Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы ц
1.1. Система фактора некроза опухоли альфа и его рецепторов: структура, функции и регуляция 11
1.2. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза, опосредованные фактором некроза опухоли альфа 20
1.3. Механизмы нарушения апоптоза, регулируемого фактором некроза опухоли альфа, и их роль в патогенезе различных заболеваний 31
Заключение 41
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Материал исследования 43
2.1.1. Характеристика экспериментального блока исследования
2.1.2. Характеристика клинического блока исследования 45
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Выделение лимфоцитов крови 47
2.2.2. Культивирование лимфоцитов крови 48
2.2.3. Оценка реализации апоптоза лимфоцитов крови методом проточной лазерной цитофлуориметрии 50
2.23.1. Исследование количества апоптотически измененных лимфоцитов крови в аннексиновом тесте с использованием пропидия йодида 50
2.2.3.2. Регистрация изменения величины мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов крови 51
2.2.4. Оценка уровня активных форм кислорода в лимфоцитах крови 53
2.2.5. Определение продукции фактора некроза опухоли альфа лимфоцитами крови 54
2.2.6. Оценка количества лимфоцитов крови, несущих на своей поверхности рецептор к фактору некроза опухоли альфа I типа 55
2.2.7. Приготовление клеточных лизатов для проведения вестерн-блоттинг'а 56
2.2.8. Определение содержания белков-регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови методом вестерн-блоттинга 56
2.2.9. Статистический анализ результатов исследования 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 59
3.1. Особенности реализации программированной гибели лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы фактора некроза опухоли альфа 59
3.1.1. Изменения количества апоптотических и некротизированных лимфоцитов крови в условиях культивирования с рекомбинантной формой фактора некроза опухоли альфа 59
3.1.2. Молекулярные механизмы участия фактора некроза опухоли'альфа в реализации апоптотической гибели лимфоцитов крови 61
3.1.2.1. Изменения количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и особенности продукции активных форм кислорода лимфоцитами в условиях культивирования с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа 61
3.1.2.2. Уровень транскрипционных факторов NF-kB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ P21WAFI/Cipl в лимфоцитах крови, в условиях культивирования с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа 63
3.1.2.3. Уровень белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 в лимфоцитах крови в условиях культивирования с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа 65
3.2. Особенности реализации апоптотической гибели лимфоцитов крови в условиях различной продукции эндогенного фактора некроза опухоли альфа на клинической модели клещевого энцефалита 67
3.2.1. Состояние элементов системы TNFa - TNF-RI у пациентов с клещевым энцефалитом 68
3.2.2. Исследование числа апоптотически измененных лимфоцитов, изменение количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и уровня активных форм кислорода в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом 69
3.2.3. Уровень белков-регуляторов' апоптоза в лимфоцитах кровиу пациентов с клещевым энцефалитом 72
3.2.3.1. Уровень транскрипционных факторов NF-kB и Р53 в лимфоцитах при клещевом энцефалите 72
3.2.3.2. Уровень белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 в лимфоцитах крови при клещевом энцефалите 73
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 77
Выводы 104
Список литературы 105
- Механизмы нарушения апоптоза, регулируемого фактором некроза опухоли альфа, и их роль в патогенезе различных заболеваний
- Оценка реализации апоптоза лимфоцитов крови методом проточной лазерной цитофлуориметрии
- Особенности реализации апоптотической гибели лимфоцитов крови в условиях различной продукции эндогенного фактора некроза опухоли альфа на клинической модели клещевого энцефалита
- Уровень транскрипционных факторов NF-kB и Р53 в лимфоцитах при клещевом энцефалите
Введение к работе
Актуальность исследования. Патогенез многочисленных заболеваний человека (иммунопатологические состояния, злокачественные новообразования, хронические инфекционные процессы и др.) тесно связан с нарушением клеточной гибели. Одной из ведущих причин дизрегуляции танатогенной программы клеток является изменение продукции клетками и/или модуляция биологических эффектов фактора некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor , TNF) (Bazzoni F., Beutler B., 1996; Aggarwal B.B., 2000; Locksley R.M. et al., 2001; Joussen A.M. et al., 2009). В физиологических условиях TNF участвует в эмбриогенезе, развитии разнообразных тканей, при патологии – играет ведущую роль в формировании воспалительных реакций и специфического иммунного ответа (Ройт А., 2000; MacEwan D.J., 2002; Хаитов Р.М., 2006; Кулинский В.И., 2007). Действие TNF на клетки-мишени осуществляется за счет связывания со своими высокоаффинными рецепторами, расположенными на плазматической мембране, что ведет к интрацеллюлярным реакциям, находящим свое отражение в изменении их функционального статуса, в том числе и посредством инициации клеточной гибели (MacEwan D.J., 2002; Gupta S. et al., 2005).
К настоящему времени выявлена способность TNF инициировать как апоптотическую гибель клеток, опосредованную повышенной секрецией данного цитокина при воспалительных заболеваниях аутоиммунного и инфекционного генеза, так и некроз клеток паренхиматозных органов в условиях гиперпродукции TNF при септических состояниях. При этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством воздействующего на них TNF, что дает основание предположить дозозависимость влияния цитокина на реализацию танатогенной программы. (Faraco P.R. et al., 1999; Van den Berg W.B., 2001; Van Amersfoort E.S. et al., 2003; Lin Y. et al., 2004; Temkin V. et al., 2006; He S. et al., 2009). Однако экспериментальные факты, свидетельствующие в пользу указанного предположения, немногочисленны, что обуславливает целесообразность изучения действия различных концентраций рекомбинантного TNF на инициацию того или иного вида TNF-опосредованной клеточной гибели.
Накопленные к настоящему времени сведения о TNF-зависимых механизмах запуска летальной программы достаточно детально, по сравнению с другими видами цитокиноопосредованного апоптоза, описывают события, происходящие в клетке при реализации TNF-индуцированной апоптотической гибели. Однако вследствие использования исследователями разных клеточных моделей и экспериментальных условий возникают серьезные трудности в интеграции многочисленных разрозненных фактических результатов, касающихся указанной проблемы (Webster G.A., Perkins N.D., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Liu B. et al., 2008). Особенно остро данный вопрос стоит в отношении механизмов мобилизации заключенных в межмембранном митохондриальном пространстве апоптогенных факторов, находящейся под контролем белков семейства Bcl-2 (Jiang P. et al., 2006; Chen X. et al., 2007).
Образование и/или деградация анти- и проапоптотических членов семейства протеинов Bcl-2 регулируется транскрипционными факторами, в том числе NF-kB и Р53. Вовлеченность NF-kB и Р53, а также представителей семейства белков Bcl-2 в реализацию TNF-индуцированной апоптотической гибели не вызывает сомнений. Однако отсутствие единой точки зрения о характере заинтересованности данных регуляторных молекул в TNF-опосредованный апоптоз делает целесообразным проведение комплексного исследования указанных протеинов при действии на клетки рекомбинантного цитокина и при патологии, сопровождающейся повышенной продукцией лимфоцитами TNF. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов и состояний, характеризующихся изменением продукции и рецепции TNF, а также модуляцией его внутриклеточной сигналпередающей системы.
Цель исследования: установить роль белков-регуляторов программированной клеточной гибели (белки семейства Bcl-2 и факторы транскрипции) в регуляции апоптоза лимфоцитов крови при действии фактора некроза опухоли альфа.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
-
Установить дозозависимость влияния фактора некроза опухоли альфа на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови in vitro.
-
Оценить причастность митохондриального пути (количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, внутриклеточный уровень активных форм кислорода) к регуляции апоптоза лимфоцитов крови, индуцированного фактором некроза опухоли альфа.
-
Определить содержание белков-регуляторов клеточной гибели (транскрипционные факторы NF-kB и Р53, ингибитор циклинзависимых киназ P21WAF1/Cip1, протеины семейства Bcl-2) в лимфоцитах крови, полученных у здоровых доноров, при действии рекомбинантного фактора некроза опухоли альфа и у пациентов с острым клещевым энцефалитом, характеризующимся измененной продукцией фактора некроза опухоли альфа.
-
Выявить общие закономерности и особенности влияния фактора некроза опухоли альфа на апоптоз лимфоцитов крови в условиях in vitro и при остром клещевом энцефалите.
Научная новизна. Впервые в условиях in vitro установлено, что рекомбинантный TNF человека дозозависимо влияет на реализацию апоптотической и некротической гибели лимфоцитов крови. Получены новые данные о регулирующей роли транскрипционных факторов NF-kB и Р53, а также о характере изменения баланса белков семейства Bcl-2 при реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток, индуцированного TNF. Установлено, что при инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, на фоне повышенного образования TNF апоптоз лимфоцитов крови реализуется при участии митохондрий, активных форм кислорода и сопряжен с активацией транскрипционных факторов, а также с нарушением соотношения про- и антиапоптотических Bcl-2-белков. Установлено, что дизрегуляция апоптоза лимфоцитов крови как при действии рекомбинантного TNF in vitro в дозе 0,050 нг/мл, так и при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией данного цитокина, обусловлена запуском однотипных молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования фактические данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы участия транскрипционных факторов (NF-kB и Р53) и белков семейства Bcl-2 в TNF-опосредованной регуляции программированной гибели лимфоцитов в условиях in vitro с применением рекомбинантной формы цитокина. Установлена роль данных участников внутриклеточного сигналинга в дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при инфекционной патологии, сопровождающейся повышенной продукцией TNF. Результаты настоящего исследования в дальнейшем могут способствовать раскрытию механизмов побочных эффектов анти-TNF-направленной терапии, а также послужить основой для разработки новых технологий коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, характеризующихся изменением продукции данного цитокина.
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Основы цитофизиологии; старение, гибель клетки, взаимодействие клетки с окружающей средой», «Инфекционный процесс: острые инфекции») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.
Положения, выносимые на защиту:
-
Рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека оказывает прямой регулирующий эффект на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови.
-
В условиях инфекционного процесса, сопровождающегося повышенной продукцией фактора некроза опухоли альфа (на примере клещевого энцефалита), и при культивировании клеток с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа регуляция апоптоза лимфоцитов крови осуществляется посредством молекулярных механизмов, связанных с активацией митохондриального пути, участием активных форм кислорода и транскрипционных факторов (NF-kB и P53), а также изменением соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.
Апробация диссертации. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» (Кемерово, 2008), ХIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Х Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009).
Исследования выполнены в рамках проектов РФФИ – «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150_офи), «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (09-04-99025-р_офи), а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проект «Разработка технологических основ персонализированной терапии и профилактики социально-значимых бактериальных и вирусных заболеваний на основе идентификации молекулярно-генетических механизмов нарушений иммунореактивности системы крови», государственный контракт № 02.512.12.0013 от 01.08.2008 г.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (государственный контракт № 02.740.11.0311 от 07.07.2009 г.), поддержаны грантом Совета при Президенте РФ (государственный контракт № 02.120.11.3842-МД от 24.09.2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них – 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка цитированной литературы, включающего 258 источников, из них - 42 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 13 рисунками.
Механизмы нарушения апоптоза, регулируемого фактором некроза опухоли альфа, и их роль в патогенезе различных заболеваний
Вследствие своей высокой биологической значимости система TNFa и его рецепторов и связанные с ней механизмы внутриклеточного сигналинга могут становиться мишенью действия различных факторов. В результате этого возможна модификация биологических эффектов цитокина, в том и числе и в аспекте регуляции программы клеточной гибели [Rahman М.М., McFadden G., 2006].
Наиболее простым, но вместе с тем распространенным механизмом изменения апоптотической реакции клеток при различных патологических состояниях, является нарушение продукции воздействующего на них TNFa. В частности, изменения продукции провоспалительных цитокинез ч характерны для аутоиммунной патологии. Так, ревматоидный артрит сопровождается повышением синтеза TNFa, стимулирующего образование IL-1 и IL-6, имеющих важное патогенетическое значение, так как в дальнейшем все эти три цитокина участвуют в процессе разрушения костной и хрящевой ткани путем модуляции гибели их клеточных элементов [Van den Berg W.B., 2001]. Данные об изменении содержания TNFa при системной красной волчанке противоречивы [Кричевская О.А. и соавт., 2005]. Ряд " авторов утверждает, что у пациентов с системной красной волчанкой уровень сывороточного TNFa остается неизменным относительно такового у здоровых лиц [Lacki J.K. et al., 1997]. Однако другие исследователи показали, что при системной красной волчанке содержание TNFa в сыворотке крови увеличено, и повышение концентрации цитокина коррелировало с количеством лимфоцитов в состоянии апоптоза [Maury СР., Терро A.M., 1989; Studnicka-Benke A. et al., 1996; Aringer M., Smolen J.S., 2003]. Еще одним примером аутоиммунных заболеваний, патогенез которых тесно связан с нарушением продукции TNFa и, как следствие, с дизрегуляцией TNFa-опосредованного апоптоза, является сахарный диабет типа I. Исследования мышей линии NOD позволили установить, что при сахарном диабете типа І в островках Лангерганса резко повышена продукция TNFa, обуславливающая дальнейшую деструкцию как (3-клеток, так и гепатоцитов, в том числе и путем инициации в них программы апоптоза [BahjatF.R. etal.,2000]. " Секреция больших количеств TNFa, IL-13, IL-6 и IFNy иммуноцитами и/или малигнизированными клетками является одним из путей прогрессии злокачественных заболеваний [Hodge D.R. et al., 2004; Acharyya S. et al., 2004]. Высокие концентрации указанных цитокинов способствуют возникновению условий хронического стресса, селекции злокачественно трансформированных клеток и их иммортализации [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004]. Помимо этого, некоторые опухолевые клетки, в частности, клетки лимфомы Беркитта, образуют преимущественно мембранную форму TNFa (mTNFa), что обусловлено ингибированием TNFa-конвертирующего фермента ТАСЕ. При этом mTNFa, связываясь с рецепторами TNF-RI и TNF-RII, обеспечивает подавление апоптоза и выживание малигнизированных клеток [Zhang Н. et al., 2008]. Механизм модуляции танатогенной программы клеток путем . изменения секреции воздействующего на них TNFa имеет место и при инфекционном процессе. Известно, что в случае бактериального септического шока, характеризующегося резким увеличением количества провоспалительного TNFa, возможна гибель клеток паренхиматозных органов как путем апоптоза, так и путем некроза [Van Amersfoort E.S. et al., 2003; Кулинский В.И., 2007]. С другой стороны, ряд бактерий, относящихся к семейству Yersinia, напротив, вызывают дефицит синтеза TNFa, тем самым ингибируют TNFa-зависимый апоптоз [Navarro L. et al., 2005]. 5 Помимо этого, установлена способность различных вирусов, в частности представителей семейства Poxoviridae, активировать синтез протеинов, либо имитирующих TNFa, либо инактивирующих его путем связывания, что существенно сказывается на реализации танатогенной программы как инфицированных клеток, так и клеток иммунной системы [Nash P. et al., 1999; Rahman М.М., McFadden G., 2006]. Белок A Staphylococcus aureus, образуя комплекс с TNF-RI, является его избирательным агонистом и опосредует запуск TNFa-подобного клеточного ответа, в том числе и апоптоза [Gomez M.I. et al., 2004].
Другим способом воздействия на инициацию интрацеллюлярных реакций, вызываемых TNFa, является изменение презентации рецепторов цитокина - TNF-RI и TNF-RII. Показано, что у вирусов существуют стратегии подавления TNFa-опосредованной индукции апоптоза , инфицированных клеток путем элиминации с их поверхности рецепторов TNF-RI [Herbein G., O brien W.A., 2000]. L. Liang и В. Roizman [2006] зафиксировали аномально короткое время жизни рецепторов к TNFa типа I при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса; кроме того, указанный возбудитель нарушал трансляцию их мРНК. Белок BZLF1 вируса Эпштейна-Барр селективно ингибирует активность промоторного региона гена рецептора TNF-RI [Morrison Т.Е. et al., 2004; Rahman M.M., McFadden G ., 2006]. Аденовирусы могут образовывать с помощью своих протеинов целые специализированные комплексы, работа которых направлена на интернализацию рецепторов TNFa и последующую их лизосомальную деградацию [Chin Y.R., Horwitz M.S., 2005].
Оценка реализации апоптоза лимфоцитов крови методом проточной лазерной цитофлуориметрии
После культивирования лимфоциты переносили в пробирки для проточной цитофлуориметрии, центрифугировали 3 мин для их осаждения, удаляли супернатант, добавляли 1 мл охлажденного фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (рН=7,2), суспендировали на вортексе, затем центрифугировали в течение 3 мин.
Отмытые клетки суспендировали в аннексиновом буфере, содержащем аннексии V, меченный флуоресцеин изотиоцианатом (FITC), а также пропидий йодид («Beckman Coulter», Франция), и инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре.
Анализ образцов проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с аргоновым лазером на основе определения четырёх параметров: малого углового светорассеяния (FSC), характеризующего размер клетки, бокового светорассеяния (SSC), характеризующего цитоплазматические и мембранные особенности клетки (рис. 5), а также зеленой (FITC - А,=530 нм) и оранжевой (пропидий йодид - А,=590 нм) флуоресценции.
Проводился гейтинг исследуемой популяции клеток в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат). Апоптотические клетки идентифицировали по окрашиванию аннексином V, но не пропидий йодидом, некротизированные лимфоциты воспринимали оба красителя (рис. 6) [Pepper A. et al., 1998].
Изменение величины мембранного потенциала митохондрий определяли с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Ключевым реагентом данного набора является JC-1 (5,5 ,6,6 -тетрахлоро-1,Г,3,3 -тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид) - индикатор целостности митохондриальной мембраны, который способен существовать в двух различных состояниях: агрегатах и мономерах. JC-1-мономер быстро проникает через митохондриальную мембрану живой клетки, в результате чего внутри митохондрии формируются JC-1 -агрегаты, характеризующиеся красным спектральным свечением (А=590 нм), которое может быть измерено на РЬ2-канале проточного цитофлуориметра. При деполяризации митохондриальной мембраны, сопровождающейся снижением мембранного потенциала митохондрий, JC-1 не накапливается внутри митохондрии и находится з цитоплазме в виде мономерной формы, которая характеризуется зеленым спектральным свечением (А,=525 нм), что измеряется на FL1-канале [Reers Metal., 1995] (рис. 7).
Для постановки реакции в чистую полистериновую пробирку переносили 200 мкл суспензии лимфоцитов, содержащей 2-Ю5 клеток, и центрифугировали 5 мин при 400 g. К клеточному осадку добавляли 12-5 мкл свежеприготовленного раствора JC-1. Клетки ресуспендировали и инкубировали 10-15 мин при температуре 37С. Затем клетки дважды отмывали ФСБ.
Анализ образцов клеток проводили по оценке интенсивности свечения красителя с помощью проточной цитометрии, определяя процентное содержание клеток с нормальным уровнем митохондриального трансмембранного потенциала (FL2 свечение, FL1 свечение) и процент клеток со сниженным его значением (FL1 свечение).
Уровень АФК в клетках определяли с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией - дихлорфлуоресцеина диацетата (ДХФ-ДА) («Sigma Aldrich», США). Проникая внутрь клетки, ДХФ-ДА расщепляется эстеразами, в результате чего образуемый метаболит ДХФ-ДА способен связываться с АФК, испуская при этом свечение в зеленой области спектра, регистрируемое на проточном цитофлуориметре.
Выделенные лимфоциты крови культивировали в полной питательной среде в 96-ти-луночных планшетах в объеме 200 мкл. После культивирования 90 мкл суспензии клеток в концентрации 1-Ю6 кл/мл переносили в пробирку для проточного цитометра и добавляли 10 мкл рабочего раствора ДХФ-ДА.
Через 20 мин инкубации при 37С в пробу вносили 11 мкл 0,2% раствора этилендиаминтетраацетата на 30 мин при 37С, затем центрифугировали 1 мин при 1500 об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл лизирующего раствора, после чего клетки центрифугировали 1 мин при 1500 об/мин и удаляли супернатант. Клетки однократно отмывали 200 мкл ФСБ. Готовые пробы анализировали на FL1 канале проточного цитофлуориметра Epics XL («Beckman Coulter», Франция), регистрируя флуоресценцию меченых клеток при =525-530 нм. Уровень АФК в клетке рассчитывали как отношение суммарной интенсивности свечения к количеству лимфоцитов. Результаты исследования выражали в условных единицах.
Для определения содержания TNFa в супернатантах культур лимфоцитов использовали твердофазный иммуноферментный (ИФА) «сэндвичевый» метод (ELISA).
Для получения супернатанта выделенные на градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см3) лимфоциты в концентрации 2-10 инкубировали в 2 мл полной питательной среды при 37С на протяжении 24 ч в культуральных флаконах. После инкубации клетки встряхивали, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, клетки осадка исследовали на жизнеспособность с помощью метода, описанного в п.2.2.1.
Процедуру выполнения ИФА проводили по инструкции, предлагаемой производителем тест-системы («Ргосоп», Россия).
Перед началом работы ячейки микропланшета дважды промывали буфером и однократно дистиллированной водой. Затем в соответствующие ячейки добавляли по 100 мкл «0 дозы» и стандартов TNFa с известными концентрациями. В оставшиеся ячейки помещали супернатант в объеме 100 мкл и инкубировали 1 ч при 37С. После четырехкратного промывания (три раза буфером, один раз дистиллированной водой) в каждую ячейку добавляли по 100 мкл раствора вторичных антител и проводили инкубацию в течение 1 ч при 37С. После пятикратной промывки буфером и однократной - дистиллированной водой в каждую ячейку вносили по 100 мкл конъюгата и инкубировали 30 мин при температуре 20-25С. Вновь проводили пятикратную отмывку ячеек буфером и дважды -дистиллированной водой. Затем в каждую ячейку вносили по 100 мкл раствора красителя тетраметилбензидина (ТМБ) и инкубировали при комнатной температуре в затемненном месте. Через 10-15 мин добавляли по 50 мкл «стоп-реагента». Измерение оптической плотности проводили с помощью планшетного фотометра «Multiscan EX» («ThermoLabSystems»
Особенности реализации апоптотической гибели лимфоцитов крови в условиях различной продукции эндогенного фактора некроза опухоли альфа на клинической модели клещевого энцефалита
Для подтверждения правомерности полученных в эксперименте данных для нас явилось целесообразным проведение дополнительного блока исследования по изучению особенностей реализации апоптотической гибели лимфоцитов и молекулярных механизмов ее регуляции в условиях повышенной и нормальной продукции эндогенного TNFa на модели острого клещевого энцефалита и хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита, соответственно.
Предварительный статистический анализ полученных результатов показал, что у здоровых доноров и у пациентов с клещевой инфекцией отсутствуют достоверные внутригрупповые различия (р 0,05) изученных показателей в зависимости от пола и возраста лиц, принявших участие в исследовании, что позволило сформировать соответствующие клинические группы. Кроме того, у пациентов с острым клещевым энцефалитом был,о проведено сравнение показателей в зависимости от формы заболевания (стертая и лихорадочная формы), не выявившее статистически значимых различий (р 0,05).
В настоящем исследовании состояние системы TNFa было оценено по способности лимфоцитов продуцировать данный цитокин, определяемой по концентрации TNFa в культуралъной жидкости указанных клеток, а также по количеству клеток, презентирующих на своей поверхности рецептор TNF-RI.
Анализ полученных данных показал, что у здоровых доноров концентрация TNFa в супернатантах культур лимфоцитов составила 63,23(60,32-66,14) пг/мл (табл. 6).
У больных, страдающих ОКЭ, продукция цитокина была повышенной относительно контрольных значений: содержание TNFa в надосадочной жидкости культуры лимфоцитарных клеток составляло 69,04(65,41-72,67) пг/мл (р 0,05) (табл. 6). Исследование продукции TNFa лимфоцитами крови у лиц с хронической антигенемией вируса КЭ не выявило статистически значимых отличий от таковой у здоровых доноров (р 0,05) (табл. 6).
При цитофлюориметрическом исследовании лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, было установлено, что количество клеток, несущих на своей поверхности TNF-RI-рецептор, составило 3,31(1,58-4,15)% (табл. 6). Содержание TNF-RI-позитивных лимфоцитарных клеток у больных ОКЭ и у лиц с хронической антигенемией вируса КЭ в 4,0 раза и 3,5 раза, соответственно, превышало контрольные значения (р 0,05) (табл. 6).
При сравнительном анализе изученных показателей было установлено, что у лиц с длительной персистенцией вируса КЭ по сравнению с больными, страдающим ОКЭ, продукция лимфоцитами TNFa (р 0,05) ослаблена (табл. 6).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что состояние системы TNFa - TNF-RI при ОКЭ характеризуется повышенной продукцией цитокина лимфоцитами крови и увеличением количества TNF-RI-положительных клеток. У лиц с хронической антигенемией вируса КЭ имеет место иная ситуация, определяемая отсутствием изменения секреции TNFa и повышением доли TNF-RI-презентирующих лимфоцитов.
Проведенное с помощью метода проточной лазерной цитометрии исследование количества лимфоцитов крови в апоптозе, клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и содержания в лимфоцитах АФК позволило выявить ряд закономерностей изменения данных показателей у пациентов с клещевой нейроинфекцией, вызванной вирусом КЭ. Изучение процентного содержания лимфоцитов, претерпевающих апоптотическую гибель, установило, что у здоровых доноров количество клеток в состоянии апоптоза было на уровне 1,69(1,04-3,08)% (табл. 7). У больных ОКЭ было зарегистрировано десятикратное увеличение численности апоптотически измененных лимфоцитарных клеток относительно контрольных значений (р 0,05) (табл. 7). Количество клеток, воспринимающих и FITC-меченный аннексии V, и пропидий йодид, было на уровне 2,10(1,42-3,49)%, а у пациентов с ОКЭ -2,95(1,24-3,90)%, что статистически не отличается от контрольных значений (табл. 7).
Цитофлуориметрическое исследование лимфоцитов обнаружило, что у здоровых доноров количество клеток с пермеабилизированной митохондриальной мембраной составило 2,24(1,34-2,89)% от их общего числа (табл. 7).
Оценка доли клеток, приходящихся на лимфоциты с деполяризованной мембраной митохондрий, у больных ОКЭ показала, что она достигала 6,74(2,56-10,40)%, что было статистически значимо выше значения данного параметра у здоровых лиц (табл. 7). Анализ результатов изучения целостности митохондриальной мембраны лимфоцитов у пациентов с хронической антигенемией вируса КЭ позволил также выявить возрастание численности клеток указанной фракции мононуклеарных лейкоцитов с нарушенной структурой мембраны митохондрий относительно аналогичного показателя у здоровых лиц (р 0,05) (табл. 7).
Как показало проведенное исследование, содержание АФК в лимфоцитах крови у здоровых доноров составило 0,018(0,013-0,019) усл. ед. (табл. 7). У больных ОКЭ было выявлено двукратное увеличение уровня АФК в лимфоцитах по сравнению с таковым у здоровых лиц (р 0,05) (табл. 7). Исследование данного параметра у пациентов с хроническим носительством антигена вируса КЭ показало, что он достоверно не отличался от величины аналогичного показателя у здоровых доноров (р 0,05) (табл. 7). Сравнительный анализ внутриклеточного содержания АФК в лимфоцитах установил, что у лиц с хронической антигенемией вируса КЭ оно статистически значимо снижено (в 2 раза) по сравнению с аналогичным показателем у больных ОКЭ (р 0,05) (табл. 7).
Уровень транскрипционных факторов NF-kB и Р53 в лимфоцитах при клещевом энцефалите
Методом вестерн-блоттинга было установлено, что у здоровых доноров внутриклеточное содержание транскрипционного фактора NF-kB составляло 0,48(0,36-0,52) усл. ед. (табл. 8, рис. 11). В лимфоцитах крови у больных ОКЭ исследование выявило повышение данного показателя относительно значений аналогичного параметра у здоровых доноров (р 0,05) практически на 20% (табл. 8, рис. 11).
Анализ содержания протеина NF-kB в лимфоцитах у пациентов с длительной персистенциеи вируса КЭ показал, что оно повышено на 50% относительно уровня данного транскрипционного фактора у здоровых лиц (р 0,05) (табл. 8, рис. 11). Оценка количества нефосфорилированной формы другого транскрипционного фактора - Р53 позволила зафиксировать снижение содержания данного белка в лимфоцитах в 2 раза у больных ОКЭ относительно аналогичного параметра у здоровых доноров (р 0,05) (табл. 8, рис. 11). Оценка внутриклеточного уровня белков семейства Вс1-2 методом вестерн-блоттинга при клещевой нейроинфекции, вызванной вирусом КЭ, выявила ряд интересных закономерностей. Проведенное исследование показало, что содержание препятствующего развитию танатогенной программы клеток белка Вс1-2 в лимфоцитах у здоровых доноров соответствует 1,30(1,22-1,45) усл. ед. (табл. 9, рис. 12). У больных ОКЭ было обнаружено двукратное снижение (р 0,05) данного показателя относительно его значений, выявленных у здоровых лиц (табл. 9, рис. 12). Оценка количества белка Bcl-2 в лимфоцитах у пациентов с хронической антигенемией вируса КЭ также выявила его уменьшение (р 0,05) в 2 раза по сравнению с таковым у здоровых доноров (табл. 9, рис. 12). Оценка содержания другого антисуицидального протеина Bcl-xL в лимфоцитах у здоровых доноров зафиксировала значение данного показателя на уровне 1,90(1,59-1,98) усл. ед. (табл. 9, рис. 12). При этом у больных ОКЭ в лимфоцитарных клетках количество указанного белка было достоверно ниже контрольного значения (практически в 4 раза, р 0,05) (табл. 9, рис. 12).
Уровень протеина Bcl-xL в лимфоцитах у пациентов с длительным присутствием антигена вируса КЭ был статистически значимо меньше величины аналогичного показателя у здоровых лиц в 3 раза (табл. 9, рис. 12). Оценка количества проапоптотического белка семейства Вс1-2 — мультидоменного Вах в лимфоцитах крови у здоровых доноров показала, что оно составило 0,97(0,87-1,04) усл. ед. (табл. 9, рис. 12). Содержание данного белка в лимфоцитах крови при ОКЭ и у лиц с длительной антигенемией вируса КЭ статистически значимо не отличалась от такового у здоровых доноров (р 0,05) (табл. 9, рис. 12). Исследование количества промотирующего апоптоз протеина Bad в лимфоцитах крови показало, что в клетках здоровых доноров значение зтоі о показателя составило 0,57(0,51-0,59) усл. ед. (табл. 9, рис. 12). У пациентов с ОКЭ и с хронической антигенемией вируса КЭ в лимфоцитарных клетках содержание Bad не изменялось относительно значения контрольного уровня данного белка в клетках у здоровых лиц (р 0,05) (табл. 9, рис. 12). Таким образом, проведенное исследование выявило факт вовлеченности в дизрегуляцию апоптоза лимфоцитов при ОКЭ и антигенемии вируса КЭ транскрипционных факторов NF-kB и Р53, ингибирующих реализацию танатогенной программы белков Вс1-2 и Bcl-xL, а также проапоптотического протеина Bad.
