Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Применение гиперосмотических растворов для лечения хронических воспалительных заболеваний кожи 11
1.2. Клеточные модели и модели живого эквивалента кожи для изучения кератиноцитов in vitro 13
1.3. Клеточный цикл 17
1.3.1. Сигналинг клеточного цикла 17
1.3.2. Влияние гиперосмотического воздействия на клеточный цикл 19
1.4. Апоптотическая гибель клеток при гиперосмотическом воздействии 20
1.5. Процесс дифференцирования кератиноцитов 23
1.5.1. Маркеры дифференцирования кератиноцитов 25
1.5.2. Процесс аутофагии в кератиноцитах 27
1.6. Цитоскелет клетки и его роль в реализации ответа на гиперосмотическое воздействие 30
1.7. Адаптация клеток к гиперосмотическому воздействию 33
1.8. Активные формы кислорода в клетке в физиологическом состоянии и при стрессе 36
1.9. Внутриклеточная сигнальная система Nrf2/Keap1/ARE. Участие в стресс-опосредованном ответе и дифференцировании клеток 39
1.10. Роль транскрипционного фактора NF-B в клетке 44
1.11. Роль цитокинов в формировании эпидермиса 48
Глава 2. Материал и методы 50
Глава 3. Собственные результаты и их обсуждение 58
3.1. Исследование жизнеспособности клеток 58
3.2. Исследование апоптотической и некротической гибели клеток после гиперосмотического воздействия 59
3.3. Исследование пролиферативной активности и клеточного цикла кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие 62
3.4. Исследование процессов дифференцирования кератиноцитов 68
3.5. Исследование особенностей продукции активных форм кислорода кератиноцитами при гиперосмотическом воздействии 75
3.6. Исследование активации сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии 81
3.7. Характеристика актинового и тубулинового цитоскелета кератиноцитов при гиперосмотическом воздействии 88
3.8. Исследование продукции цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-, ИЛ-10 и активности транскрипционного фактора NF-B в ответ
на гиперосмотическое воздействие 91
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы
- Клеточные модели и модели живого эквивалента кожи для изучения кератиноцитов in vitro
- Апоптотическая гибель клеток при гиперосмотическом воздействии
- Исследование апоптотической и некротической гибели клеток после гиперосмотического воздействия
- Исследование активации сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии
Введение к работе
Актуальность темы
Кожа образует внешний покров организма, обеспечивая защиту от негатив-ного влияния окружающей среды - дегидратации, механического повреждения, попадания инфекционных агентов, т.е. является одним из важнейших факторов поддержания гомеостаза. Кожа состоит из эпидермиса, дермы и гиподермы, образующих единую морфофункциональную систему. Фибробласты дермы и антигенпрезентирующие клетки эпидермиса – клетки Лангерганса участвуют в процессе пролиферации и дифференцирования кератиноцитов, посредством цитокинов, в первую очередь - факторов роста, а кератиноциты, в свою очередь, способны изменять пролиферативную активность клеток соединительной ткани дермы [Maas-Szabowski N. et al., 1999; Lim C.P. et al., 2009]. В результате обеспечивается сбалансированность структуры и функций эпидермиса и дермы при физиологической и репаративной регенерации. В норме, сбалансированные процессы пролиферации и последующего дифференцирования кератиноцитов, направленны от базального к роговому слою, что обеспечивает формирование эпидермального барьера, главная функция которого состоит в защите внутренней среды организма от нежелательных влияний факторов внешней среды.
Ряд распространенных хронических заболеваний кожи, таких как псориаз, атопический дерматит, проявляется формированием стойких очагов патологических высыпаний (локальных воспалительных проявлений) и приводит к нарушению эпидермального барьера, что связано с чрезмерной активацией пролиферации кератиноцитов, наряду с угнетением их дифференцирования в результате хронического воспаления в дерме [Tschachler E., 2007; Bieber T., Novak N., 2009].
Лечение хронических заболеваний кожи высокоминерализованными при-родными водами (бальнеотерапия) приводит к уменьшению проявление воспале-ния, улучшению гидратации рогового слоя и снижению шероховатости эпидермиса [Harari M. et al., 2000; Proksch E. et al., 2005].
В клинике ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН показана высокая эффективность высокоминерализованных растворов, применяемых при лечении больных атопическим дерматитом. Применение препарата «Рапан», полученного из рапы озера Малое Островное Краснозерского района, Новосибирской области, приводит к снижению интенсивности острых проявлений заболевания и его пролиферативной фазы - акантозов, наряду, с активацией дифференцировочных процессов, что приводит к нормализации барьерной функции эпидермиса [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И. и др., 2006]. Однако эти исследования носят описательный характер и не затрагивают механизмов, детерминирующих получаемые эффекты.
Есть основания полагать, что терапевтические эффекты высокоминерализо-ванных растворов реализуются в результате развития гиперосмотического стресса кератиноцитов. Однако этому явлению посвящены лишь отдельные исследования. Известно, что гиперосмотическое воздействие вызывает резкое повышение концентрации внутриклеточных ионов Ca2+, что сопряжено с торможением пролиферации кератиноцитов [Dascalu A. et al., 2000]. Кроме того, гиперосмотическое воздействие может вызывать дегидратацию клетки, что моделирует процесс обезвоживания эпидермиса на воздухе, и может являться одним из механизмов, запускающих процессы дифференцирования кератиноцитов. В работах in vitro показано, что при обезвоживании клеток под воздействием сорбитола, усиливается экспрессия ряда кератинов (К1, К10), и других маркеров дифференцирования кератиноцитов, таких как трансглутаминаза-1, инволюкрин и филаггрин [Mammone T. et al., 2007], что свидетельствует о стимулирующем влиянии гиперосмотического воздействия на процессы дифференцирования кератиноцитов. Кроме того, показано, что дифференцирование кератиноцитов может быть связано с активацией процессов генерации активных форм кислорода (АФК) [Chamulitrat W. et al., 2004]. Экзогенное воздействие стрессора может нарушать физиологический окислительно-восстановительный баланс клеток, и запускать активацию редокс-чувствительных сигнальных систем, в частности, фактора транскрипции Nrf2, обладающего не только гомеостатической, но и дифференцировочной функцией. Так, установлено, что Nrf2, действуя в синергизме с фактором Notch1 [Wakabayashi N. et al., 2010а; Wakabayashi N.et al., 2010b], индуцирует дифференцирование в клетках [Lin H.Y. et al., 2011]. Однако прямая связь редокс-чувствительных сигнальных систем в инициации и реализации гиперосмотического стресса не описана в литературе. Другой потенциальной мишенью гиперосмолярных воздействий на клетку являются белки цитоскелета, которые должны подвергаться структурной реорганизации во время гипертонического «сжатия», и приводить к изменению клеточного сигналинга с активацией адаптивного ответа клетки.
Таким образом, реализация позитивных эффектов гиперосмотических растворов может осуществляться различными механизмами, обеспечивающими адаптацию клетки к обезвоживанию и гиперосмотическому стрессированию. Поскольку в естественных условиях утрата воды клетками может колебаться в различных пределах, представляет интерес выяснение механизмов клеточного ответа как в процессах гомеостазирования в норме, так и при патологических состояниях. Понимание этих механизмов, наряду с получением новых фундаментальных данных, в дальнейшем позволит разрабатывать методы направленной модуляции структурно-функционального состояния эпидермального барьера человека.
Цель и задачи исследования
Целью работы было исследование механизмов гиперосмотического воздей-ствия препарата «Рапан» на кератиноциты и их роль в модуляции процессов про-лиферации и дифференцирования в условиях in vitro.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние гиперосмотического воздействия растворов препарата «Рапан» различных концентраций на жизнеспособность кератиноцитов линии HaCaT и их пролиферативную активность.
2. Исследовать индукцию дифференцирования кератиноцитов, различных вариантов клеточной гибели и процессов аутофагии в ответ на гиперосмотическое воздействие.
3. Исследовать продукцию активных форм кислорода и изменение транс-мембранного митохондриального потенциала в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии.
4. Исследовать активацию редокс-чувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии.
5. Исследовать влияние гиперосмотического воздействия на реорганизацию цитоскелета кератиноцитов.
6 Исследовать in vitro продукцию цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-, ИЛ-10 и активность транскрипционного фактора NF-B в кератиноцитах в ответ на гиперосмотическое воздействие.
Научная новизна работы
Впервые установлено, что элиминация кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» осуществляется процессом аутофагии, но не апоптозом.
Получены данные о торможении клеточного цикла кератиноцитов в стадии G1/G0 после гиперосмотического воздействия растворами препарата «Рапан», в отличие от классического торможения клеточного цикла в стадиях G2/M в условиях гиперосмотического воздействия.
Установлено, что воздействие гиперосмотических растворов препарата «Рапан» на кератиноциты приводит к быстрому усилению продукции АФК и падению трансмембранного митохондриального потенциала, что впервые указывает на прямую связь гиперосмотического и окислительного стресса в кератиноцитах и приводит к активации редокс-чувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE в ответ на гиперосмотическое воздействие.
Впервые показано, что гиперосмотическое воздействие сопряжено с ингибированием транскрипционного фактора NF-B. Кроме того, воздействие гиперосмотическими растворами влияет на продукцию ИЛ-6 в кератиноцитах, в зависимости от сроков воздействия на клетки, не оказывая при этом влияния на продукцию ИЛ-1, ФНО-, ИЛ-10.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты могут быть полезны в практике научных исследова-ний, касающихся понимания механизмов влияния гиперосмотических растворов на основные функции жизненного цикла клеток, в частности кератиноцитов: пролиферации (регенерации), дифференцирования и видов клеточной гибели некрозом, апоптозом и возможно, через механизмы аутофагии.
Данные, полученные в проведенных экспериментах могут быть полезны при преподавании патологической физиологии, по разделам физиология кожи, процессы пролиферации и воспаления, патофизиологии стресса (окислительный стресс, как составляющий элемент ответной реакции организма на стрессирующее воздействие), а также для преподавания в области клеточной биологии в разделе: влияние осмотических воздействий на процессы пролиферации и дифференцирования.
Результаты, полученные в диссертационном исследовании уточняют меха-низмы позитивных эффектов гиперосмотических растворов, в частности препарата «Рапан» на процессы воспаления в коже, что в значительной степени позволяет отойти от эмпирических подходов в лечении целого ряда заболеваний кожи, характеризующих хроническое воспаление с выраженным отечным и гиперрегенераторными компонентами в период их обострений.
Положения, выносимые на защиту
1. Гиперосмотические растворы, в зависимости от их концентраций, продолжительности воздействия, а также физиологического состояния кератино-цитов на момент воздействия (стадия клеточного цикла), способны модулировать основные биологические процессы: пролиферацию, дифференцирование и клеточную гибель, через механизмы гомеостазирования, включающие процессы окислительного стресса и сигнальные функции АФК, а также активацию редокс-чувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE.
2. Гиперосмотические растворы способны модулировать состояние цитоскелета кератиноцитов (актина и тубулина) через активацию малой ГТФазы Rac1,что сопряжено с изменением активности транскрипционного фактора NF-B, не изменяя продукции цитокинов ИЛ-1 и ФНО-, ИЛ-10, однако, индуцируя изменение продукции ИЛ-6, в зависимости от времени экспозиции гиперосмотического воздействия.
Апробация работы
Результаты работы представлены и обсуждены на Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно – приспособительных процессов» 12-14 апреля 2011г. Новосибирск; на Шестой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» 16-17 апреля 2013г. Новосибирск
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения; выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 272 источника (15 отечественный и 257 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и иллюстрированы 28 рисунками.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Рос-сийской Федерации (Соглашение № 8788), с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы»
Клеточные модели и модели живого эквивалента кожи для изучения кератиноцитов in vitro
После курса лечения препаратом «Рапан» в течение 6 недель у больных ато-пическим дерматитом наблюдали полный или значительный регресс кожных высыпаний. При гистологическом исследовании биоптатов, взятых у больных после лечения, морфологическая картина соответствовала стадии затухающего обострения или ремиссии. Участки спонгиоза были единичными или вовсе отсутствовали, явлений отека почти не наблюдали. Количество инфильтратов значительно снижалось, они присутствовали преимущественно в сосочковом слое дермы. Состав инфильтратов соответствовал продуктивной стадии воспаления. Наблюдали снижение количества лимфоцитов и увеличение количества фибробластов. Тучные клетки были единичными и без признаков дегрануляции. Очаги фиброза присутствовали чаще в сосочковом слое, ближе к базальной пластинке эпидермиса. Акантоз соответствовал слабой степени выраженности с единичными митозами в базальном слое [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И. и др., 2006]
Обсуждая позитивные эффекты природных вод на организм человека, выделяют общие и местные реакции, развивающиеся в коже. Полагают, что воздействие гиперосмотических растворов оказывает влияние на экстерорецепторы кожи, что влечет за собой активацию каскада нейрорефлекторных, эндокринных, иммунных реакций, которые и формируют, в конечном счете, противовоспалительные мест ные и системные эффекты бальнеопроцедур [Зеленецкая В.С., Андреев С.В., 1992; Давыдова О.Б. и др., 2002; Matz H. et al., 2003].
Выделяют два основных фактора модуляции функционального статуса клеток кожи, определяющих позитивные эффекты применения высокоминерализованных растворов: фактор осмолярности и фактор качественного минерального состава воды. Так, положительные эффекты воды Мертвого моря связывают с высокой осмолярностью и повышенным содержанием солей магния [Greiner J., Diezel W., 1990; Levi-Schaffer F. et al., 1996], а позитивные эффекты йодобромных вод – с высоким содержанием ионов йода и брома, способных проникать в организм человека и оказывать гуморальные эффекты [Дацковский Я. С., 2002].
Вместе с тем, сопоставимые клинические эффекты (в виде преимущественного влияния на продуктивную фазу воспалительного процесса в коже) различных по минеральному составу высококонцентрированных природных вод предполагают и единые (сопоставимые, вероятно, неспецифические) механизмы их формирования. Единственным параметром, объединяющим высокоминерализованные воды различных природных источников по достигаемым результатам лечения, является высокая осмолярность растворов, по-видимому, играющая ключевую роль в формировании позитивных эффектов у больных с хроническими заболеваниями кожи и, в частности, больных атопическим дерматитом. Однако патогенетические механизмы развития этих эффектов требуют дальнейшего изучения. Для исследования различных клеточных процессов и механизмов их реализации удобным является использование клеточных моделей in vitro, поскольку in vivo исследования такого рода позволяют судить о них только опосредованно, что не дает корректных выводов с учетом центральных системных механизмов регуляции ответной реакции (воспаления) на нетравматическое повреждение кожи и её клеток при ряде заболеваний.
1.2 Клеточные модели и модели живого эквивалента кожи для изучения кератиноцитов in vitro
Эпидермис – самый верхний, наружный слой кожи представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из кератиноцитов. Кератино-циты плотно связаны между собой десмосомами и содержат кератиновые фила-менты. В эпидермисе в более глубоком слое находятся немногочисленные мелано циты, внутриэпидермальные макрофаги – клетки Лангерганса, а также нейроэн-докринные клетки кожи – Клетки Меркеля [Быков В.Л., 1999; Кузнецов С.Л. и др., 2012].
Дерма – средний, соединительнотканный слой, лежащий под эпидермисом, отграничен от него базальной мембраной. Дерма представлена двумя слоями – со-сочковым и сетчатым. Сосочковый слой содержит коллагеновые и эластические волокна, между которыми расположены кровеносные сосуды, нервные окончания и клеточные элементы: фибробласты, гистиоциты, тканевые базофилы (в основном вокруг капилляров). Сетчатый слой представлен грубыми коллагеновыми волокнами, фиброцитами, а также клеточными элементами сосочкового слоя, но в меньшем количестве. Нижний слой – гиподерма, или подкожная жировая клетчатка, содержит кровеносные сосуды, нервные окончания, потовые железы и волосяные фолликулы. Она образована соединительнотканными рыхлыми волокнами, между которыми залегают дольки жировой ткани, образованной крупными адипоцитами [Быков В.Л., 1999].
Первые сообщения о культивировании клеток кожи появились еще в 40-х годах. Однако до середины 70-х годов фибробласты соединительной ткани были единственными диплоидными клетками человека, культивируемыми на протяжении многих пассажей. Возможность культивирования эпителиальных клеток, в частности кератиноцитов, появилась в 1975 году, благодаря методике Рейнвальда и Грина [Rheinwald J.G., Green H., 1975a; Rheinwald J.G., Green H., 1975b]. В дальнейшем данная методика заложила основы практического использования клеток кожи в медицинских исследованиях, в частности для моделирования отдельных слоев кожи и для создания цельных живых ее эквивалентов, что нашло применение в трансплантологии [Kirsner R.S., 1998].
Современные «живые эквиваленты кожи» представляют собой тканеинже-нерные конструкции на основе кератиноцитов, фибробластов и коллагеновой матрицы [Ehrlich H.P., 2004]. Такие модели используют как для изучения морфологических процессов в коже, так и для исследования патологических состояний, например при вирусном инфицировании [Andrei G. et al., 2010].
Одна из первых таких конструкций была предложена в 1983 году: кератино-циты выращивали на поверхности гелеобразного «дермального эквивалента», со стоявшего из смеси коллагена, плазмы, ростовой среды и фибробластов кожи [Bell E. et al., 1983]. Преимуществом дермального эквивалента является то, что клетки в нем находятся в активном функциональном состоянии, близком к таковому в коже [Bernerd F., 2005].
В США был лицензирован и разрешен к применению в клинической практике первый коммерческий тканевой продукт, состоящий из коллагеновой матрицы и донорских аллогенных фибробластов и кератиноцитов, – Apligraf [Kirsner R.S., 1998; Trent J.F., Kirsner R.S., 1998].
Апоптотическая гибель клеток при гиперосмотическом воздействии
В целом, взаимодействие Nrf2 и Keap1, а также других белков, участвующих в активации и инактивации Nrf2, представляет собой динамический процесс, в котором развитие окислительного стресса приводит к быстрой активации Nrf2 и открытию последовательности ARE в генах-мишенях. Устранение окислительного стресса приводит к снижению транскрипционной активности Nrf2 и удалению его из ядра [Jain A.K. et al., 2005].
Кроме индукции генов антиоксидантной защиты транскрипционный фактор Nrf2 активирует транскрипцию генов множества различных по функции белков, включая белки, регулирующие апоптоз, клеточный цикл и дифференцирование [Morito N. et al., 2003; Shelton P., Jaiswal A., 2013], а также ингибирует транскрипцию генов, например подавляя активацию других факторов транскрипции [Jeong W.S. et al., 2004].
Транскрипционный фактор Nrf2, по-видимому, поддерживает баланс между проапоптотическими и антиапоптотическими факторами так, что активация апоп-тоза замедляется. Так, показано, что Nrf2 изменяет чувствительность клеток к апоптоз-индуцирующим факторам, связанным с окислительным стрессом. Нокаут Nrf2 в Т-лимфоцитах приводит к повышенной чувствительности клеток к Fas-индуцированному апоптозу [Morito N. et al., 2003]. Механизм индукции апоптоза включает активацию перекисью водорода каспазы-8, а также повреждение мито-хондриальной мембраны, сопровождающееся коллапсом митохондриального потенциала и высвобождением в цитозоль цитохрома C и проапоптотических факторов [Chandra J. et al., 2000].
Защитная роль Nrf2 в случае индукции апоптоза, вероятно, связана с увеличением количества восстановленного глутатиона в клетке в ответ на повышение продукции кислородных радикалов, происходящее в процессе индукции апоптоза через Fas-рецепторы. Повышение количества восстановленного глутатиона в клетке также является механизмом поддержания пролиферации клеток при активации Nrf2. Этот механизм имеет значение для многих типов клеток, в том числе и для опухолевых, в которых аберрантная экспрессия Nrf2 является одним из факторов, обеспечивающих повышение темпов пролиферации [Ohta T. et al., 2008].
Баланс между выживанием клетки и индукцией апоптоза определяется концентрацией АФК в клетке и степенью выраженности окислительного стресса. Так, возможно, белок Keap1 служит не только репрессором транскрипционного фактора Nrf2, но и цитозольным сенсором окислительного стресса, в свободном состоянии закрепляясь на мембранах митохондрий в комплексе с белком PGAM5, который в случае чрезмерного повышения концентрации кислородных радикалов опосредует пермеабилизацию митохондриальной мембраны и начало апоптоза [Stpkowski T.M., Kruszewski M.K., 2011]. В то же время, прямого влияния на индукцию апоп-тоза или самостоятельного антиапоптотического эффекта Keap1, по всей видимости, не оказывает.
Роль Nrf2 в процессе дифференцирования кератиноцитов в норме, возможно, сводится к элиминации активных форм кислорода, образующихся в ходе дифференцирования; также обнаружено усиление экспрессии подконтрольных Nrf2 белков, таких как HO1 и NQO [Piao M.S. et al., 2012]. При этом двойной нокаут Nrf2 не сказывается на развитии кожи или процессах репарации после повреждения [Keller U. et al., 2006]. С другой стороны, повреждение, сопровождающееся образованием большого количества свободных радикалов, вызванное ультрафиолетовым излучением, в гораздо большей степени требует активности Nrf2/Keap1/ARE [Tian F.F. et al., 2011].
В случае избыточности клеточного ответа, в результате постоянной работы сигнальная система Nrf2/Keap1/ARE может запускать каскады патологических реакций. Например, мыши, нокаутные по Keap1, у которых Nrf2 постоянно активен, погибают на ранних сроках после рождения вследствие гиперкератоза пищевода [Wakabayashi N. et al., 2003]. Аналогичные изменения происходят с кератиноцита-ми кожи. Интересно, что мыши с сохраненной активностью Keap1, но повышенной экспрессией Nrf2 (полученные путем создания соответствующей линии животных или хронической химической индукцией Nrf2) демонстрируют противоположный фенотип. Мыши были жизнеспособны, гиперкератоза пищевода не отмечалось, но отмечался гиперкератоз кожи. У этих животных наблюдалось существенное нарушение барьерной функции кожи, связанной с нарушением продукции межклеточ ного матрикса [Schfer M. et al., 2012]. Это наблюдение указывает на косвенную связь между активностью Nrf2, пролиферацией кератиноцитов и их дифференци-рованностью. В то же время, Nrf2 может непосредственно контролировать процессы пролиферации и дифференцирования. Так одним из генов мишеней Nrf2 является Notch1 – важный регулятор пролиферации и дифференцирования клеток [Hamanaka R.B. et al., 2013].
У мышей с нокаутом Nrf2 происходит нарушение регенерации печени, связанное со снижением экспрессии Notch1 [Wakabayashi N. et al., 2010а]. Возможно, гиперпролиферация кератиноцитов у мышей с нокаутом Keap1 опосредована повышенной экспрессией Notch1 под действием избыточной активации Nrf2.
Дефицит транскрипционного фактора Nrf2 не сказывается на гомеостазе кожи и ее структуре [Keller U. et al., 2006], активность системы Nrf2/Keap1/ARE увеличивается в кератиноцитах, последовательно дифференцирующихся от базального слоя к роговому [Piao M.S. et al., 2011]. Клетки базального слоя эпидермиса более чувствительны к апоптозу, индуцированному перекисью водорода, чем клетки зернистого слоя [Zuliani T. et al., 2005], что может быть связано с повышенным уровнем активности Nrf2 в дифференцирующихся клетках [Carr W.J., Oberly-Deegan R.E., 2011].
Исследование апоптотической и некротической гибели клеток после гиперосмотического воздействия
Кроме того, увеличивалось количество кератиноцитов, активно синтезирующих цитокератин-10, с 3% в контрольных клетках до 25% в клетках после гиперосмотического воздействия (Рисунок 13).
Следует отметить, что в указанные сроки не происходило ожидаемого сокращения экспрессии цитокератина-5, маркирующего базальные кератиноциты, наряду с усилением экспрессии цитокератина-10, маркирующего дифференцированные клетки. В популяции также присутствуют клетки, экспрессирующие оба цитокератина одновременно, чего не происходит в нормальных кератиноцитах in vivo. Это является особенностью выбранной в качестве модели культуры кератино-цитов [Page S.M., Brownlee G.G., 1998].
В целом, на данном этапе исследования установлено, что воздействие гиперосмотическими растворами усиливает синтез цитокератина-10 примерно у четверти клеточной популяции. Кроме того, происходит усиление экспрессии филаггрина и лорикрина, что свидетельствует об индукции дифференцировочных процессов в кератиноцитах. Полученные результаты согласуются с литературными данными, полученными после гиперосмотического воздействия на кератиноциты сорбитолом [Mammone T. et al., 2007]. Также эти результаты объясняют получаемые позитивные эффекты при бальнеотерапии высокоминерализованными растворами, а именно, восстановление эпидермального барьера [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И., и др., 2006; Harari M. et al., 2000], вследствие активации процессов дифференцирования и ингибирования пролиферации кератиноцитов.
По-видимому, дифференцированию подверглись те кератиноциты, в которых в ответ на гиперосмотическое воздействие произошел арест клеточного цикла в G0-стадии. Известно, что в нормальных условиях в коже процессу дифференциро вания кератиноцитов предшествует переход клетки из G1 в G0-стадию [Gandarillas A. et al., 2000].
Дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния гиперосмотического воздействия на работу систем, участвующих как в процессах дифференцирования, так и в обеспечении гомеостазирующих функций, формирующих клеточный ответ на изменение условий окружающей среды.
Исследование особенностей продукции активных форм кислорода кератиноцитами при гиперосмотическом воздействии
Активные формы кислорода образуются в клетках в ходе естественного метаболизма дыхательной цепи переноса электронов или системой ферментов NADPH оксидаз. Последние, как правило, выполняют защитную функцию и продуцируются специализированными клетками, в то время как образующиеся в цепи переноса электронов АФК (митохондриальные) являются результатом утечки электронов из комплексов 1 и 3 [Genova M.L. et al., 2001]. Митохондриальные АФК (мАФК) играют важную роль в физиологии клетки, участвуют в инициации и регулировании процессов аутофагии, пролиферации и дифференцирования [Kato M. et al., 1995; Garach-Jehoshua O. et al., 1998; Breitkreutz D. et al., 1998]. А) Результаты исследования продукции АФК на проточном цитофлуоримет-ре.
Исследование продукции АФК для выявления раннего клеточного ответа проводили на двух сроках: через 10 и 120 минут после начала гиперосмотического воздействия. Установлено, что уже через 10 минут после начала воздействия гиперосмотическими растворами в концентрациях 4 и 8 г/л происходило увеличение количества детектируемого супероксид-аниона (Рисунок 14.А). Одновременно отмечали увеличение количества перекиси водорода в ответ на гиперосмотические воздействие на концентрациях 2, 4, 8 г/л (Рисунок 14.Б). Через 120 минут после начала эксперимента уровень продукции супероксид-аниона и перекиси водорода клетками восстанавливался до контрольного во всех группах.
Большинство АФК в клетке образуется из супероксид-аниона. Вероятно, супероксид-анион под воздействием гиперосмотического раствора в концентрации 2 г/л все же образуется, но в меньшем количестве, чем в случае более высоких концентраций растворов. В результате быстрого конвертирования супероксид-аниона в перекись водорода это количество не может быть детектировано использованным методом. В то же время, данные о продукции перекиси водорода свидетельствуют о том, что гиперосмотическое воздействие всеми выбранными концентрациями сопряжено с повышением продукции гидроперекисей. А
Исследование активации сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии
В ходе проведенных исследований установлено, что воздействие гиперосмотическими растворами препарата «Рапан» на кератиноциты оказывает временный цитостатический эффект, вызывая арест клеточного цикла в фазе G0 и G1 и, как следствие, остановку пролиферации. При этом часть клеток, находящихся в фазе G1, в дальнейшем образует новый пролиферирующий пул, тогда как клетки, находящиеся в G0-фазе клеточного цикла, претерпевают процесс дифференцирования, сопровождающийся активацией макроаутофагии и экспрессией белков, характерных для дифференцированных кератиноцитов – филаггрина, лорикрина и цитоке-ратина-10. Данные свойства выбранных растворов могут быть использованы для направленной регуляции процессов клеточной пролиферации и дифференцирования, в случае гиперпролиферативных проявлений в коже при воспалительных заболеваниях.
Установлено, что гиперосмотическое воздействие на кератиноциты линии HaCaT приводит к генерации внутриклеточных АФК. Усиление продукции АФК развивается в первые минуты после начала гиперосмотического воздействия и носит временный характер. Скорее всего, продукция АФК связана с влиянием гиперосмотических растворов на функцию митохондрий, поскольку одновременно с повышением продукции АФК отмечали снижение трансмембранного митохондри 99 ального потенциала. Полученные в ходе этого эксперимента данные впервые указывают на прямую связь между гиперосмотическим воздействием и окислительным стрессом в кератиноцитах. Кроме того, учитывая собственную роль АФК в регулировании дифференцировочных процессов кератиноцитов, нельзя исключать, что влияние гиперосмотического воздействия усиливает синергизм клеточных механизмов, отвечающих за дифференцирование клеток.
Гиперосмотическое воздействие на кератиноциты и генерация АФК приводит к активации редокс-чувствительного транскрипционного фактора Nrf2, причем эта активация происходит одновременно с повышением продукции АФК. С одной стороны, это служит причиной элиминации АФК, а с другой, вероятно, приводит к запуску сигнальных каскадов, которые могут обеспечить как восстановление клеточного цикла, так и инициацию процесса дифференцирования клеток. Кроме того, после гиперосмотического воздействия изменятся характер взаимодействия цито-плазматического Nrf2 с актиновым цитоскелетом кератиноцитов, его реорганизация и «разобщение» с Nrf2, что может выступать в роли возможного дополнительного механизма активации транскрипционного фактора Nrf2.
Исследование реорганизации цитоскелета кератиноцитов во время гиперосмотического воздействия свидетельствует об активации малой ГТФазы Rac1, обеспечивающей клеточный сигналинг от цитоплазматической мембраны к ядру и запуск механизмов адаптивного ответа клетки на гиперосмотическое воздействие.
Активация малой ГТФазы Rac1 сопряжена с функционированием фактора транскрипции NF-B, под контролем которого находятся различные провоспали-тельные и противовоспалительные цитокины. В ходе исследования продукции ци-токинов ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО- установлено, что прямое воздействие гиперосмотических растворов на кератиноциты не приводит к активации продукции ИЛ-1, ИЛ-10, ФНО-, но сопряжено с изменение продукции ИЛ-6 при разных режимах воздействия гиперосмотическими растворами. Особенностью воздействия гиперосмотических растворов является также снижение ядерной локализации фактора транскрипции NF-B при длительной экспозиции. Однако остается не ясным, отражает ли ядерная локализация NF-B истинный уровень активности этого транскрипционного фактора, учитывая, что непродолжительное гиперосмотическое воздействие приводит к существенному увеличению продукции NF-B зави 100 симого цитокина ИЛ-6, но не влияет на продукцию других NF-B-зависимых цито-кинов, таких как ИЛ-1 и ФНО-. Возможно, данное явления объясняется отсутствием воспалительного процесса в используемой клеточной модели. Следует заметить, что индуцибельный эффект гиперосмотического воздействия на продукцию ИЛ-6, видимо, может действовать синергично с механизмами, обеспечивающими выход клетки из ареста клеточного цикла и стимулирующими пролиферативную активность.
В целом, полученные данные впервые комплексно описывают молекулярно-клеточные процессы и их механизмы, реализующиеся в ответ на гиперосмотическое воздействие на кератиноциты in vitro. Полученные результаты не только проясняют известные клинические данные по лечению воспалительных процессов в коже гиперосмотическими растворами, но и предполагают механизмы их реализации через изменение пролиферативной активности, усиление дифференцировоч-ных процессов и активацию редокс-чувствительных сигнальных систем клетки. Полученные данные, несомненно, полезны для разработки направленного и осознанного воздействия на эпидермис гиперосмотическими растворами, с возможностью модулировать внутриклеточные процессы при воспалительных заболеваниях кожи, таких как псориаз и атопический дерматит.
