белок, являясь мишенью IL-2-опосредованного пролиферативного сигнала, передаваемого по JAK/STAT и PI3K пути [Lauder A. et ah, 2001; Qin J.Z. et ah, 2001; Aqueilan R. et ah, 2003], на ранней стадии заболевания лимитирует количество апоптотических клеток, создавая благоприятный фон для пролиферации, выживания и активного функционирования соответствующих воспалительных элементов.
Оценка количества клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальной мембраны
Количество клеток со сниженным уровнем трансмембранного потенциала митохондрий (А\/) определяли с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Метод основан на том, что флуорохром JC-1 (5,5,6,6-тетрахлора-1,1,3,3-тетраэтилбензимидазол карбо- цианин йодид) способен существовать в двух различных состояниях - агрегатах и мономерах. JC-1-мономер быстро проникает через митохондриальную мембрану живой клетки, в результате чего внутри митохондрии формируются JC-1-агрегаты, характеризующиеся красным спектральным свечением (А=590 нм), которое может быть измерено на FL-2 канале проточного цитометра [Mathur A. et al., 2000]. При деполяризации митохондриальной мембраны, являющейся ранним признаком апоптоза, JC-1 не накапливается внутри митохондрии и находится в цитоплазме в виде мономерной формы. Последняя характеризуется зеленым спектральным свечением (А,=525 нм), регистрируемым в FL-1-канале.
Для постановки реакции в чистую полистериновую пробирку переносили 200 мкл суспензии лимфоцитов, содержащей 2,0-10 -клеток, и центрифугировали 5 мин при 400 g. Удаляли надосадок. К клеточному осадку добавляли 100 мкл свежеприготовленного раствора JC-1. Клетки ресуспендировали и инкубировали 10-15 мин при 37С, затем дважды отмывали PBS («Helikon», США).
Окрашенные JC-1 лимфоциты анализировали на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США), определяя процентное содержание клеток с нормальным уровнем трансмембранного потенциала митохондрий (FL-2 свечение, FL-1 свечение) и процент клеток со сниженным его значением (FL-1 свечение) (рис. 13).
Уровень активных форм кислорода (АФК) в клетках определяли с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией — дихлорфлюоресцеина диацетата (ДХФ-ДА) («Sigma Aldrich», США). Краситель, изначально нефлуоресцирующий, пассивно проникая внутрь клетки, обрабатывается эстеразами (отщепляется ацетатная группа) и переходит в полярное соединение, неспособное диффундировать обратно из клетки. Дихлорофлюоресцеин ацетат после реакции с АФК превращается во флуоресцирующее соединение.
Для определения уровня АФК в чистую полистериновую пробирку переносили суспензию лимфоцитов (с исходным содержанием 2,0 105 клеток в 1 мл) и добавляли 10 мкл рабочего раствора ДХФ-ДА. После 20-минутной инкубации при 37С пробы центрифугировали в течение 3 мин при 1500 об/мкн и удаляли супернатант. Реакцию останавливали 200 мкл позирующего раствора. Затем клетки дважды отмывали PBS, центрифугируя по 3 мин при 1500 об/мин. К образовавшемуся клеточному осадку добавляли 400 мкл PBS и оценивали параметры зеленой флюоресценции в гейте лимфоцитарных клеток, выявленных на FL1-канале, с помощью проточного цитометра Epics XL («Beckman Coulter», США) [Дамбаева СВ. и соавт., 2001].
Рассчитывали свечение на одну клетку как отношение флюоресценции лимфоцитарного гейта к количеству клеток в нем. Результаты исследования выражали в условных единицах (усл. ед.).
Для определения содержания белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Вах, Bad) и транскрипционных факторов (NFkB, Р53 Р21 (WAF1, Сірі)) был использован иммуноблоттинг. Метод позволяет определить искомый антиген в общей смеси клеточных белков и оценить изменения его содержания по сравнению с контролем.
На первом этапе исследования лимфоциты после культивирования (п.п. 2.2.2) подвергали лизированию. Для этого клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин и отмывали холодным PBS, далее добавляли 150 мкл лизирующего буфера, состоящего из 50 мМ Трис-НС1 (рН=6,5), 100 мМ дитиотреитола, 2% додецил сульфата натрия (SDS), 0,1% бромфенолового синего, 15% глицерола («Helikon», США), смеси протеазных ингибиторов («Sigma», США), Р-меркаптоэтанола и PBS, тщательно перемешивали, инкубировали 10 мин на льду, затем 10 мин при 95-100С, центрифугировали при 12000-15000 об/мин в течение 10 мин и удаляли надосадочную жидкость.
Электрофорез полученных лизатов проводили в 5% концентрирующем полиакриламидном геле (0,13 мМ Tris-HCl, рН=6,8) и 10% разделяющем полиакриламидном геле (375 мМ Tris-HCl, рН=8,8), содержащем 0,1 % SDS, 0,1%) PBS, 0,08%) TEMED («Helikon», США). Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля (10 В/см пути). ИСпользовали белковые маркеры молекулярного веса (14,3 - 220,0 kDa, «Fermentas», EU). Фиксацию гелей проводили в 10% растворе трихлоруксусной кислоты, после чего их окрашивали 10% раствором Кумасси G-250 («Acros Organics», Бельгия) в течение 5 ч. Избыток красителя отмывали 5% раствором трихлоруксусной кислоты.
Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически, в течение 80 - 90 мин при силе тока 50 - 60 мА на дорожку. После этого нитроцеллюлозную мембрану трижды промывали 15 мл TTBS (0,05%) Tween-20 в PBS), инкубировали с 5% обезжиренным сухим молоком в TTBS в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Затем мембрану трижды промывали 15 мл TTBS и инкубировали с первичными антителами к исследуемым протеинам в течение 12 ч при 4С на шейкере. В работе были использованы антитела к Вс1-2, Bcl-Хь Вах, Bad, Р53, NFkB, Р21 («Biosource», США) в разведении 1:200. После отмывки 15 мл TTBS мембрану проявляли вторичными моноклональными антителами с пероксидазнои меткой («Biosource», США) в разведении 1:150000 в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Затем мембрану промывали 15 мл TTBS и визуализировали зоны связывания антител с помощью преципитирующего субстрата пероксидазы (субстрат на основе стабилизированного раствора 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидина (НПО «БиоТест Системы», Москва)).
Молекулярные механизмы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов
Оценка уровня клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий (ДЧО, проведенная методом проточной лазерной цитометрии с использованием красителя JC-1, показала, что их количество в интактной культуре лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, составило 2,53(1,21-3,88)%. При культивировании лимфоцитов, полученных у здоровых лиц, с рекомбинантным IL-2 в концентрации 0,100 нг/мл относительное количество лимфоцитов с пермеабилизованной наружной митохондриальнои мембраной достигало 7,61(6,73-9,29)%, что статистически значимо превышало значения аналогичного показателя в интактной культуре (р 0,001) (рис. 14).
Исследование состояния митохондриальнои мембраны лимфоцитарных клеток, выделенных из крови у пациентов с клещевой нейроинфекцией, выявило статистически более высокое содержание лимфоцитов со сниженным A F как при остром клещевом энцефалите, так и при длительной антигенемии вируса [5,48(2,56-9,22)% (р=0,016) и 8,48(7,08-9,06)%, (р 0,001), соответственно] по сравнению со значениями данного параметра в лимфоцитарной культуре, полученной у здоровых доноров (рис. 14).
Здесь и на рис. 15: 1 - интактные лимфоциты здоровых доноров; 2 - лимфоциты здоровых доноров, инкубированные с 0,100 нг/мл rIL-2; 3 - интактные лимфоциты, полученные у больных острым клещевым энцефалитом; 4 - интактные лимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита; АЧ -трансмембранный потенциал митохондрий При сравнительном анализе достоверных различий численности лимфоцитов с депрессированным уровнем АЧ у лиц, страдаюідих острым клещевым энцефалитом, и пациентов с носительством антигена вируса клещевого энцефалита зарегистрировано не было. Между тем, процент лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий в культуре клеток у пациентов с клещевым энцефалитом (острый процесс, хроническая антигенемия) был сопоставим с таковым в культуре клеток здоровых доноров в условиях инкубирования с проапоптотической дозой rIL-2 (рис. 14).
Проведенное исследование уровня активных форм кислорода (АФК) с использованием красителя с заблокированной флуоресценцией ДХФ-ДА показало, что в интактной культуре лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, медиана и интерквартильный размах данного показателя составили 0,017(0,013-0,019) усл.ед. После культивирования данных клетс:;: с rIL-2 в концентрации 0,100 нг/мл отмечалось статистически значимое увеличение уровня АФК до 0,069(0,019-0,170) усл.ед. (р=0,031) (рис. 15).
Оценка содержания АФК в лимфоцитах, выделенных из крови у больных острым клещевым энцефалитом, показала достоверное по сравнению с интактными клетками (р=0,004) увеличение значений изученного показателя до 0,041(0,021-0,510) усл.ед. (рис. 15).
Изучение внутриклеточной интенсивности АФК-продукции лимфоцитов, полученных у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита, выявило, что данный показатель был равен 0,015(0,014-0,019) усл.ед. и достоверно не отличался от соответствующих значений в интактнои культуре клеток (рис. 15).
Сравнительный анализ в зависимости от особенностей течения инфекционного процесса у обследованных пациентов продемонстрировал достоверное увеличение (р=0,027) внутриклеточного уровня активных форм кислорода у лиц с острым клещевым энцефалитом относительно значений аналогичного параметра при длительной антигенемии данного возбудителя (рис. 15).
Резюмируя вышесказанное, важно отметить, что проведенное исследование позволило выявить увеличение содержания клеток со сниженным потенциалом митохондриальной мембраны, сопровождаемое накоплением в них АФК, у пациентов с острым клещевым энцефалитом и в культуре лимфоцитов, полученных у здоровых доноров в условиях инкубирования с rIL-2. При этом у лиц с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита имела место пермеабилизация мембраны митохондрий лимфоцитарных клеток, сочетаемая с неизменным уровнем продукции АФК.
