Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Теломераза 11
2. Теломеры 35
3. Теломераза и опухоли 48
4. Способы подавления опухолей, опосредованные теломерами и теломеразой 53
5. Теломеризация клеток 61
6. Противоречия теломерной теории 73
7. Японские ускоренно стареющие мыши (SAM) 74
8. Изучение регуляции пролиферации в опытах на гетерокарионах 78
9. Кариологическая нестабильность межвидовых гибридов 80
Материалы и методы 86
Результаты исследований и их обсуждение
1. Длительное подавление функции теломеразы 106
Изучение длительного подавления функции теломеразы в клетках грызунов 106
Изучение длительного подавления функции теломеразы в клетках человека 120
Обсуждение результатов по длительному подавлению функции теломеразы 127
2. Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши в условиях подавления функции теломеразы 139
Обсуждение опытов со спонтанными трансформантами 145
3. Гипотеза петлевой организации теломер 146
4. Сегрегация хромосом человека в соматических гибридах с клетками мыши 150
Обсуждение механизмов сегрегации хромосом 153
5. Теломеразная активность клеток при изменениях их пролиферативного состояния 156
Обсуждение связи теломеразной активности с пролиферативным состоянием 161
6. Экспрессия эндогенной р-галактозидазы в неделящихся клетках 165
Обсуждение опытов по р-галактозидазе 169
7. Особенности клеток японских ускоренно стареющих мышей sam 171
Обсуждение опытов с японскими ускоренно стареющими мышами 180
Время переживания состарившихся клеток - новый инструмент изучения старения 189
8. Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека 199
Обсуждение опытов по теломеризации клеток человека 207
9. Опыты на гетерокарионах с макрофагами 211
Обсуждение опытов с гетерокарионами 220
Заключение 228
Выводы 230
Благодарности 233
Список литературы 234
- Способы подавления опухолей, опосредованные теломерами и теломеразой
- Изучение регуляции пролиферации в опытах на гетерокарионах
- Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши в условиях подавления функции теломеразы
- Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека
Введение к работе
Теломерами называют концевые участки хромосом, образованные теломерной ДНК и белками. Оказалось, что у человека и всех позвоночных теломерная ДНК на всех хромосомах представлена в виде монотонного повтора TTAGGG, общей длиной в сотни и тысячи т.п.н. Теломерная ДНК соматических клеток укорачивается при пролиферации клеток, вследствие неполной репликации концевых участков (концевой недорепликации). Короткие теломеры вызывают явление репликативного старения, когда пролиферация клеток останавливается. Полагают, что репликативное старение у человека служит мощным барьером на пути развития рака. Нарушение механизмов репликативного старения (происходит в подавляющем большинстве случаев канцерогенеза) приводит к отмене теломерного контроля пролиферации, и клетки продолжают размножаться, несмотря на чрезмерное укорачивание, вплоть до полного исчезновения, теломер. В этом случае механизмы репарации ДНК пытаются предотвратить полное разрушение генома. Сверхкороткие теломеры воспринимаются клеткой, как разрывы хромосом. Такие разрывы "чинятся" путем их соединения; происходят теломерные слияния. В результате образуются хромосомы, имеющие по две центромеры. При прохождении через митоз дицентрик, с большой вероятностью, образует хромосомный мост, который разрешается случайным разрывом хромосомы. Образуются две клетки: одна с нехваткой генов, другая с лишними копиями и с хромосомным разрывом. Клетка с нехваткой генов обычно погибает, а с лишними копиями и хромосомным разрывом продолжает размножаться. Последовательность событий "слияние-мост-разрыв" многократно повторяется, генерируя на каждом этапе новый генотип, состоящий из базового набора генов и некоторого меняющегося довеска. На каком-то этапе хромосомный разрыв может "залечиться" и превратиться в теломеру. Процесс "слияние-мост-разрыв" приводит к многократному увеличению скорости изменчивости клеток и в условиях организма (при наличии опухоли, вес которой обычно измеряется граммами) к очень быстрой селекции высокозлокачественных и устойчивых к предложенной терапии клеток.
Явление концевой недорепликации и существование специального фермента, ее компенсирующего было предсказано в 1971 г. Алексеем Оловниковым. В 1985 году этот фермент, получивший название теломераза, был обнаружен в клетках простейшего Tetrahymena, спустя несколько лет - в клетках большинства эукариот. Оказалось, что фермент в полную силу работает в клетках половой линии, надстраивая их теломеры и, таким образом, обеспечивая клеточное бессмертие и возможность нашего существования. Незначительную активность теломераза проявляет в стволовых и в ряде клеток иммунной системы, частично компенсируя концевую недорепликацию. Активность появляется на короткий срок в период интенсивной пролиферации (например, после встречи предшественника В-лимфоцита с антигеном).
Активацию фермента теломеразы обнаруживают в 85-90% всех опухолей человека. На сегодняшний день это наиболее общий маркер рака. Фермент теломераза обеспечивает опухолевым клеткам возможность безграничной пролиферации, что в свою очередь предоставляет им время и, соответственно, возможность изменяться, выживать и захватывать новые ниши в организме. Если бы в процессе канцерогенеза не происходило активации теломеразы, то клетки, в большинстве случаев, не смогли бы дожить до злокачественных стадий, и не было бы абсолютного большинства раковых опухолей.
Все клетки человека в раннем эмбриогенезе обладают теломеразной активностью, которая по мере развития выключается во все большой доле клеток. Человек устроен таким образом, что клетки организма, которым суждено много пролиферировать сохраняют ограниченную, временно индуцируемую теломеразную активность. Это позволяет до какой-то степени стабилизировать хромосомы этих клеток и уменьшить изменения, происходящие с возрастом. Стволовые клетки и разного ранга предшественники меняются с возрастом медленнее, чем это было бы при полном отсутствии теломеразной активности. В подавляющем большинстве клеток человеческого организма происходит очень надежная репрессия теломеразы. Это служит эффективным противораковым механизмом, которым обладают, видимо, крупные, долгоживущие виды млекопитающих, включая человека. При работе с клетками человека in vitro практически никогда не наблюдают спонтанной активации теломеразы в нормальных клетках.
Есть серьезные основания полагать, что медицина будущего будет во многом основываться на клеточно-заместительных технологиях. Благодаря развитию цивилизации население земного шара прогрессивно стареет. Продолжительность жизни людей сильно превысила ту, которая была выработана в процессе естественного отбора. Поэтому естественные ресурсы человеческого тела оказываются недостаточными для нормальной жизни в возрасте, превышающем возраст людей каменного века (до 40 лет). В процессе старения происходит гибель клеток организма, которая не может быть восполнена регенерацией. Со временем потеря клеток приводит к ослаблению функций органов и тканей, уменьшению их надежности, развитию болезней, связанных со старением, и в итоге - к гибели организма. Помимо собственно старения, любые болезни и травмы приводят к потерям клеток. Бывают и специфические болезни, выражающиеся в прогрессивной потере клеток. В 1998 г. впервые было показано, что введение гена каталитического компонента теломеразы способно иммортализовать клетки человека, т.е. придать им способность проходить в культуре неограниченное число делений. Исследователи не наблюдали никаких побочных последствий такой иммортализации. Мы полагаем, что наиболее реалистичным подходом, позволяющим получать достаточное для клеточно-заместительной терапии количество клеток, является временная экспрессия гена каталитического компонента теломеразы в клетках человека in vitro. При этом теломераза будет удлинять теломеры, но не будет происходить генетической модификации клеток. Такая процедура позволит нарастить необходимую клеточную массу и провести в случае надобности генно-инженерную коррекцию дефекта. Таким образом, клеточно заместительные технологии могут оказаться необходимыми и для генной терапии. Возможно, что основные операции по "лечению больных генов" будут производиться вне тела пациента с последующим введением клеток в организм.
Регуляция теломеразы в организме выработалась в эволюции как результат баланса двух тенденций: борьбы с раком и уменьшением последствий старения. Блокада теломеразы предотвращает рак, но уменьшает возможности клеток пролиферировать, что необходимо для продолжительной жизни; реактивация теломеразы открывает возможности повысить регенерационные возможности организма, но увеличивает возможность ракового перерождения.
Сразу после открытия теломеразы, возникла идея лечить рак с помощью подавления теломеразы. Во всем мире развернулись работы по поиску ингибиторов теломеразы.. Например корпорация Geron в 1994 г. испытывала до 2000 препаратов в неделю (персональное сообщение Dr. М. West). К сожалению, эти интенсивные поиски до сих пор не привели к серьезным достижениям, пригодным для клинического использования Мы посчитали, что в таких условиях было бы разумно изучить последствия подавления работы теломеразы в клетках, используя уже имеющиеся соединения, которые блокируют теломеразу, но не годны для лечения в силу разнообразных побочных эффектов. В результате, мы провели цикл работ по долговременному блокированию функции теломеразы в разнообразных бессмертных клетках.
В 80-е годы, на основании опытов по слиянию клеток нами был сделан вывод о том, что макрофаги способны каким-то образом быстро распознавать иммортальные клетки. После открытия теломеразы мы решили проверить, не ответственна ли теломераза за этот эффект. Наши опыты с гетерокарионами подтвердили это предположение и привели к созданию системы, которая позволяет быстро и с минимальными затратами реактивов проверять ингибиторы теломеразы на клеточном уровне. Используя современные системы скрининга и компьютерного моделирования сравнительно легко получить ингибитор фермента, который будет работать в тест-растворе. Однако, тысячи соединений, подавляющих теломеразу в растворе, оказываются малоэффективными внутри клетки.
Клеточно-заместительная терапия, по нашему мнению, должна стать новым ведущим разделом медицины будущего. Полагают, что только в США ежедневно гибнет около 3000 человек, которые могли бы быть спасены с помощью клеточно-заместительных технологий (http://www.cdc.gov/nchs/). Таким образом, потенциальный рынок клеточно-заместительных технологий сравним с бюджетом Пентагона. Активация теломеразы - это единственный нормальный, предусмотренный природой путь продления пролиферации любых клеток человека, включая пролиферацию различных стволовых клеток. Клетки с короткими теломерами плохи не только тем, что перестают расти. В них изменяется экспрессия разнообразных генов. Механизм этого явления и его роль в старении организма еще не ясны. Однако многие данные показывают, что изменения экспрессии генов, происходящие при старении клеток в культуре, при перенесении этих закономерностей на ситуацию in vivo, должны сказываться неблагоприятно на функциях тканей. Таким образом, управление теломеразой становится задачей огромной практической и теоретической важности. В последние годы мы становимся свидетелями коммерциализации исследований, связанных с клеточными технологиями. Происходит борьба за сферы влияния, потенциальные рынки. Частный капитал активно включается в этот процесс. Все это указывает на скорый практический выход. С другой стороны, коммерциализация исследований по теломеразе заставляет настороженно относится к разнообразным "успехам" в этой области. Под давлением интересов вкладчиков денег возможны искажения научной информации. Поэтому, как только представился случай поработать с геном теломеразы, мы воспользовались им и ввели ген каталитического компонента теломеразы в фибробласты человека. Мы хотели, сами убедится в отсутствии отрицательных последствий теломеризации, поскольку считаем, что временная экспрессия гена каталитического компонента теломеразы может в будущем использоваться в клеточно-заместительных терапиях.
Поиски того, как связано клеточное старение со старением организма подтолкнуло нас к изучению японских ускоренно стареющих мышей. Ускоренное старение мышей линии SAMP1 очень напоминает естественный процесс. Благодаря небольшой продолжительности жизни мышей SAMP1 нам удалось в одном исследовании соединить изучение продолжительности их жизни и различные тесты на клетках, включая измерение теломеразной активности, теломер, пролиферативного потенциала и времени переживания неделящихся клеток, что стало новым показателем, связывающим продолжительность жизни с поведением клеток in vitro.
В процессе измерения теломеразной активности у нас возникали трудности с воспроизводимостью результатов измерения. При анализе данных выяснилось, что теломеразная активность сильно зависит от пролиферативного статуса клеток, что послужило стимулом к независимому изучению этого вопроса. В процессе разработки метода измерения теломеразной активности была обнаружена новая ДНК-полимеразная активность.
При изучении старения организмов исследователям всегда хотелось иметь четкие маркеры клеточного старения. В 1994 году появилась статья о том, что, якобы найден исключительный маркер клеточного старения. Мы, учитывая собственный опыт, усомнились в этом и провели специальное исследование, показавшее, что эндогенная 0-галактозидаза (рН 6.0) не является исключительным маркером старения клеток, а появляется в различных длительно неделящихся клетках.
Способы подавления опухолей, опосредованные теломерами и теломеразой
Обращают на себя внимание следующие особенности. 1. теломеразные ОТ трех групп очень разных организмов (млекопитающие, грибы, простейшие) имеют очень большое сходство. 2. Теломеразные ОТ довольно сильно отличаются от non-LTR ретротранспозонов, которые взяли на себя функцию теломеразы у Drosophila (Biessmann et al, 1990). По мнению наиболее авторитетных исследователей в этой области (Nakamura and Cech, 1998) теломеразная ОТ имеет очень древнее происхождение (от первых эукариот), а механизмы поддержания теломер без участия теломеразы возникли позже и независимо у разных организмов (лилейные, двукрылые, часть жесткокрылых) после потери теломеразной ОТ.
Механизм работы теломеразы - это повторное копирование матрицы, включающее этап связывания фермента с теломерной ДНК, этап элонгации, когда дезоксирибонуклеотиды последовательно добавляются к З -концу G-богатой цепи теломеры и этапа транслокации фермента на конец новообразованной цепи (рис. 2) (Harley et. al., 1994).
В начале происходит связывание 3 - одноцепочечного конца хромосомы с теломеразой, при этом 3 - конец располагается вдоль РНК - матрицы теломеразы, в то время как лежащая ниже последовательность праймера связывается с "якорным" сайтом фермента, затем осуществляется РНК - зависимый синтез ДНК, после чего происходит транслокация, т.е. перемещение ДНК, удлиненной на один повтор, относительно фермента. Связывание праймера с "якорным" сайтом фермента предотвращает диссоциацию в процессе транслокации и позволяет провести следующий цикл полимеризации (Grader, Blackburn, 1996). Впоследствии комплементарная С - цепь образуется с помощью ДНК - pola/праймазы, которая образует РНК - затравку, удлиняемую ДНК - pola (Sancar, 1996, Wood, 1996; Diede and Gottschling, 1999). Второй участок связывания праймера был функционально определен в исследовании, показавшем, что узнавание праймера и процессивность теломеразы зависят от присутствия G-богатой теломерной последовательности на 5 конце праймера, даже когда У конец нетеломерный (Morin, 1991; Harrington and Greider, 1991; Lee and Blackburn, 1993; Melek et al., 1996). Этот сайт отличается от сайта, в котором происходит связывание между 3 концом ДНК праймера и матричным районом РНК. Фиксирование 5 конца праймера в связывающем сайте вероятно вносит вклад в процессивность, предотвращая диссоциацию праймера и фермента во время транслокации вновь синтезированного У конца вдоль РНК матрицы. В исследованиях на теломеразе из Euplotes У конец праймера был связан в активном сайте, при этом образование сшивок между ДНК и белком происходило на расстоянии 20-22 нуклеотидных остатков от 3 конца, что подтверждает предположение о взаимодействии праймера с сайтом связывания (Hammond et al., 1997). Интересно, что в исследовании, где использовались частично дуплексные субстраты с 3 однонитевым выступающим концом, которые должны более точно моделировать природные теломеры, были получены сшивки между белком и двухцепочечной частью субстрата.
Самые последние данные свидетельствуют, что основную роль в связывании теломеразы с субстратом играют ДНК-белковые взаимодействия субстрата с каталитической субъединицей. Роль спаривания оснований субстрата и матрицы -минимальна (Wallweber et al., 2003).
Для некоторых теломераз показана экзонуклеазная активность, которая позволяет теломеразам гидролизовать как праймеры (участки ДНК с теломерной последовательностью имеющие конец), так и продукты ферментативного синтеза. Впервые экзонуклеазная активность была продемонстрирована in vitro для теломеразы Tetrahymena (Collins and Greider, 1993), которая удаляла У - концевой нуклеотидный остаток праймера. Экзонуклеазная активность показана также для теломеразы дрожжей S. cerevisiae, которая может удалять с У- конца праймера до 8 н.о. (Cohn and Blackburn, 1995). Большинство теломераз копируют свой матричный район верно, синтезируя теломеры, составленные из монотонных повторов одинаковой теломерной последовательности, однако, теломеразы из некоторых видов синтезируют теломеры с нерегулярной последовательностью (Табл. 2). Это может быть вызвано либо высокой частотой неправильного включения dNTP, как происходит в случае некоторых теломераз Paramecium (McCormick-Graham et al., 1997), или может быть следствием проскальзывания матрицы, частичной транслокации в течение синтеза единичного повтора, вызывая двойное копирование одного или более нуклеотидов матрицы (Yu and Blackburn, 1991; Cohn and Blackburn, 1995). Теломеры S. cerevisiae проявляют исключительную вариабельность последовательности и состоят из нерегулярных повторов, составляющих консенсус T(G)2-3(TG)i_6 (Shampay et al., 1984; Wang and Zakian, 1990). Это возможно благодаря различному позиционированию теломерного праймера вдоль матрицы (Kramer and Haber, 1993; Prescott and Blackburn, 1997). Остается непонятным, вызвана ли неточность этих полимераз только чертами, присущими РНК компоненту. Например, хотя фермент S. cerevisiae имеет длинную матрицу по сравнению со многими другими теломеразами (Табл.2), другие почкующиеся дрожжи синтезируют теломеры состоящие из регулярных повторов (McEachern and Blackburn, 1995). 1.6. Организация гена каталитической субъединицы теломеразы
Обычно ген каталитической субъединицы теломеразы представлен в виде одиночной копии. Исключение составляют Candida albicans (2 копии) (Metz et al., 2001) и Euplotes crassus, где обнаружено 3 гомолога (Karamysheva et al., 2003).У Euplotes crassus в процессе развития происходит переключение работы генов: один из них участвует в поддержании размера теломер, другой ген (с измененной последовательностью) функционирует для обеспечения синтеза теломер de novo, в процессе реорганизации макронуклеуса.
Ген hTERT состоит из 16 экзонов и 15 интронов (Рис. 6) (Nakamura et al., 1997) Размер экзонов варьирует от 62 до 1354 н.п. Интроны варьируют по длине в пределах от 104 до 8616 н.п. Общая длина hTERT гена составляет 37 т.п.н. (Wick et al., 1999). Первый экзон содержит старт кодон трансляции.
Изучение регуляции пролиферации в опытах на гетерокарионах
Теломераза способна не только поддерживать размер теломерного повтора, но и синтезировать теломеры de novo. У простейшего Euplotes crassus во время реорганизации генома образуется 10 степени линейных молекул ДНК, фланкированных теломерными последовательностями. Ранее полагали, что для выполнения такой работы теломераза Euplotes соединяется с дополнительной субъединицей, которая обеспечивает процессивность работы фермента на любых праймерах (Bednenko et al., 1997). Позже было показано, что у Euplotes существуют несколько генов, кодирующих разные каталитические субъединицы теломеразы. Один из генов функционирует для синтеза теломер de novo (Karamysheva et al., 2003). В других фазах роста теломераза Euplotes неспособна эффективно удлинять нетеломерные праймеры.
Диминуция хроматина у нематоды Ascaris suum сопровождается образованием теломер de novo. При этом теломераза наращивает теломеры на 3 -концах, имеющих ограниченную гомологию с теломерным повтором: для образования новой теломеры достаточно совпадения трех последних нуклеотидов (Magnenatet al., 1999).
Описано появление нормально функционирующих теломер de novo у человека. В ряде случаев а-талассемии происходит разрыв а-глобинового гена, расположенного на конце короткого плеча хромосомы 16. При этом последовательность а-глобина непосредственно переходит в теломерную последовательность без образования каких-либо промежуточных субтеломерных последовательностей. Для образования такой теломеры требуется ограниченная гомология на З -конце в области разрыва (3-4 нуклеотида) (Flint et al., 1994). Образование новых теломер таким способом означает, что наличие всего лишь одного теломерного повтора является достаточным условием для образования функционирующей теломеры, и что субтеломерные повторы у человека не несут теломероспецифических функций.
Для объяснения процессов иммортализации клеток человека была предложена гипотеза М1-М2 (Wright et al., 1989; Shay et al., 1993a) (рис.13). Согласно этой гипотезе, для иммортализации, клеткам необходимо преодолеть два различных механизма, ограничивающих пролиферацию. Первый механизм (Ml) включается, когда длина телом ер достигает некоего минимума. Именно Ml ответственен за старение клеток в культуре (предел Хейфлика).
До сих пор неясно, каким образом запускается Ml, поскольку длина теломер при этом составляет несколько тысяч нуклеотидов (Shay et al., 1993а). По одной гипотезе, относительно короткие теломеры способны служить в качестве сигнала повреждения ДНК (Levy et al., 1992). По другой - укорачивание теломер изменяет экспрессию регуляторных генов, локализованных в субтеломерном гетерохроматине (Wright and Shay, 1992а).
Белки различных опухолевых ДНК-содержащих вирусов способны увеличивать пролиферативный потенциал клеток человека и тем самым обходить (отменять) Ml. Этими свойствами обладают Т-антиген SV40, антигены Е6/Е7 вируса папилломы человека типа 16, антигены Е1а/Е1в аденовируса типа 5 (Wright and Shay, 1992b; Shay et al., 1993).
Различными способами показано, что в реализации Ml участвуют белки р53 и pRb или pRb-подобная активность (Нага et al., 1991; Shay et al., 1991). В эпителиальных клетках человека Ml менее надежен, чем в фибробластах в его реализации обычно не участвует pRb (Shay et al., 1993b; Gollahon and Shay, 1996). Вероятно пролиферативный блок при Ml опосредуется факторами типа р21, которые подавляют активность комплексов циклин/CDK (Sherr and Roberts, 1995; Brown et al., 1997).
Обход (отмена) Ml позволяет клеткам пролиферировать дополнительное время (для фибробластов человека - около 30-40 удвоений популяции), пока второй механизм (М2) не вызовет состояние кризиса. Кризис характеризуется процессом пролиферации, сопровождающимся массовой гибелью клеток. При этом размер популяции какое-то время может быть стабильным. С низкой вероятностью после кризиса могут возникнуть иммортальные клетки. Полагают, что кризис вызывается чрезмерным укорачиванием теломер, приводящим к их физическому исчезновению (Shay et al., 1993а; Wright and Shay, 1996b), В большинстве случаев единственным путем выхода из кризиса является реактивация теломеразы.
Некоторые эукариотические виды, очевидно, полностью потеряли в процессе эволюции связанный с теломеразой способ поддержания теломерной ДНК, но все еще сохранили функциональные теломеры. В этих организмах, теломерная ДНК состоит из последовательностей другого типа, обеспечиваемых необычными методами поддержания теломер. В одном таком, хорошо изученном случае, плодовой мушки Drosophila melanogaster теломеры состоят из смешанной мозаики больших транспозонов не-LTR типа, называемых НеТ-А и TART элементы (Pardue and DeBaryshe, 1999). Спорадически, один из этих ретротранспозонов добавляется на концевые части хромосом посредством ретротранспозиционных механизмов, что противодействует постепенной потере со временем теломерных последовательностей хромосом. Другой, теломеразо-независимый механизм используется для поддержания теломер у комара Chironomus tentans и у лука Allium сера (McEachem et al., 2000). Их теломерные области не содержат коротких повторов теломеразного типа, вместо этого, их теломеры состоят из больших массивов повторов со сложной последовательностью. Эти сложные повторы доходят до самого конца теломеры и имеют такие характеристики, как если бы они поддерживались путем рекомбинации, включающей неравный гомологичный кроссинговер и генную конверсию.
В одной из работ (Murnane and Yu, 1993; Murnane et al., 1994) удалось проследить за изменениями длины отдельной теломеры. При трансфекции иммортальных клеток человека плазмида случайно встроилась очень близко к теломерному повтору, что позволило использовать длину рестриктазного фрагмента, содержащего плазмиду, как меру длины теломерного повтора. При дальнейшем культивировании этих клеток, которые не обладали теломеразной активностью, наряду с постепенными изменениями длины теломеры, которые соответствовали процессу недорепликации в различных клеточных субклонах, наблюдали более редкие события, когда длина теломеры одномоментно менялась на несколько т.п.н. Полагают, что эти изменения могут возникать вследствие нереципрокной рекомбинации (Murnane et al., 1994; Wang and Zakian, 1990).
Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши в условиях подавления функции теломеразы
Бессмертные мышиные фибробласты линий ЗТЗ Swiss или NIH ЗТЗ часто называют минимально трансформированными клетками. По сути, эти клетки являются спонтанными трансформантами эмбриональных фибробластов мыши и могут быть рассмотрены, как нормальные фибробласты мыши с реактивированной теломеразой. Большинство спонтанно трансформированных фибробластов мыши реактивируют теломеразную активность, чтобы стать иммортальными (Yegorov et al., 1996а, Егоров и др., 1997а,Ь).
Наиболее вероятная последовательность событий при спонтанной трансформации эмбриональных фибробластов мыши следующая: укорачивание теломер в ЭФМ ведет к индукции Ml механизма, который останавливает пролиферацию. Некоторые клетки с относительно высокой вероятностью способны реактивировать теломеразу, что ведет к удлинению теломер и к отмене МІ. В результате пролиферация восстанавливается. Подавление теломеразы или блокирование ее функции в таких клетках ведет к укорачиванию теломер и к индукции сохраненного клетками механизма Ml, который блокирует клетки в G1 снова. Возможно, именно эти события происходили в культуре бессмертных фибробластов мыши и в культуре миобластов крысы.
Обратимость индуцированного ИОТ старения легко объяснима. Известно, что в клетках человека теломеразная активность не зависит от стадии клеточного цикла (Holt et al., 1997), а мышиные клетки ЗТЗ Swiss обладают теломеразной активностью, по крайней мере, первые 5 дней после выхода из клеточного цикла (Егоров и др., 1998). Поэтому при отмене ИОТ теломеразная функция в неделящихся клетках восстанавливается, что ведет к удлинению теломер, отмене механизма Ml и последующему восстановлению пролиферации. Большие клетки, сформировавшиеся во время искусственного старения, имеют хорошо развитую структурированную цитоплазму, которая препятствует нормальному цитокинезу. Синтез ДНК в отсутствии цитокинеза ведет к образованию двуядерных клеток, которые имеют шансы стать полиплоидными. Такие полиплоидные клетки дают начало гигантским митотическим клеткам.
Вполне возможно, что большинство человеческих клеток теряют способность стареть в процессе канцерогенеза. Насколько нам известно, бессмертные клетки человека в культуре появляются только после продолжительного пребывания в состоянии кризиса, (исключение составляет случай теломеризации клеток человека) (см. обзор Shay et al., 1991а; Rubelj, Pereira-Smith, 1994). Согласно гипотезе М1/М2 механизмы старения в кризисных клетках либо инактивированы, либо уничтожены.
Частота спонтанной трансформации диплоидных фибробластов человека примерно на порядок ниже частоты спонтанного мутационного события (Wright and Shay, 1992a,b; Kuroki and Huh, 1993). Поэтому частота спонтанной реактивации теломеразы в нормальных клетках должна быть еще ниже. Эпидемиологическая статистика указывает, что среди нескольких (от трех до семи, в среднем четырех) последовательных событий, которые происходят в процессе канцерогенеза (Альберте и др., 1994) только одно является реактивацией теломеразы. Реактивация теломеразы происходит в 85% опухолей (Kim et al., 1994). Если частота реактивации теломеразы ниже, чем какого-либо мутационного события, мы можем ожидать, что другое событие (не реактивация теломеразы), необходимое для образования опухоли будет происходить в среднем раньше, чем реактивация теломеразы.
С другой стороны, реактивация теломеразы не должна давать каких-либо селективных преимуществ клеткам с нормальной регуляцией пролиферации. В противоположность опытам в культуре клеток, где клетки с теломеразной активностью имеют селективное преимущество, в организме человека имеется строгий контроль клеточной пролиферации. Кроме того, средняя длина теломер в клетках человеческого организма достаточна для ограниченной пролиферации и поэтому клетки не нуждаются в теломеразной активности на ранних стадиях канцерогенеза. Поэтому, начальная пролиферация предраковых клеток ведет к укорачиванию теломер.
Данные о том, что теломеры в опухолевых клетках человека короче, чем теломеры в окружающих опухоль нормальных тканях (Hastie et al., 1990; Counter et al., 1992; Smith and Yeh, 1992; Shay and Wright, 1996) увеличивает вероятность того, что большинство опухолевых клеток человека изначально начинают пролиферацию из-за изменений в регуляции роста, но не из-за реактивации теломеразы. Их теломеры укорачиваются и индуцируют старение. После этого клетки преодолевают старение и продолжают пролиферировать без реактивации теломеразы. И только после этого, благодаря высокой генетической нестабильности в течение кризиса, происходит реактивация теломеразы. При таком, с нашей точки зрения наиболее частом сценарии, искусственное укорачивание теломер опухолевых клеток, которое может происходить при подавлении теломеразы в терапевтических целях лечения рака, будет возвращать клетки на стадию канцерогенеза, предшествующую реактивации теломеразы. Регуляция роста в таких клетках нарушена, что необходимо для начала опухолевого роста, они имеют разрушенные или инактивированные механизмы старения и способны пролиферировать с очень короткими теломерами, соответствующими теломерам уже неделящихся нормальных клеток. Об особенностях теломеризованных клеток см. раздел "Введение гена каталитического компонента теломеразы".
Полагают, что механизмы, ограничивающие рост клеток во время кризиса (М2) (Wright and Shay, 1992a,b), когда происходит чрезвычайное (полное) укорачивание теломер отличаются от механизмов остановки пролиферации во время старения, когда длина теломер составляет несколько тысяч оснований (Wright et al., 1989). Теломерная гипотеза пролиферативного старения предполагает существование обратной связи между длиной теломер и остановкой пролиферации (Shay et al., 1991,а). Эти механизмы обратной связи останавливают пролиферацию задолго до полного исчезновения теломер (Counter et al., 1992; Shay et al.,1993a,b,c). Ослабление или отмена механизмов обратной связи способно увеличить пролиферативный потенциал (Нага et al., 1991; Wright and Shay, 1992a,b).
Наиболее вероятно, что в курсе укорачивания теломер при подавлении теломеразы в опухолевых клетках человека происходят события, напоминающие кризис. Для объяснения длительного равновесия между клеточной гибелью и размножением клеток во время кризиса (Wright and Shay, 1992b; Shay et al., 1993a) мы предложили следующую гипотезу. Кризис начинается, когда отдельные, самые короткие теломеры полностью исчезают. Дальнейшее укорачивание прямо или косвенно ведет к потерям генетического материала, несовместимым с жизнью клетки. Вследствие очень широкого распределения теломер по длине (Lansdorp et al., 1996), в любой момент в клетке существует самая короткая теломера. Эта самая короткая теломера может определять судьбу клетки (Nelson and Kastan, 1994; Vaziri et al., 1997). Процесс репликации такой теломеры приводит к образованию полной копии и укороченной (Рис. 44). Клетка с укороченной копией умирает, в то время как другая клетка продолжает размножаться. Процесс повторяется до тех пор, пока следующая теломера станет чрезвычайно короткой. Тогда равновесие между гибелью и размножением нарушается: только одна из четырех клеток продолжает размножение. Только если клетка приобретет механизмы удлинения теломер, она сможет выйти из кризиса.
Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека
Клоны, перешагнувшие рубеж 30 УП всегда в наших опытах проходили более 50 УП без изменений в скорости роста и морфологии. На начальных этапах исследования пять клонов культивировали до 100 УП и далее, в дальнейшем, клоны замораживали на стадиях 60-70 УП. Таким образом, было установлено, что пролиферативный потенциал спонтанных трансформантов меняется дискретно: либо он меньше 30 УП, либо - более 100 УП (видимо бесконечен).
Рост клеток клонов с ограниченным пролиферативным потенциалом, поначалу бурный, за несколько УП до остановки размножения клеток плавно замедлялся, клетки увеличивались, появлялись очень крупные, распластанные клетки. Вообще, поведение клеток и их морфология были сходны со стареющими. Образовавшиеся неделящиеся клетки длительное время переживали в неделящемся состоянии, проходя при этом весь цикл морфологических изменений, характерных для старения в культуре. Принимая во внимание то, что спонтанные трансформанты эмбриональных фибробластов мышей СВА возникают, в том числе, и из длительно (два - три месяца) неделившихся клеток в составе стареющих культур, следует полагать, что старение спонтанных трансформантов с ограниченным пролиферативным потенциалом происходит повторно.
Измерения теломеразной активности (ТАК) в клонах с ограниченным пролиферативным потенциалом, как и ожидалось, показали отсутствие ТАК. Средние значения ТАК были получены в клонах, изначально росших в присутствии азидотимидина или карбовира, после отмены ингибиторов обратных транскриптаз. Эти клетки начинали стареть (см. выше), после этого ингибиторы были отменены, в клетках появилась ТАК и восстановилась пролиферативная активность.
Один из полученных нами клонов обладал очень низкой ТАК в присутствии азидотимидина, но при этом не подвергался старению и устойчиво рос в присутствии азидотимидина, по крайней мере, в течение 70 УП. Такое аномальное поведение клеток можно объяснить появлением устойчивости к азидотимидину, не связанной с ТАК. Возможно и иное объяснение: клетки этого клона могут обладать, описанным в литературе альтернативным способом удлинения теломер.
Таким образом, мы показали, что существуют различные пути спонтанной трансформации: с активацией теломеразы и без нее. В условиях отсутствия ингибиторов обратных транскриптаз для клеток мыши в культуре характерен путь, при котором первым этапом является реактивация теломеразы. В присутствии ингибиторов существенное значение приобретает более редкий путь, когда первым этапом не является реактивация теломеразы.
Теломерная гипотеза пролиферативного старения клеток предусматривает наличие механизмов связи между длиной теломер и остановкой пролиферации (Shay et al., 1991). Эти механизмы останавливают пролиферацию до того, как происходит полное физическое исчерпание теломер (Counter et al., 1992) и их ослабление может увеличить пролиферативный потенциал клеток (Нага et al., 1991). Возможно, что в случае бестеломеразных клонов внутриклеточный механизм, "измеряющий" теломеры, изменил шкалу: при этом короткие теломеры, соответствующие старению, стали восприниматься, как достаточно длинные.
Объяснением исчезновения ТАК из целой клеточной популяции может быть то, что клетки без ТАК в присутствии ингибиторов обратных транскриптаз, пока их пролиферация не ограничивается укорочением теломер, имеют селективное преимущество в росте.
Из изложенных данных, наиболее существенными нам представляется то, что в ряде случаев, при образовании спонтанных трансформантов, происходит увеличение пролиферативного потенциала клеток на величину до 30 УП, а также то, что при спонтанной трансформации наблюдаются случаи повторного старения клеток. Эти наблюдения натолкнули нас на гипотезу о петлевой организации теломер (Егоров и др., 1997а).
Опыты со спонтанными трансформантами поставили ряд вопросов. Попытки ответа на них привели к созданию гипотезы о петлевой организации теломер. Основу гипотезы составляет ответ на вопрос, каким образом укорачивание теломер вызывает пролиферативное старение? Несмотря на бурное развитие в последнее время науки о теломерах и теломеразе, исследователям не удается объяснить механизм связи между укорачиванием теломер и остановкой пролиферации клеток.
Если кратко изложить наиболее распространенное понимание теломерной теории, то оно заключается в следующем. В клетках, на концах хромосом имеются теломеры, которые укорачиваются при размножении клеток из-за концевой недорепликации ДНК. Когда теломеры становятся совсем короткими, клетка не может размножаться далее и наступает пролиферативное старение. Некоторые клетки имеют специальный фермент -теломеразу, которая наращивает теломеры, спасая их от недорепликации. Во первых, длина теломер, при котором наступает пролиферативное старение много больше нуля. А это значит, что механизм пролиферативного старения не работает по принципу ДА-НЕТ.
Во вторых. Ученые при помощи гибридизации измеряют длину теломер, выраженную в нуклеотидах. Однако, каким образом клетка измеряет свои теломеры? Ясно, что клетка не проводит внутри себя гибридизацию по Саузерну или in situ. Скорее всего, клетка изучает (контролирует) трехмерную структуру (теломеру), образованную теломерной ДНК и множеством молекул, с ней связанных. В 199? году нами была предложена гипотеза петлевого строения ДНК (Егоров и др., 1997а), однако тогда еще не были сделаны опыты на бестеломеразных мышах, и не была опубликована работа (Griffits et al., 1999) об обнаружении теломерных петель. Эти работы позволили нам значительно упростить нашу модель.
Поскольку ДНК из внутренних районов хромосом образует петли, и эти петли могут быть использованы клеткой для быстрого обнаружения разрывов ДНК, мы предположили, что теломерная ДНК также может образовывать петли. Разница состоит в размерах. Если внутренние петли имеют длину в сотни тысяч нуклеотидов, то теломерные петли должны иметь минимальную длину примерно в несколько тысяч нуклеотидов (рис. 50).
