Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование клеточных и молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий – одна из приоритетных задач современной биологии и медицины. Тесная интеграция тканей и сложная система межклеточной коммуникации, включающая механизмы внутриклеточной передачи регуляторных сигналов, лежат в основе развития многоклеточного организма и поддержания его нормального функционирования.
Хотя в настоящее время основные механизмы внутриклеточной передачи сигналов с участием цитоплазматических и ядерных рецепторов гормонов, рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками и регулируемых ионных каналов изучены, недостаточно исследованной и наиболее сложной частью проблемы межклеточной коммуникации является разъяснение механизмов согласованного взаимодействия различных лигандов, позволяющих клеткам адекватно реагировать на постоянно изменяющиеся условия среды внутри организма и вне его [Пальцев М.А., 1995]. Особую актуальность исследование механизмов межклеточных контактов приобретает в костном мозге, где коммуникация и интеграция важны для обеспечения жизнеспособности, роста и дифференцировки гетерогенной популяции клеток, а также в силу влияния большого количества регуляторных молекул гемопоэзиндуцирующего микроокружения, обеспечивающих регуляцию гемопоэза в физиологических и патологических условиях [Дыгай А.М., 1989; Гольдберг Е.Д., 2000].
Большинство имеющихся в литературе работ в области гематологии посвящены изучению роли цитокинов, которые рассматриваются как важнейшие специализированные средства межклеточного сообщения, позволяющие клеткам обмениваться информацией [Dinarello С.А., 1991; Kishimoto T., 1994; Heldin C.-H., 2001; Zhou X.Y., 2005]. Вместе с тем, в последние годы все больший интерес представляет изучение влияния клеточных метаболитов как лигандов клеточных рецепторов на пролиферативные, дифференцировочные процессы, а также модуляции ими механизмов естественной (запрограммированной) клеточной гибели - апоптоза и патологической клеточной смерти - некроза. Однако в литературе лишь в единичных работах рассматриваются клеточные и субклеточные механизмы такого рода регуляции [Dubyak G.R., 1993; Di Virgilio F., 2001; Kim M., 2001; Kawamura H., 2005].
Одним из приоритетных направлений современной патофизиологии является исследование механизмов межклеточных взаимодействий в условиях токсического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда, способных индуцировать окислительный стресс и нарушать привычные клеточные кооперации и регуляторное влияние естественных метаболитов на клеточные функции, необходимые для нормального функционирования органов и тканей. При этом наименее изученной остается проблема изменения чувствительности клеток костного мозга к действию эндогенных лигандов в условиях окислительного стресса. Это обстоятельство не позволяет разработать новые высокоэффективные лекарственные препараты для восстановления структурно-функционального гомеостаза клетки. Вместе с тем, понимание особенностей сигнальной трансдукции в клетках, находящихся в состоянии окислительного стресса, может стать основой для разработки принципиально новых технологий фармакологической коррекции патологических процессов, ассоциированных с увеличением прооксидантной активности.
Известно, что одним из базовых механизмов цитотоксичности ряда ксенобиотиков является индукция ими окислительного стресса [Halliwell B., 2003; Toler S.M., 2004; Wells P.G., 2005]. Генерация свободных радикалов, сопровождающая физиологические и патологические процессы, становится причиной альтерации биомакромолекул клеток – перекисного окисления липидов, свободнорадикального повреждения нуклеиновых кислот, окисления белковых молекул и полисахаридов, а также изменения интегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов. До сих пор проявления миелотоксичности ксенобиотиков – индукторов окислительного стресса рассматривались преимущественно в качестве обратимых или необратимых повреждений структур клеток, приводящих к дезорганизации клеточного метаболизма и нарушению функционирования органа или системы. Однако в литературе накапливаются данные о роли индукции дизрегуляторных процессов в механизме клеточной гибели [Barisic K., 2003; Parrish A.B., 2006].
В этой связи патогенез многих патологических процессов и гематологических заболеваний может быть раскрыт с принципиально новых позиций – в аспекте межклеточных взаимодействий. Отсутствие на сегодняшний день сведений о веществах - протекторах угнетающего эффекта индукторов окислительного стресса на гемопоэз и неполное раскрытие механизмов альтерации клеточных структур - компонентов сигнальных систем делает актуальным разработку патогенетически обоснованной эффективной стратегии антитоксической защиты клетки путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации.
Цель работы. Изучить патогенетическую роль нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+, пуринергической регуляции, коннексин-опосредованной коммуникации в клетках костного мозга в реализации цитотоксического потенциала ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина).
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и метаболизм НАД+ в клетках костного мозга.
-
Исследовать влияние ксенобиотика на уровень АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве. Оценить роль различных подтипов пуринергических рецепторов в реализации апоптогенной активности АТФ и модуляции этих процессов доксорубицином в клетках костного мозга мышей in vitro и in vivo.
-
Исследовать развитие запрограммированной и патологической клеточной гибели в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина in vivo и in vitro. Изучить вклад повреждения мембран клеток костного мозга при действии АТФ и НАД+ на фоне применения миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vitro и in vivo в реализацию механизмов запрограммированной клеточной смерти.
-
Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на АТФ- и НАД-зависимые процессы регуляции пролиферации и апоптоза клеток костного мозга. Оценить угнетающий эффект доксорубицина на различные ростки кроветворения.
-
Оценить уровень экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергического рецептора P2X7, CD38/НАД+-гликогидролазы, коннексина 43) в клетках костного мозга мышей в физиологических условиях, а также при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.
-
Изучить особенности регуляции функциональной активности клеток костного мозга эндогенными регуляторами гемопоэза АТФ и НАД+ в норме и в условиях окислительного стресса.
-
Установить вклад НАД-зависимых механизмов в миелотоксический эффект ксенобиотика и возможность его патогенетической коррекции субстратными ингибиторами ферментов трансформации никотинамидадениндинуклеотида.
Научная новизна.
Установлено, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизмах межклеточной коммуникации и интеграции.
Впервые установлена роль нарушения P2X7-ассоциированных сигнальных механизмов в реализации действия миелотоксических ксенобиотиков и изучены некоторые механизмы пуринергической дизрегуляции.
Доказано, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД+-гликогидролазы/CD38. Изучена роль НАД+-гликогидролазы/CD38 в регуляции метаболизма НАД+ в гемопоэтических клетках в условиях окислительного стресса.
Впервые обнаружено, что нарушение экспрессии и функциональной активности коннексина 43 является одним из механизмов цитотоксического эффекта доксорубицина.
Исследованы механизмы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге аденозинтрифосфатом и никотинамидадениндинуклеотидом. Изучены закономерности изменения степени чувствительности клеток костного мозга к присутствующим во внеклеточном пространстве естественным метаболитам при действии ксенобиотика антрациклинового ряда.
Приоритетное значение имеют данные о том, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД+ при действии ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина) модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул.
Выявлено, что поддержание гомеостаза НАД+ в клетках костного мозга является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Экспериментально доказано, что применение субстратных ингибиторов НАД-конвертирующих ферментов позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД+ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Данная работа является фрагментом тем «Биохимия и патобиохимия апоптоза», «Исследование гомеостаза при экстремальных воздействиях: механизм, пути коррекции при нарушениях» (номер государственной регистрации 01970007696) и «Структурно-функциональные основы гомеостаза животных при экстремальных состояниях», выполняющихся на базе кафедры биохимии с курсом медицинской химии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» с 2002 г., Международного научного центра исследований экстремального состояния организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН с 1995 г. и на кафедре анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» с 1998 г., соответственно.
Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы новые клеточные механизмы миелотоксического действия ксенобиотика антрациклинового ряда с позиции нарушения регуляторной функции АТФ и НАД+ и межклеточной коммуникации в гемопоэтических клетках, следствием чего является изменение чувствительности клеток к действию эндогенных лигандов.
Патогенетически обоснован способ коррекции миелотоксического действия доксорубицина никотинамидом – субстратным ингибитором ферментов каталитической деградации НАД+, обеспечивающий нормализацию клеточного пула НАД+ и связанное с этим восстановление процессов пролиферации и естественной гибели гемопоэтических клеток, что может являться основой для разработки новой терапевтической стратегии в лечении нарушений гемопоэза.
Постулируется нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции, что подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, представляющей собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.
Основной научно-технической задачей, решенной в ходе выполнения работы, явилось формирование современных представлений о роли дизрегуляции межклеточных взаимодействий и возможности ее коррекции при цитотоксическом действии ксенобиотика антрациклинового ряда.
В рамках работы оформлена заявка на патент «Способ диагностики системного воспалительного ответа организма при критических состояниях» (2007 г.) (Регистрационный № 2007109001).
Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу ООО «Лаборатория иммунохимических методов исследования» (г. Красноярск), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН и учебный процесс кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», кафедры биохимии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фундаментальной и клинической биохимии с курсом лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармацевтической технологии и последипломного образования ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 1996 г.; VIII Всероссийском симпозиуме (с международным участием) «Гомеостаз и окружающая среда», Красноярск, 1997 г.; 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997 г.; научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Технологии неистощительного землепользования», Красноярск, 1997 г.; IX Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Канадзава (Япония), 2001 г.; городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории СГМУ «Современные аспекты биологии и медицины», Томск, 2002 г.; XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма», Красноярск, 2003 г.; межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2003 г.; X Российско-Японском международном медицинском симпозиуме «Якутия – 2003», Якутск, 2003 г.; XI Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Ниигата (Япония), 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004 г.; X Юбилейной межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2004 г.; Всероссийской конференции молодых ученых, Красноярск, 2004 г.; XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005 г.; V Сибирском физиологическом съезде, Томск, 2005 г.; XII Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Красноярск, 2005 г; научных семинарах Межкафедральной биохимической научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2004-2007 гг.); заседаниях кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (1998-2007 гг.).
Положения, выносимые на защиту:
-
Одним из значимых механизмов миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда является индукция дизрегуляторных процессов в системе межклеточной коммуникации и интеграции, проявляющаяся изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергических рецепторов P2X7, НАД+-гликогидролазы/CD38 и коннексина 43) и сопровождающаяся нарушением мембран-цитоскелетных взаимодействий, пролиферативного и дифференцировочного статуса клеток костного мозга и их чувствительности к действию апоптогенных стимулов и эндогенных регуляторов гемопоэза.
-
Ксенобиотики антрациклинового ряда регулируют механизмы пролиферации и запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения за счет нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+ и пуринергической регуляции гемопоэза.
-
АТФ и НАД+, присутствуя во внеклеточном пространстве при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина, модулируют процессы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток костного мозга.
-
Патогенетическая коррекция миелотоксического эффекта ксенобиотиков антрациклинового ряда эффективно достигается применением субстратных ингибиторов ферментов каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 12 – в центральной печати (в реферируемых ВАК журналах), 2 – в международной печати.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, иллюстрирована 13 таблицами и 39 рисунками. Библиографический указатель включает 462 литературных источника, в том числе 86 отечественных и 376 иностранных авторов.
