Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Этиология, патогенез, клиника и гематологические проявления инфекционного мононуклеоза 11
1.2. Морфо-функциональные и метаболические изменения мононуклеарных клеток периферической крови при инфекционном мононуклеозе 17
1.3. Фенотипическая характеристика лимфоцитов при инфекционном мононуклеозе. Роль отдельных субпопуляций лимфоцитов в противовирусном иммунитете при инфекционном мононуклеозе 21
1.4. Роль цитокинов и особенности цитокинового статуса при инфекционном мононуклеозе 24
1.4.1. Интерферон (IFN) у 25
1.4.2. Фактор некроза опухоли 26
1.4.3. Трансформирующий фактор роста (TGFJ3) 29
1.5. Апоптоз цитотоксических лимфоцитов периферической крови. Роль цитотоксических лимфоцитов периферической крови в индукции и реализации апоптоза 29
1.6. Антителозависимая клеточная цитотоксичность при инфекционном мононуклеозе 35
Заключение 38
Глава 2. Материал и методы исследования 40
2.1. Характеристика групп исследования 40
2.1.1. Клинико-лабораторная характеристика больных инфекционным мононуклеозом, вызванным вирусом Эпштейна-Барр 42
2.1.2. Клинико-лабораторная характеристика больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии 43
2.2. Материал исследования 44
2.3. Методы исследования 44
2.3.1. Метод выделения лимфоцитов из цельной крови 44
2.3.2. Оценка экспрессии CD-рецепторов на лимфоцитах периферической крови в лимфоцитотоксическом тесте 45
2.3.3. Оценка экспрессии CD-рецепторов на лимфоцитах периферической крови методом поверхностной иммунофлуоресценции 46
2.3.3.1. Оценка экспрессии CD95L, CD119 46
2.3.3.2. Оценка экспрессии CD120a 47
2.3.4. Идентификация annexin V-положительных лимфоцитов иммунофлуоресцентным методом 47
2.3.5. Определение продукции цитокинов в культуре лимфоцитов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) 48
2.3.6. Определение содержания гранзима В в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) 49
2.3.7. Спектрофотометрический метод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности 50
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 51
Глава 3. Результаты собственных исследований 52
3.1. Уровень экспрессии CD4, CD8 и CD 16 на лимфоцитах периферической крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом , вызванным вирусом Эпштейна-Барр 52
3.2. Уровень экспрессии CD4, CD8 и CD 16 на лимфоцитах периферической крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии... 52
3.3. Уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом, вызванным вирусом Эпштейна-Барр 55
3.4. Уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии 56
3.5. Уровень секреции цитокинов лимфоцитами периферической крови in vitro у детей, больных инфекционным мононуклеозом 59
3.6. Уровень гранзима В в сыворотке крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом 62
3.7. Содержание CD119- и СО120а-экспрессирующих лимфоцитов в периферической крови больных инфекционным мононуклеозом , вызванным вирусом Эшнтейна-Барр 64
3.8. Содержание CD119- и СО120а-экспрессирующих лимфоцитов в пери ферической крови больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии 66
3.9. Уровень антителозависимой клеточной цитотоксичности у детей, больных инфекционным мононуклеозом 67
Глава 4. Обсуждение результатов 70
Выводы 95
Список литературы 97
- Морфо-функциональные и метаболические изменения мононуклеарных клеток периферической крови при инфекционном мононуклеозе
- Клинико-лабораторная характеристика больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии
- Уровень экспрессии CD4, CD8 и CD 16 на лимфоцитах периферической крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии...
- Содержание CD119- и СО120а-экспрессирующих лимфоцитов в периферической крови больных инфекционным мононуклеозом , вызванным вирусом Эшнтейна-Барр
Введение к работе
Актуальность исследования. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения, ХХI век станет веком оппортунистических инфекций. Ежегодно в России регистрируется около 30-40 млн. инфекционных больных, до 80% населения Земли инфицировано вирусами семейства герпеса. Детский организм имеет большую восприимчивость к инфекционным факторам, поэтому смертность от инфекционных болезней у детей составляет около 63%. К одной из наиболее актуальных детских инфекций относится инфекционный мононуклеоз. Этиологическим фактором инфекционного мононуклеоза в подавляющем большинстве случаев является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Реже мононуклеоз вызывают другие вирусы (вирусы простого герпеса, цитомегалии, кори, краснухи) и Toxoplasma gondii [Помогаева А.П. и соавт., 2003; Иванова В.В., 2005; Потарская Е.В. и соавт., 2006; Краснов В.В., 2007].
ВЭБ обладает тропностью к эпителиальным клеткам носоглотки и к иммунокомпетентным клеткам крови – лимфоцитам, моноцитам/макрофагам, нейтрофилам. В-лимфоциты после внедрения вируса в геном трансформируются в ВЭБ-презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной пролиферации, в результате чего вирус может длительно персистировать в организме, приводя тем самым к структурно-функциональной дезорганизации и истощению иммунной системы [Харламова Ф.С. и соавт., 2006; Mendes T. et al., 2008].
Эффективный иммунный ответ на внедрение ВЭБ включает гуморальный и клеточный компоненты. Формируются нейтрализующие ВЭБ антитела (IgM и IgG) к капсидному, раннему, мембранному, нуклеарному антигенам. Элиминация вируса и инфицированных клеток осуществляется за счет естественных клеток-киллеров, CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов. Т-клетки вырабатывают цитотоксические медиаторы и вызывают Fas/Fas-L-опосредованный апоптоз зараженных В-лимфоцитов. Однако ВЭБ может противодействовать иммунитету макроорганизма, создавая «дружественное» микроокружение, и выживать в организме хозяина в течение всей его жизни. Вирус вызывает усиление экспрессии Fas (СD95) на CD4+ и CD8+ лимфоцитах и Fas-L на В-лимфоцитах, что ведет к гибели Т-клеток, в основном Т-клеток памяти. Данный процесс может лежать в основе клеточно-опосредованной транзиторной иммуносупрессии [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2002; Жукова О.Б. и соавт., 2002, 2006; Андреева А.А., 2006; Scherrenburg J. et al., 2008; Ito Y., 2009].
В связи с этим, изучение роли лимфоцитов-киллеров при инфекционном мононуклеозе представляется важным как для понимания иммунопатогенеза заболевания, так и для создания средств специфической профилактики вызываемой вирусом дизрегуляции системы специализированных клеток-киллеров и хронизации инфекционного процесса.
Цель исследования: выявить особенности и патогенетические факторы функционального дисбаланса цитотоксических T-лимфоцитов и NK-клеток крови у детей при инфекционном мононуклеозе.
Задачи исследования:
-
Оценить экспрессию CD4, CD8, CD16, CD119, CD120 лимфоцитами периферической крови и продукцию интерферона (IFN) , фактора некроза опухоли (TNF) , трансформирующего фактора роста (TGF) in vitro у детей 1-6 и 7-14 лет, больных инфекционным мононуклеозом Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии, в период разгара и фазу ранней реконвалесценции.
-
Охарактеризовать апоптоз-индуцирующую и цитолитическую активность T- лимфоцитов и NK-клеток (натуральных киллеров) периферической крови у детей в возрасте 1-6 и 7-14 лет при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр и другими возбудителями, в период клинико-гематологической манифестации и на этапе выздоровления.
-
Установить общие закономерности, особенности и патогенетические факторы нарушений лимфоцит-опосредованной цитотоксичности у детей, больных инфекционным мононуклеозом, в зависимости от возрастных особенностей организма, этиологии и фазы заболевания.
Научная новизна. Оценены реакции цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток периферической крови у детей при инфекционном мононуклеозе Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии в динамике заболевания. Получены данные о том, что у детей 1-6 и 7-14 лет, больных инфекционным мононуклеозом, наряду с повышением абсолютного содержания CD4+, CD8+ и CD16+ лимфоцитов в крови в фазу клинико-гематологической манифестации (с тенденцией к его нормализации в фазу реконвалесценции), отмечается усиление антителозависимой клеточной цитотоксичности и повышенное содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих СD95, СD95L, TNF-RI и annexin V. Данные изменения свидетельствует об активации цитолитических свойств СD16+-киллеров и апоптогенной (Fas- и TNF-RI-зависимой) функции T- и NK-клеток. При этом дефицит сывороточной концентрации гранзима В и стимулированной продукции IFN и TNF in vitro на фоне компенсаторной гиперэкспрессии рецепторов цитокинов CD119, CD120 характеризуют снижение функционального резерва цитотоксических (по данным корреляционного анализа, преимущественно CD8+) лимфоцитов, что в условиях гиперпродукции TGF может быть определено как проявление иммуносупрессорного эффекта. Обосновано, что дисбаланс реакций лимфоцит-опосредованной цитотоксичности при инфекционном мононуклеозе у детей сопряжен с этиологией и фазой заболевания и является более выраженным у детей в возрасте 1-6 лет. При этом изменения субпопуляционного состава лимфоцитов с цитотоксической активностью наиболее значимы при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр, а уровень апоптогенного действия Т- и NK-клеток – при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.
Практическое и теоретическое значение работы. Новые знания о механизмах дисфункции цитотоксических лимфоцитов и естественных клеток-киллеров у детей 1-6 и 7-14 лет при инфекционном мононуклеозе Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии в острый период и фазу ранней реконвалесценции могут быть использованы для разработки дифференциальных патогенетических подходов к иммунокорригирующей терапии, для профилактики индуцированных вирусом нарушений цитоповреждающего действия специализированных «клеток-убийц» и хронизации инфекционного процесса.
Положения, выносимые на защиту:
-
Развитие инфекционного мононуклеоза у детей сопровождается увеличением числа CD4+, CD8+, CD16+ лимфоцитов в крови, активацией их апоптогенной и антителозависимой цитолитической функций в сочетании с истощением резерва продукции цитотоксических медиаторов. Структурно-функциональный дисбаланс клеток сохраняется в фазу ранней реконвалесценции, а его выраженность зависит от этиологии заболевания и возрастных особенностей организма.
-
Наиболее существенные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+) формируются у детей 1-6 лет при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр. При этом уровень экспрессии лимфоцитами CD95, CD95L и TNF-RI, характеризующий наряду с увеличением количества annexin V+ клеток способность цитотоксических Т- и NK-лимфоцитов к индукции апоптоза, выше при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.
-
Супрессия Т- и NK-клеточной цитотоксичности в условиях гиперсекреции TGF при инфекционном мононуклеозе у детей проявляется дефицитом гранзима В в сыворотке крови и стимулированной продукции IFN, TNF in vitro на фоне компенсаторной активации экспрессии CD119-, CD120-рецепторов цитокинов.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на 66-й, 67-й научных студенческих конференциях им. Н.И. Пирогова (Томск, 2007, 2008), VIII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), VIII международной российско-германской конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекционные заболевания» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии», посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009) и научно-образовательных семинарах при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2008, 2009). Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава на кафедре патофизиологии в разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови» и на кафедре детских инфекционных болезней в лекционных и практических курсах по теме инфекционного мононуклеоза.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 188 источников, из них 115 отечественных и 73 зарубежных авторов.
Морфо-функциональные и метаболические изменения мононуклеарных клеток периферической крови при инфекционном мононуклеозе
При нормальном иммунном ответе в процессе его становления при герпесвирусных инфекциях основную роль играют клеточные механизмы, связанные с действием Т-эффекторов, включая специфические цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), и клеток системы мононуклеарных фагоцитов - макрофагов. Гуморальные факторы в развитии противовирусной резистентности менее значимы, антитела (AT) рассматривают как «свидетелей» иммунного ответа на вирус. AT работают как вируснейтрализующие при литическом варианте репродукции вируса и при его распространении от одной клетки к другой, но вирус может избегать действия AT, распространяясь по цитоплазматическим мостикам между клетками [Харламова Ф.С. и соавт., 2006; Chaganti S., 2009].
Исход первичного инфицирования, частоту и напряженность рецидивов заболевания определяет клеточный иммунитет. Основными клетками врожденного иммунитета являются моноциты/макрофаги, дендритные клетки, натуральные киллеры (NK). Они обеспечивают первый эшелон защиты, организуют реакции приобретенного иммунитета - работу CD4+ и CD8+ ЦТЛ [Cozad J., 1996; Toren А., 1996].
Основная обязанность натуральных киллеров - выявлять и уничтожать собственные клетки организма, зараженные вирусами. Разрушение клеток-мишеней осуществляется лишь при образовании тесного контакта с NK лимфоцитами. Этот контакт может быть прямым или опосредованным, при котором NK-лимфоциты прикрепляются к покрытым IgG клеткам-мишеням через рецептор к Fc-фрагменту IgG - антителозависимая клеточная цитотоксичность. Благодаря этому механизму могут быть разрушены клетки-мишени, первоначально устойчивые к действию NK-лимфоцитов [Anagnostopoulos I., 1995; Аттауллаханов Р.И., 2005].
Цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры) непосредственно контактируют с чужеродными клетками и разрушают их [Doherty Р.С., 1998; Ахматова Н.К., 2007]. Они отличаются широкой специфичностью и способны распознавать чужеродные структуры (антигены) только в том случае, если они экспрессированы на поверхности инфицированной клетки. Как и В-лимфоциты, каждая Т-клетка для распознавания антигена в комплексе с клеточным маркером, имеет специфический рецептор (TCR). В процессе распознавания поверхностного антигена цитотоксический Т-лимфоцит вступает в теснейший контакт со своей мишенью и уничтожает ее до начала репликации. Кроме того, он продуцирует интерферон у, который ограничивает проникновение вируса в соседние клетки [De Paoli P., 1990; Иванова В.В., 2005; Wingate P., 2009].
Цитотоксические Т-лимфоциты играют важнейшую роль в уничтожении клеток, зараженных вирусами, в том числе при инфекционном мононуклеозе. Большинство цитотоксических Т-лимфоцитов относится к субпопуляции CD8 и распознает антиген, презентированный в ассоциации с молекулами МНС класса I, но меньшая их часть (примерно 10%), относящаяся к субпопуляции CD4+, способна распознавать антиген в ассоциации с молекулами МНС класса II [Elliott S., 2008]. Для активации и поражения мишени ЦТЛ используют несколько механизмов воздействия. Один из них - это передача сигналов при непосредственном клеточном контакте через поверхностные структуры, другой - непрямая сигнализация с помощью цитокинов. Кроме того, в цитоплазме многих цитотоксических клеток обнаружены гранулы с белками, высвобождение которых вблизи цитоплазматической мембраны клетки-мишени вызывает ее повреждение [Хаитов P.M., 2000; Гранитов В.М., 2001].
Поверхностная цитоплазматическая мембрана выполняет центральную роль в организации и функционировании живой клетки. Установлено, что мембрана участвует в процессе связывания лимфоцитов с различными антигенами, в межклеточном взаимодействии В-, Т-лимфоцитов и макрофагальных клеток, в реакциях фаго- и пиноцитоза [Уразова О.И., 2003].
В результате проведенного топографического исследования лимфоцитов О.И. Уразовой и соавт. [2002] было установлено, что в фазу развернутой клинико-гематологической картины ИМ у детей отмечалось увеличение по сравнению с нормой количества гладких форм клеток при одновременном снижении числа лимфоцитов с нитевидными и ламеллярными выростами на мембране. Помимо этого в крови у больных ИМ отмечалось появление атипичных лимфоцитов с «переходной» поверхностью (предположительно, трансформированных вирусом клеток). На стадии клинического выздоровления у детей количество гладких и ламеллярных форм лимфоцитарных клеток нормализовалось, а количество лимфоцитов с нитевидными образованиями оставалось сниженным по сравнению с контрольными значениями. Переходные формы лимфоцитов выявлялись у детей, как в фазу реконвалесценции, так и через 16-18 месяцев после болезни. Как полагают авторы, изменения поверхностной архитектоники лимфоцитарных клеток при ИМ обусловлены изменением соотношения циркулирующих Т- и В-клеточных фракций, а именно увеличением в популяции Т-лимфоцитов, для которых гладкий тип поверхности мембраны является дифференциальным признаком, а также (что наиболее вероятно) снижением функциональной активности инфицированных лимфоцитов [Новицкий В.В., 1999; Уразова О.И., 2000].
Клинико-лабораторная характеристика больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии
Только у детей старшей возрастной группы (7-14 лет) выявлялись холестаз и гнойно-некротическое поражение ротоглотки. Практически у всех больных ИМ-ВЭБ независимо от возраста наблюдалось увеличение СОЭ (до 22,5 мм/ч в среднем). В ряде случаев заболевания ИМ-ВЭБ выявлялось снижение содержания гемоглобина, эритроцитов. Наиболее выраженные изменения регистрировались со стороны показателей белой крови. Наблюдались лимфоцитоз и моноцитоз на фоне повышения общего количества лейкоцитов. У некоторых больных отмечалась нейтропения. Характерное для ИМ появление в крови атипичных мононуклеров (AM) выявлялось у 74,2% детей, больных ИМ-ВЭБ. Количество их варьировало в пределах от 1 до 25%. Диагноз ИМ другой этиологии был выставлен 28 больным. У всех больных регистрировалась среднетяжелая форма инфекции, гладкое течение -у 17 (60,7%), негладкое-у 11 (39,3%) пациентов. Заболевание сопровождалось развитием общетоксических симптомов, в том числе повышением температуры тела до фебрильных цифр (39,0С) и выше. У 12 (42,9%) больных отмечалось нарушение носового дыхания (слизистое отделяемое, "храпящее дыхание"). Увеличение лимфатических узлов (чаще тонзиллярных, шейных и паховых) обнаруживалось практически у всех наблюдавшихся пациентов. Отек подкожной клетчатки вокруг лимфоузлов фиксировался у 4 (14,3%) больных. Изменения со стороны ротоглотки были представлены гиперемией и гиперплазией миндалин.
В периферической крови у всех детей, больных ИМ другой («неВЭБ») этиологии, независимо от возраста отмечались увеличение СОЭ (в среднем до 22,7 мм/ч), лейкоцитоз (в среднем 9,35х109/л), палочкоядерный нейтрофилез (до 6-17%). Лимфоциты составляли в среднем 40% от общего количества лейкоцитов, моноциты - в среднем 10%. AM (4-22%) обнаруживались у 15 (53,6%) больных. Материалом исследования являлась кровь, полученная путем пунктирования локтевой вены утром натощак. Объектом исследования были лимфоциты периферической крови Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови (25 Ед/мл). В соотношении 1:1 наслаивали плазму на градиент плотности фиколл-урографина (р= 1,077 г/см ) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. После этого «белое» интерфазное кольцо (мононуклеарные лейкоциты) собирали пипеткой и переносили в другую пробирку с 5 мл отмывающего раствора (реактив Хэнкса), отмывали дважды в течение 5 мин при 3000 об/мин, каждый раз удаляя надосадок и ресуспендируя. Для отделения моноцитов суспензию отмытых лейкоцитов вносили в чашки
Петри с предварительно помещенными в них покровными стеклами размером 8x8 мм и инкубировали при 37С в течение 1 ч. Затем стекла с прикрепленными к ним моноцитами извлекали, а содержимое чашки переносили в пробирку. После повторного центрифугирования к осадку добавляли 1 мл полной питательной среды, состоящей из 90% RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 2мМ/мл HEPES. Полученную взвесь лимфоцитов использовали для оценки экспрессии CD-рецепторов (лимфоцитотоксический тест, иммунофлуоресцентный анализ), активности секреции цитокинов (иммуноферментный анализ), апоптоза (иммунофлуоресцентный анализ), реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности - АЗКЦ (спектрофотометрический метод). Определение концентрации выделенных клеток в суспензии и их жизнеспособности проводили в счетной камере Горяева [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Для подсчета лимфоцитов в камере Горяева к 20 мкл лимфоцитарной взвеси добавляли 400 мкл уксусной кислоты. Лимфоциты считали в больших «учетверенных» квадратах, затем полученное число делили на 20 и получали объем клеток в 1 мл. Для определения жизнеспособности лимфоцитов 0,1 мл клеточной суспензии смешивали с равным объемом 0,5% раствора трипанового синего ("Serva", США) и переносили в камеру. Жизнеспособность мононуклеаров оценивали по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет (%). CD-рецепторы (CD4, CD8, CD 16, CD95) определяли на лимфоцитах, выделенных из крови на градиенте плотности фиколл-урографина (р= 1,077 г/см3), рабочая концентрация лимфоцитов была равной 2,5x10б клеток/мл. К 40 мкл лимфоцитарной взвеси добавляли по 5 мкл соответствующих моноклональных антител (МАТ) (ООО «Сорбент», г. Москва), инкубировали в течение 35-40 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин и снимали надосадок (30 мкл). К осадку добавляли по 25 мкл сыворотки кролика и инкубировали 90 мин при комнатной температуре, останавливали реакцию при 4С, помещая пробы в холодильник. Добавляли по 1 капле 0,2% эозина и подсчитывали число окрашенных лимфоцитов в препарате «раздавленная капля» из расчета на 100 клеток, а также в абсолютных значениях (от общего количества лейкоцитов крови, 10 /л). Принцип работы набора состоит в одностадийной процедуре иммунофлуоресцентного окрашивания антигенположительных клеток. Происходит специфическое связывание МАТ с соответствующими поверхностными антигенами клеток периферической крови и «проявление» реакции окрашиванием связавшихся антител флуоресцеина изотиоцианат (Р1ТС)-конъюгатом. Регистрация результатов производится визуально методом флуоресцентной микроскопии. Для оценки экспрессии на лимфоцитах CD-рецепторов (CD95L, CD 119) на чистые обезжиренные стекла наносили по 25 мкл лимфоцитарной взвеси в рабочей концентрации 1 106 клеток/мл, инкубировали в течение 30 мин во влажной камере. Во время инкубации клетки оседали на стекло, надосадок собирали фильтровальной бумагой. Затем дожидались полного высыхания мазка при комнатной температуре. После этого фиксировали мазок в холодном ацетоне в течение 8-10 мин.
Уровень экспрессии CD4, CD8 и CD 16 на лимфоцитах периферической крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом другой этиологии...
В период выздоровления у пациентов в возрасте 1-6 лет относительное количество лимфоцитов, несущих CD4-, CD8-антигены, нормализовалось, в то время как абсолютное их число (также как и абсолютное число CD16+ лимфоцитов) по-прежнему было выше нормы. У детей 7-14 лет отмечалась нормализация абсолютного количества CD8+ и CD16+ лимфоцитов. При этом абсолютное число CD4+ лимфоцитов, несмотря на снижение, оставалось выше контрольных значений (табл. 2). Таким образом, изменения субпопуляционного состава лимфоцитов крови у детей, страдающих ИМ, в период разгара заболевания характеризуются увеличением (по сравнению с нормой) числа CD4+, CD8+, CD16+ клеток в крови. При этом выявляется определенного рода закономерность: увеличение одновременно относительного и абсолютного числа CD4 , CD8 клеток имеет место только у детей младшего возраста с ИМ ВЭБ- и другой этиологии, в то время как у детей 7-14 лет устанавливается увеличение только абсолютного содержания лимфоцитов данных субпопуляций в крови, относительное же их число сохраняется в пределах нормы. Наряду с этим, повышение относительного числа CD16+ лимфоцитов отмечается только при ИМ-ВЭБ у детей обеих возрастных групп. При ИМ другой этиологии оно остается нормальным. Абсолютное же число клеток с указанным фенотипом увеличивается и при ИМ-ВЭБ и при неВЭБ-ИМ у детей 1-14 лет. В целом можно сделать вывод о том, что описанные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов крови наиболее значимы у детей 1-6 лет, чем у детей 7-14 лет и носят более выраженный характер при ИМ ВЭБ-этиологии, чем при ИМ другой этиологии.
В период реконвалесценции процентное соотношение CD4+, CD8+, CD16+ лимфоцитов в крови полностью восстанавливается, абсолютное их число - проявляет тенденцию к нормализации. При этом нужно заметить, что абсолютное число С04-позитивных лимфоцитарных клеток у детей старшего возраста в острый период ИМ другой этиологии оказалось практически в 3 раза выше, чем при ИМ-ВЭБ. В последнем случае в период клинического выздоровления оно существенно возрастало по отношению к фазе манифестации заболевания, в то время как в остальных группах претерпевало понижение по направлению к норме. Кроме того, сравнительная статистическая оценка количественного соотношения CD-фракций лимфоцитов позволила выявить, что у реконвалесцентов в возрасте 1-6 лет, больных ИМ ВЭБ- и другой этиологии, абсолютное число CD4+ клеток было намного (в 1,4 раза) ниже, чем у реконвалесцентов 7-14 лет, а количество CD8+ и CD16+ клеток, наоборот, выше. Также у больных дошкольного возраста с ИМ другой этиологии в период реконвалесценции абсолютное число CD8+ лимфоцитов в 1,3 раза превышало их содержание у пациентов с ВЭБ-мононуклеозом аналогичного возраста. Острый период болезни. При ВЭБ-мононуклеозе в острый период заболевания в периферической крови отмечалось достоверное повышение (по сравнению с нормой) относительного содержания CD95+ лимфоцитов, С095Ь-экспрессирующих лимфоцитов и annexin V-положительных клеток соответственно в 1,8, 2 и 1,7 раза у детей в возрасте 1-6 лет ив 1,9, 1,9 и 1,7 раза у детей в возрасте 7-14 лет. Также отмечалось повышение их абсолютного содержания соответственно в 4, 15 и 4,3 раза у детей в возрасте 1-6 лет и в 4,2, 8 и 7,8 раза у детей в возрасте 7-14 лет (табл. 3). Период реконвалесценции. В фазу клинического выздоровления у пациентов в возрасте 1-6 лет и 7-14 лет относительное и абсолютное количество лимфоцитов, несущих CD95, нормализовалось (табл. 3). Относительное содержание CD95L+ лимфоцитов снижалось относительно такового в острый период, но все еще сохранялось выше нормы (в 1,5 раза у детей в возрасте 1-6 лет и 7-14 лет). При этом абсолютное количество CD95L+ клеток в период выздоровления не претерпевало значимых изменений по сравнению с предшествующим периодом исследования (табл. 3). Количество annexin V-положительных клеток также сохранялось повышенным по сравнению с нормой как в относительных (в 1,7 раза у детей в возрасте 1-6 лет и в 1,6 раза у детей в возрасте 7-14 лет), так и в абсолютных (в 4,9 раза у детей в возрасте 1-6 лет и в 8 раз у детей в возрасте 7-14 лет) значениях (табл. 3).
Содержание CD119- и СО120а-экспрессирующих лимфоцитов в периферической крови больных инфекционным мононуклеозом , вызванным вирусом Эшнтейна-Барр
У детей, в возрасте 1-6 лет, больных ВЭБ-мононуклеозом, в острый период заболевания в периферической крови отмечалось достоверное повышение (по сравнению с нормой) относительного содержания CD119+ лимфоцитов (в 3 раза), а у детей в возрасте 7-14 лет - относительного содержания CD119+ и CD120a+ лимфоцитов (в 3 и 1,8 раза соответственно) (табл. 6). Кроме того, отмечалось достоверное повышение абсолютного содержания CD119+, CD120a+ лимфоцитов соответственно в 3,7 и 2,8 раза у детей в возрасте 1-6 лет и в 7,5 и 2,2 раза у детей в возрасте 7-14 лет (табл. 6). Период реконвалесценции. В фазу клинического выздоровления у пациентов в возрасте 1-6 лет относительное количество CD119+ лимфоцитов незначительно снижалось по сравнению с острым периодом заболевания, но всё ещё оставалось выше контрольных значений (в 2,5 раза). Абсолютное содержание CD119+ лимфоцитов также снижалось (в 1,4 раза сравнительно с предыдущим этапом), но всё же не достигало контрольных значений (табл. 6). У детей школьного возраста в фазу реконвалесценции относительное количество CD119+ лимфоцитов тоже снижалось по сравнению с острым периодом в 1,4 раза, но, равно как и абсолютное их количество, было выше контрольных значений (табл. 6). Относительное и абсолютное содержание CD120a+ лимфоцитов у пациентов в возрасте 1-6 лет в фазу клинического выздоровления становилось выше (в 1,6 и 1,3 раза соответственно сравнительно с острым периодом заболевания). У детей школьного возраста оно не изменялось и оставалось выше контрольных значений (табл. 6). Острый период болезни. При определении относительного и абсолютного содержания CD119+ лимфоцитов у детей дошкольного возраста, страдающих ИМ другой этиологии, в фазу выраженных клинико-гематологических проявлений заболевания было установлено его достоверное повышение в 3 и 3,6 раза соответственно по сравнению с нормой. У детей 7-14 лет также отмечалось повышение относительного и абсолютного содержания С0119+-лимфоцитов в крови соответственно в 3 и 12,6 раза.
Относительное и абсолютное содержание CD120oc+ лимфоцитов у детей дошкольного возраста, страдающих ИМ другой этиологии, в острый период заболевания тоже претерпевало увеличение по сравнению с контрольными значениями в 2,3 и 3,8 раза соответственно. У детей школьного возраста относительное и абсолютное содержание CD120a+ лимфоцитов в крови повышалось в 1,8 и 3,7 раза (табл. 6). Период реконвалесиениии. В фазу клинического выздоровления относительное и абсолютное содержание CD119+ лимфоцитов у детей младшего и старшего возраста с ИМ другой этиологии сохранялось повышенным, несмотря на его снижение (в 1,2 и 1,3 раза у детей дошкольного возраста и в 1,3 и 1,4 раза у детей 7-14 лет) в сравнении с периодом манифестации болезни (табл. 3). Относительное и абсолютное содержание CD120a+ лимфоцитов у пациентов 1-14 лет в период реконвалесценции также оставалось выше, чем у здоровых детей. При этом у больных детей школьного возраста относительное количество CD120a+ клеток еще более увеличивалось (в 1,2 раза) по сравнению с острым периодом заболевания (табл. 6). Таким образом, у детей, страдающих ИМ, независимо от этиологии инфекции и возрастных особенностей организма в период разгара заболевания отмечается увеличение (по сравнению с нормой) относительного и абсолютного числа CD119+ и CD120a+ лимфоцитов в крови.
В период реконвалесценции количество CD119+ клеток несколько снижается, но как и число CD120a+ лимфоцитов, остается повышенным. Сравнительная статистическая оценка количественного соотношения CD-фракций лимфоцитов позволила выявить, что в острый период ИМ неВЭБ-этиологии относительное и абсолютное число CD120a+ лимфоцитов у детей в возрасте 1-6 лет и абсолютное количество CD119+ лимфоцитов у детей старшего возраста было выше, чем у пациентов, страдающих ИМ-ВЭБ (в 1,6, 1,3 и 1,7 раза соответственно). Кроме того, относительное количество СО120а-презентирующих лимфоцитов у детей старшего возраста в острый период ИМ-ВЭБ было выше (в 1,3 раза), чем у детей младшей возрастной группы, в то время как в фазу выздоровления у детей 7-14 лет с ИМ другой этиологии оно было существенно ниже (в 1,2 раза), чем у пациентов 1-6 лет. Острый период болезни. В острый период заболевания у детей 1-6 и 7-14 лет, больных ИМ, отмечалось достоверное повышение в 1,6 раза значений АЗКЦ по сравнению с показателями у здоровых детей (табл. 7). Период реконвалесценции. В фазу клинического выздоровления у детей, больных ИМ, дошкольного возраста отмечалось достоверное снижение активности АЗКЦ по сравнению с острым периодом болезни в 1,2 раза, но она все же не достигала показателя у здоровых детей (рі 0,05). У детей школьного возраста также отмечалось достоверное снижение величины АЗКЦ по сравнению с острым периодом заболевания в 1,6 раза, что приводило к ее нормализации (табл. 6).
