Введение к работе
Актуальность проблемы патогенеза и лечения поствоспалительных фиброзов обусловлена их широчайшей распространенностью, тяжелым прогредиентным течением, неэффективностью существующих средств терапии, высокой инвалидизацией и летальностью. Например, цирроз печени среди причин смертности от болезней органов пищеварения занимает первое место, ежегодно в мире от него умирает около 2 млн. человек (Кислый Н.Д., 2003); нефросклероз вызывает терминальные стадии ХПН и является одной из основных причин смертности (Земченков А.Ю. и др., 2004); атеросклероз, своеобразный хронический воспалительный процесс с фибросклеротическим компонентом, в XX веке принял характер эпидемии и остается ведущей причиной заболеваемости и смертности в большинстве развитых стран (Липовецкий Б.М., 2004); интраабдоминальное спайкообразование развивается у 90% пациентов после хирургических операций, является причиной примерно 1% обращений за хирургической помощью, отвечает за 20-40% случаев бесплодия, 40-80% тазовых болей (Вербицкий Д.А., 2004; Попов А.А. и др., 2005). Активный фиброгенез имеет место не только при самых разнообразных органосклерозах, таких как цирроз печени, нефро-, кардио-, пневмо-, ото-, атеросклероз, спаечные процессы, анкилозы, макулярная дегенерация, миелофиброз и т.д., не только при заживлениях ран или при больших и малых коллагенозах, но, фактически, при любых повреждениях ткани (T.A.Wynn, 2007). Однако, усиленная продукция компонентов соединительнотканного матрикса, вызванная альтерацией и воспалительной реакцией, как правило, сбалансирована его ускоренной деградацией и при формировании рубцовой ткани заканчивается ее эффективным ремоделированием с восстановлением структуры органа. Какие ключевые регуляторные механизмы детерминируют уровень фиброзного ответа и тем самым, исход воспаления, остается неясным.
По современным представлениям, ключевую роль в патогенезе поствоспалительного фиброза играют мононуклеарные фагоциты, способные выделять ТФР-b и другие факторы, стимулирующие пролиферативную, миграционную и коллагенсинтетическую функции фибробластов. С другой стороны, провоспалительная стимуляция макрофагов (Мф) вызывает интенсивную секрецию матриксных металлопротеиназ и лизосомальных гидролаз, которые с высокой скоростью расщепляют соединительнотканный матрикс, смещая равновесие от накопления к распаду соединительной ткани (Fallowfield J. et al., 2007). Вместе с тем, функциональная активность Мф на разных стадиях процесса изучена крайне слабо, а механизмы перехода от про- к антифиброзным функциям, и наоборот, не исследованы.
Мононуклеарные фагоциты костного мозга, крови, и периферических органов, объединенные в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ), связаны единством гистогенеза и общностью моноцитпоэтической и функциональной регуляции (Маянский Д.Н., 1991; Hume D., 2008). Взаимодействие центральных и периферических отделов СМФ может влиять на течение и исход поствоспалительного фиброгенеза. Однако, реакция СМФ как целого при общепатологических процессах и, в частности, при органосклерозах практически не исследована.
В последние годы сформировались представления о дискретных функциональных фенотипах мононуклеарных фагоцитов, таких как классически и альтернативно активированный Мф, M1-, M2- и M3-фенотипы. Сохраняются представления о примировании Мф, о макрофаге, находящемся в состоянии эндотоксиновой толерантности и др. Эти динамические функциональные состояния характеризуются различной способностью макрофагов отвечать на стимул и генерировать совершенно разные спектры медиаторов и цитокинов (Cavaillon J.M., 2006; Mosser D., 2008). Однако как меняются реактивные свойства мононуклеарных фагоцитов при развитии поствоспалительного фиброза и какова роль этих фенотипов в фиброгенезе – на момент исследования не было известно, практически не были изучены механизмы формирования/регуляции реактивности СМФ в фибропластическом процессе.
Одним из важнейших элементов системного ответа на воспалительный стимул является нарушение липопротеинового обмена и формирование гиперлипидемий. При этом самым существенным образом перестраивается липид-зависимый метаболизм клеток макрофагальной системы (Khovidhunkit W. et al., 2004). В недавних исследованиях выявлены молекулярные механизмы интеграции сигнальных путей регуляции липидного обмена и воспалительного ответа в макрофагах (Rigamonti E. et al., 2008). Показано участие окисленных производных холестерина и других агонистов ядерных гормональных рецепторов в контроле экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов. Имеются единичные работы о возможном участии в регуляции макрофагальных функций метаболитов мевалонатного метаболического пути (Mach F., 2004). Вместе с тем, исследования возможной связи липид-зависимой регуляции с формированием дискретных макрофагальных фенотипов и с регуляцией реактивности СМФ отсутствуют. Неизвестно, связаны ли активность ядерных рецепторов и мевалонатного пути с экспрессией и продукцией антивоспалительных и фиброгенных цитокинов, меняется ли концентрация нейтральных липидов, холестерина (ХС), его окисленных производных и других агонистов ядерных рецепторов и регуляторов активности мевалонатного пути в очагах воспаления и фиброгенеза. Не изучена роль этих сигнальных и метаболических путей в макрофагах при хронических воспалительных фибропролиферативных процессах в условиях in vivo.
Цель исследования: Изучить функциональную активность и реактивные свойства макрофагальной системы при развитии хронического поствоспалительного фиброзного процесса, исследовать ключевые механизмы их регуляции и роль в формировании фиброза.
Задачи исследования:
1. В модели гранулематозного воспаления у мышей разных линий выявить основные различия в реакции макрофагов на фиброгенный (SiO2) и нефиброгенный (зимозан) стимул, и оценить взаимоотношения миелопоэтического, инфильтративно-гранулематозного и фиброгенного ответов у животных, оппозитных по эффективности регуляции 3-гидрокси-3-метил-глютарил-СоА редуктазы, ключевого фермента мевалонатного метаболического пути.
2. Изучить функциональное состояние и реактивные свойства макрофагов печеночной и внепеченочных локализаций в динамике экспериментального CCl4-гепатофиброза и выявить системные механизмы регуляции реактивности СМФ в этом процессе. Оценить возможную роль хронической системной эндотоксинемии в развитии гиперхолестеринемии и формировании реактивных свойств СМФ, характерных для гепатофиброза.
3. Провести сравнительное изучение функционального состояния и реактивных свойств макрофагальной системы у больных с острыми и затяжными вирусными гепатитами (вирусные гепатиты А и В) при стимуляции СМФ бактериальным липополисахаридом (ЛПС) и оценить гепатопротективный эффект данной стимуляции.
4. Оценить влияние гиперхолестеринемии (ХС диета) на функциональную активность и реактивные свойства макрофагальной системы (по уровням цитокинового, гранулемогенного, и миелопоэтического ответов) в условиях ее стимуляции бактериальным ЛПС или зимозаном
5. Исследовать возможную роль гиперлипидемий, характерных для системного воспалительного ответа, и липопротеинов крови (ЛП) разных классов в связывании бактериальных ЛПС и образовании ЛПС-ЛП комплексов, оценить роль этих комплексов в выведении ЛП низкой плотности (ЛПНП) из кровотока, захвате и аккумуляции ЛПНП в макрофагах, обратном транспорте холестерина, в накоплении ЛПНП в артериальной стенке и в формировании атеросклеротических поражений.
6. Оценить возможную зависимость между содержанием в атеросклеротических бляшках артериальных сосудов человека ХС, его эфиров и окисленных производных и выраженностью в бляшках фибросклеротических изменений
7. Изучить влияние гиперхолестеринемии (ХС диета) на содержание триглицеридов, холестерина, его эфиров и окисленных производных в ткани печени в моделях хронического макрофаг-зависимого диффузного (CCl4-интоксикация) и гранулематозного (зимозан) воспаления, и оценить возможную зависимость между содержанием в воспалительно измененной ткани холестерина и его окисленных производных, экспрессией в макрофагах печени трансформирующего фактора роста бета (ТФР-b) и уровнем фиброгенного ответа.
8. Оценить возможную роль мевалонатного метаболического пути в детерминации уровней провоспалительного и фиброзного ответов путем ингибирования или отмены эффектов ингибирования этого пути: а) в моделях гранулематозного (зимозан-индуцированного) и диффузного (CCl4-индуцированного) гепатита, б) в моделях нефросклероза (индуцированного рабдомиолизом или унилатеральной обструкцией мочеточника), в) в модели зимозан-индуцированного асептического перитонита.
9. Оценить возможную роль активности мевалонатного метаболического пути и ядерных гормональных рецепторов LXR, FXR, RXR в воспалительно-индуцированной экспрессии и продукции про- и антивоспалительных фиброгенных цитокинов в культуре перитонеальных макрофагов
10. Оценить возможную роль мевалонатного метаболического пути и ТФР-b в формировании макрофагальной эндотоксиновой толерантности.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование функциональной активности и реактивных свойств СМФ в различных экспериментальных моделях поствоспалительного фиброза, и выявлены характерные для фибропролиферативных процессов ранее неизвестные общие закономерности перестройки функций и реактивности мононуклеарных фагоцитов.
Впервые обнаружено, что фиброгенный агент (SiO2) вызывает провоспалительный ответ мононуклеарных фагоцитов, существенно более низкий, чем нефиброгенный агент (зимозан). При этом, как показано на инбредных мышах С57Bl/6, C57BR, CBA/Lac, Balb/с, C3H/F уровень гранулематозного ответа и выраженность фиброза, вызванного фиброгенным агентом, зависят от продукции ГМ-КСФ и характера миелопоэтического ответа. Показано, что межлинейные различия гранулемогенеза, будучи обусловлены различиями миелопоэтического ответа, имеют универсальный характер: не зависят от природы агента, его дозы и локализации процесса. Впервые продемонстрировано, что мыши с оппозитной чувствительностью ГМГР/мевалонатного биохимического пути к регуляторным воздействиям (С57Bl/6 и Balb/с) оппозитны по уровню фиброгенного ответа, миелопоэтической и гранулемогенной реакции.
Впервые проведено сочетанное исследование печеночного и внепеченочных отделов макрофагальной системы в динамике развития гепатофиброза и обнаружено, что СМФ ведет себя как единое целое - все отделы макрофагальной системы – центральный (Мф и их прекурсоры в костном мозге), транспортный (моноциты крови), Мф органа поражения (клетки Купфера), внепеченочные (перитонеальные, легочные, селезеночные) претерпевают координированную перестройку: происходит снижение функциональной активности Мф печени с компенсаторной гиперплазией и повышением функциональной активности Мф внепеченочных локализаций. Впервые при развитии гепатофиброза изучена способность Мф различных отделов СМФ реагировать на стимуляцию и установлена зависимость реактивности Мф от стадии процесса. Показано, что одним из важнейших механизмов гипореактивности СМФ при развитии гепатофиброза является хроническая системная эндотоксинемия, индуцирующая гиперхолестеринемию, накопление в Мф липидов и оксистеролов. У больных затяжными вирусными гепатитами продемонстрировано снижение реактивности СМФ, отменяемое введением ЛПС, что сочетается с улучшением функций печени.
Обоснована гипотеза об атерогенной роли комплексов бактериальных ЛПС с липопротеинами (ЛП). Обнаружено, что гиперхолестеринемия, формирующаяся при эндотоксинемии и воспалительном ответе, способствует образованию избыточного количества комплексов ЛПС-ЛП низкой плотности (ЛПНП). Показано, что ЛПС в сыворотке крови оказывает ингибирующее действие на лецитин-холестерин-ацилтрансферазу (ЛХАТ), один из ключевых ферментов обратного транспорта ХС. Впервые исследована судьба частиц ЛПНП в составе ЛПС-ЛПНП комплексов и показано, что образование комплексов модифицирует свойства ЛПНП, уменьшает время их полужизни в кровообращении и резко усиливает их связывание и захват в макрофагах и в артериальной стенке.
Показано универсальное значение гиперхолестеринемии в фиброгенезе: в разных вариантах воспаления (диффузное и гранулематозное) в паренхиматозных (печень, почки) и непаренхиматозных (артерии, брюшная полость) органах в разных моделях гепатофиброза, нефросклероза, при атерогенезе и при интраабдоминальном спайкообразовании, а также в моделях in vitro продемонстрировано ХС-индуцированное усиление фиброзного ответа и повышение продукции ТФР-b в Мф. Кроме ХС показано фиброгенное действие других ингибиторов мевалонатного метаболического пути (аторвастатин, кальцитриол). Продемонстрирована отмена фиброгенных эффектов ХС и других ингибиторов этого пути под действием мевалоната.
Впервые с использованием культуральных моделей исследованы взаимоотношения между реактивностью Мф, мевалонатным метаболическим путем и фиброгенезом. При анализе продукции провоспалительных цитокинов и оксида азота установлено, что ХС и его окисленные производные индуцируют гипореактивность мононуклеарных фагоцитов, и эта гипореактивность зависит от снижения активности мевалонатного метаболического пути. Аналогично, в воспалительно рекрутированных Мф обнаружено, что ХС стимулирует продукцию ТФР-b1, и эта продукция связана с пониженной активностью мевалонатного пути. Показано, что макрофагальная гипореактивность, вызванная повторными введениями мышам эндотоксина, приводит к накоплению в Мф оксистеролов и, одновременно, стимулирует продукцию ТФР-b1. Таким образом, впервые показано, что ингибирование активности мевалонатного пути может быть системным фактором снижения реаактивности мононуклеарных фагоцитов и, одновременно, фактором усиления поствоспалительного фиброгенеза. В свою очередь, макрофагальная гипореактивность, индуцированная повторным/хроническим поступлением в кровоток эндотоксина, вызывает одновременно накопление в Мф ингибиторов мевалонатного пути (оксистеролов) и значительное усиление продукции ТФР-b1. Впервые исследовано действие агонистов ядерных гормональных рецепторов на продукцию антивоспалительных профиброзных цитокинов (ТФР-b1). Показано, что в Мф, рекрутированных в очаг воспаления, 25-гидрокси-ХС, фарнезол, и 9-цис-ретиноевая кислота снижают секрецию ТФР-b1, исходно повышенную под действием воспалительного стимула. Иными словами, впервые продемонстрировано, что ХС-индуцированная активация фиброгенеза, опосредованная ТФР-b, непосредственно не связана с активностью ядерных рецепторов. Таким образом установлено, что гипореактивность Мф, зависимая от ядерных рецепторов, и ТФР-b-индуцированный фиброгенез находятся под разным регуляторным контролем.
Научно-практическая значимость. Полученные данные дают основание связывать прогрессирование фиброзного процесса и его слабую обратимость с функциональной депрессией органотипических Мф и низкой способностью макрофагальной системы отвечать на провоспалительную стимуляцию. Это позволяет искать новые пути предупреждения и лечения патологических фибропролиферативных процессов на основе своевременной модуляции функций органотипических Мф и СМФ в целом.
Данные о сопряженных функциональных перестройках разных популяций макрофагальной системы в динамике гепатофиброза дают основание рассматривать мононуклеарные фагоциты как реальный инструмент межорганных взаимосвязей, позволяют предполагать наличие Мф-зависимых экстрагепатических осложнений и искать новые пути их терапии. Соответствие изменений СМФ фазам развития гепатофиброза позволяет по функциям и реактивности мононуклеарных фагоцитов оценивать характер течения процесса, его динамику и прогноз, контролировать эффективность лечения. Связанность функциональных перестроек печеночного и внепеченочных популяций СМФ дает основание судить о патологическом процессе в печени по Мф внепеченочных локализаций. В клинике на основе анализа функционального состояния и реактивности внепеченочных моноцитов-макрофагов возможна разработка обоснованных рекомендаций по применению стимуляторов СМФ в лечении гепатитов и циррозов. В соответствии с нашими данными о роли хронической эндотоксинемии в формировании гипореактивных свойств Мф при развитии гепатофиброза одними из маркеров и мишеней для модуляции функционального состояния и реактивности СМФ могут стать находящиеся в циркуляции бактериальные ЛПС.
Данные о том, что хроническая системная эндотоксинемия является одним из важнейших патогенетических механизмов атерогенеза потенциально позволяют рассматривать хроническую Грам-отрицательную инфекцию и находящиеся в кровообращении бактериальные ЛПС как прогностические маркеры и новые мишени для профилактического и терапевтического вмешательства при развитии атеросклероза.
Согласно данным о профиброзной роли высоких уровней ХС при хроническом воспалении в паренхиматозных и непаренхиматозных органах гиперхолестеринемия может явиться в будущем одним из критериев прогноза выраженности поствоспалительных фибропролиферативных преобразований.
Установленная зависимость между ингибированием мевалонатного метаболического пути и поствоспалительным фиброгенезом позволяет искать среди промежуточных продуктов этого пути конкретные молекулярные мишени для управления фибропластическим процессом. Точно также, выявленная зависимость между ингибированием активности мевалонатного пути и снижением реактивности Мф обеспечивает возможность поиска новых модуляторов макрофагальной реактивности среди соединений, влияющих на активность этого пути. Это, в свою очередь, позволяет искать новые пути управления течением и исходом воспалительных реакций.
Положения, выносимые на защиту. 1. В процессе развития индуцированного воспалением фиброзного ответа происходит закономерная перестройка системы мононуклеарных фагоцитов с формированием функциональной депрессии органотипических Мф и приобретением низкой способности макрофагальной системы отвечать на провоспалительную стимуляцию. В свою очередь, функциональное состояние СМФ в значительной мере определяет течение воспалительного процесса и уровень поствоспалительного фиброгенного ответа. В условиях сниженной реактивности СМФ воспалительный ответ принимает затяжное течение, ассоциированное с фиброгенезом, а стимуляция СМФ, позволяет корригировать нарушенные в ходе воспалительного процесса функции мононуклеарных фагоцитов, что сопровождается нормализацией функций печени.
2. Одним из важнейших механизмов гипореактивности СМФ при развитии гепатофиброза и атеросклероза является хроническая системная эндотоксинемия – неотъемлемый фактор атерогенеза и вторичного поражения печени. Наряду с другими ЛПС-зависимыми механизмами, существенный вклад эндотоксинемии в супрессию реактивности Мф вносит ЛПС-индуцированная гиперлипидемия, которая способствует формированию ЛПС-липопротеиновых комплексов и нейтрализации биологической активности ЛПС и, одновременно, приводит к модификации липопротеинов, нарушению обратного транспорта холестерина, тем самым резко усиливая аккумуляцию триглицеридов, холестерина, его эфиров и окисленных производных в Мф/очагах воспаления. Холестерин и оксистеролы изменяют функциональный фенотип Мф, индуцируя гипореактивность этих клеток.
3. Усиление гиперхолестеринемии и аккумуляции холестерина в мононуклеарных фагоцитах при хроническом воспалительном ответе значительно повышает экспрессию и продукцию ТФР-1 в Мф и увеличивает выраженность фиброза в паренхиматозных и в полых органах и в артериальных сосудах. Холестерин увеличивает продукцию ТФР-1 в воспалительных Мф, тогда как агонисты ядерных гормональных рецепторов LXR, RXR и FXR ингибируют продукцию и провоспалительных цитокинов, и ТФР-1.
4. Холестерин-зависимая индукция гипореактивности СМФ и усиление фиброгенеза/продукции ТФР-1 связаны с ингибированием 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А редуктазы, ключевого фермента мевалонатного биохимического пути, и с уменьшением пула нестерольных изопреноидов, образующихся за счет активности этого пути. Мевалоновая кислота, повышая внутриклеточный пул нестероидных изопреноидов, отменяет эндотоксиновую толерантность макрофагов, блокирует продукцию ТФР-1 и переключает функциональный фенотип мононуклеарных фагоцитов на гиперреактивный, высокоотвечающий на воспалительную стимуляцию продукцией провоспалительных цитокинов и оксида азота.
Апробация материалов диссертации. Основные положения работы были представлены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме с международным участием «Система мононуклеарных фагоцитов в норме и патологии» (г. Новосибирск, 1990); Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (г. Москва, 1991); Симпозиуме Международной ассоциации по биологической стандартизации (г. Аннеси, 1991); Междунаpодном симпозиуме по аллеpгологии и клинической иммунологии (г. Алма-Ата, 1992); I съезде иммунологов России (г. Новосибирск, 1992); IV, V и VI международных симпозиумах по клеткам печеночного синусоида (г. Титизее, 1988, г. Туксон, 1990, и г. Антверпен, 1992); III и VI конференциях международного эндотоксинового общества (г. Хельсинки, 1994, и г. Париж, 2000); IV, V и XIII ежегодных международных конференциях Скандинавского общества по атеросклерозу (г. Хумлебек, 1997, 1998, 2006); XI международном симпозиуме по атеросклерозу (г. Париж, 1997); 70-м конгрессе Европейского общества по атеросклерозу (г. Женева, 1998); III международном конгрессе по патофизиологии (г. Лахти, 1998); I Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию А.Л.Мясникова (г. Москва, 1999); V и VI отчетной сессии НИИКИ СО РАМН (г. Новосибирск, 1999 и 2003); II Всероссийском симпозиуме "Хроническое Воспаление" (г. Новосибирск, 2000); Всероссийских конференциях «Фундаментальные и клинические аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (г. Новосибирск, 2002, 2007, 2009); II международном симпозиуме по уязвимой атеросклеротической бляшке (г. Таормина, 2004); Спетсевской летней школе по ядерным гормональным рецепторам «От молекулярных механизмов к интегративной физиологии» (о. Спетсес, 2007); VII конференции иммунологов Урала (г. Архангельск, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 научных работ, в том числе одна коллективная монография, 25 статей в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени доктора наук, 1 методические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 389 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 92 отечественных и 1444 зарубежных источника, иллюстрирована 42 таблицами и 64 рисунками.
