Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Особенности иммунного реагирования при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза 13
1.1 «Иммунная привилегия» органа зрения 13
1.2 Значение воспалительных и дистрофических заболеваний глаз в патологии человека 17
1.3 Особенности иммунного реагирования при воспалительных и дистрофических заболеваниях глаз 28
1.4 Цитокиновый профиль при воспалительных и дистрофиче ских процессах в оболочках глаза 39
1.5 Взаимодействие иммунной и эндокринной систем 54
Собственные исследования
Глава 2 Материал и методы исследования 63
2.1 Материал исследования 63
2.2 Методы лабораторной иммунодиагностики 69
2.3 Методы математико-статистической обработки результатов 71
Глава 3 Роль цитокинов в развитии воспалительных процессов при вирусном и хламидийном поражении конъюнктивы и роговицы глаза 73
3.1 Профиль цитокинов при воспалении роговицы, обусловлен ном вирусом простого герпеса 73
3.2 Цитокины при аденовирусной инфекции конъюнктивы и роговицы 102
3.3 Местный и системный цитокиновый ответ при хламидийной инфекции конъюнктивы 108
Глава 4 Роль цитокинов, простагландина Ег и иммуно-эндокринные взаимодействия при воспалении сосудистой оболочки глаза 119
4.1 Значение цитокинов и простагландина Ег в развитии воспалительных процессов в сосудистой оболочке глаза 119
4.2 Взаимосвязь иммунной и эндокринной систем при развитии воспаления в сосудистой оболочке глаза 141
Глава 5 Профиль цитокинов при дистрофических процессах в роговице и сетчатке 156
5.1 Значение цитокинов при вторичной эндотелиально эпителиальной дистрофии роговицы 158
5.2 Роль цитокинов при дистрофических процессах в сетчатке, вызвавших развитие регматогенной отслойки 164
Глава 6 Иммунологические критерии прогноза течения воспалительных процессов в оболочках глаза 177
Заключение 192
Выводы 209
Практические рекомендации 212
Список литературы
- Цитокиновый профиль при воспалительных и дистрофиче ских процессах в оболочках глаза
- Методы лабораторной иммунодиагностики
- Цитокины при аденовирусной инфекции конъюнктивы и роговицы
- Роль цитокинов при дистрофических процессах в сетчатке, вызвавших развитие регматогенной отслойки
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы вопрос иммунорегуляции воспалительных и дистрофических процессов остается важной медико-биологической проблемой. Его изучение при развитии данных патологических процессов в оболочках глаза связано с широким распространением заболеваний органа зрения, нередко с тяжелым течением и неблагоприятными исходами, вплоть до слабовидения и слепоты. В основе патогенеза значительной части воспалительных и дистрофических заболеваний глаз лежат нарушения иммунологического реагирования [Теплинская Л.Е., 2007]. Известно об "иммунной привилегии" органа зрения - ограничении развития иммуногенных реакций в глазу, обусловленном наличием гематоофтальмического барьера, отсутствием во внутренних отделах глаза лимфатической дренажной системы, незначительной экспрессией молекул МНС классов I и II стромальными клетками глаза [McKenna К.С., Kapp J.A., 2004; Ashour H.M., Niederkorn J.Y., 2006; Ferguson T.A., Griffith T.S., 2007]. Развитие иммунопатологии и иммунное повреждение структур глаза сопряжено со срывом защитного механизма, когда на поверхности интраокулярных клеток нарушается экспрессия молекул, влияющих на клетки иммунной системы, а в жидких внутриглазных средах - синтез ряда факторов, подавляющих Т-клеточную пролиферацию и секрецию провоспалительных цитокинов [Niederkorn J.Y., 2006; 2008].
Существенные нарушения в системе цитокинов при воспалительных заболеваниях глаз инфекционной и аутоиммунной этиологии обуславливают хроническое и рецидивирующее течение, тяжесть исходов и недостаточную эффективность терапии [Марванова З.Р., 2004; Дроздова Е.А., 2007; Слепова О.С. и др., 1998, 2007; Fang I.M. et al, 2005; McInnis K.A. et al, 2007; Caspi R., 2008; Keadle T.L. et al, 2008; Sonoda K.H., 2008]. Сведения о значении цитокинов при хламидийном конъюнктивите [Abu el-Asrar A.M. et al, 2001] и аденовирусной инфекции конъюнктивы и роговицы [Harvey S.A. et al, 2005; Yang J.J. et al, 2007] в научной литературе единичны.
Дистрофические заболевания глаза, в т.ч. роговицы и сетчатки, обусловленные нарушениями трофики его тканей и характеризующиеся хроническим прогрессирующим течением без воспалительных явлений, также связаны с развитием иммунопатологического процесса [Сергиенко А.С. и др., 2004; Захарова Г.Ю. и др., 2005; Слепова О.С., 2006, 2007; Moromizato Y. et al, 2007; Chong D.Y. et al, 2008].
Однако в настоящее время нет полного представления о принципиальных особенностях местного и системного иммунного реагирования с участием цитокинов при воспалительных процессах в оболочках глаза, обусловленных вирусами и хламидиями, при увеитах, ассоциированных с вирусом герпеса и системными ревматическими заболеваниями а также при дистрофических процессах, следовательно, недостаточно обоснованы направления патогенетически ориентированной иммунокоррекции нарушений цитокинового статуса. Изложенное выше послужило основанием для изучения иммунобиологической роли цитокинов при указанных выше патологических процессах в оболочках глаза.
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что отсутствие иммунного конфликта при нормальном функционировании организма является результатом сбалансированного взаимодействия иммунной и эндокринной систем [Абрамов В.В. и др., 1996, 2000; Воеводин Д.Н., Розанова Г.Н., 2006; Сычугов Г.В., 2006; Гейн С.В., 2007; Gerlo S. et al, 2006; Lau J. et al, 2006; O’Connor J.C. et al, 2008], нарушения которого могут играть важную роль в развитии патологических процессов. Известно о гормональных отклонениях при некоторых заболеваниях глаз. Так, в эксперименте и клинике выявлена взаимосвязь тяжести клинического течения увеита с содержанием гормонов [Комаров О.С., 2006; Proenca Н. et al, 2008], герпетического кератита – с уровнем тестостерона [Зайнутдинова Г.Х., 2002]. Однако сведения о взаимодействии иммунной и эндокринной систем при воспалительных процессах в оболочках глаза единичны, носят разрозненный характер [Chan C.C. et al, 2004; Cawood T.J. et al, 2006]. Поэтому приходится констатировать, что механизмы, обеспечивающие иммунологическую регуляцию воспалительных процессов в оболочках глаза, а также взаимодействие иммунной и эндокринной систем, во многом остаются невыясненными.
Выявление нарушений функционирования цитокиновой сети при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза имеет важное клиническое значение для иммунодиагностики, прогноза и применения патогенетически обоснованной иммунокорригирующей терапии. Изучение взаимодействия иммунной и эндокринной систем имеет также и теоретическое значение для понимания иммунологических закономерностей, механизмов сохранения гомеостаза при развитии воспалительных процессов в оболочках глаза. Изложенное определило цель и задачи данной работы.
Цель исследования
Определение роли цитокинов в развитии воспалительных и дистрофических процессов в оболочках глаза, оценка межсистемного иммуно-эндокринного взаимодействия при воспалении сосудистой оболочки глаза, обоснование на основе полученных данных иммунологических критериев прогнозирования течения воспаления в роговице и увеальном тракте.
Задачи исследования
-
Оценить местные и системные уровни цитокинов (IL-1b, IL-2, TNF-a, IL-6, IL-4, IFN-a, IFN-g) и направленность Th1/Th2-поляризации иммунного ответа при воспалительных процессах конъюнктивы и роговицы, обусловленных вирусом простого герпеса, аденовирусами и Chlamydia trachomatis.
-
Выявить общие закономерности и особенности изменений локального и системного содержания цитокинов в зависимости от локализации герпес-индуцированого воспалительного процесса в оболочках глаза.
-
Определить роль цитокинов и простагландина Е2 в развитии воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза.
-
Изучить содержание гормонов гипофиза (тиреотропного гормона, пролактина), щитовидной железы (трийодтиронина, тироксина, тиреоглобулина), стероидных гормонов (кортизола, тестостерона), антител к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе при воспалении увеального тракта и оценить межсистемные иммуно-эндокринные взаимодействия.
-
Дать оценку системному цитокиновому реагированию при дистрофических процессах роговицы.
-
Изучить местные и системные уровни цитокинов при дистрофических процессах в сетчатке, приведших к ее отслойке, в зависимости от их характера, распространенности и срока давности развития отслойки.
-
Обосновать иммунологические критерии прогнозирования течения воспалительных процессов в роговице, индуцированных вирусом простого герпеса, и в сосудистой оболочке глаза при системных ревматических заболеваниях.
Научная новизна
Впервые показано, что для воспаления конъюнктивы, роговицы и сосудистой оболочки глаза характерно сходство в профиле цитокинов (IL-1b, TNF-a, IL-6, IL-2, IFN-a, IFN-g) и направленности иммунного ответа, но имеется различие в степени выраженности местного и системного реагирования.
Установлено, что при герпес-индуцированном воспалительном процессе в роговице большая степень выраженности местного и системного иммунного реагирования коррелирует с рецидивом заболевания и глубокой локализацией воспаления.
Впервые при патологии глаз установлено, что закономерности нарушения системы цитокинов при персистирующих вирусной (герпетической) и хламидийной (Chlamydia trachomatis) инфекциях имеют сходство в спектре цитокинов и направленности иммунного ответа, характер которых определяется активностью инфекционного процесса.
Показана сопряженность изменений содержания гормонов (кортизола, тестостерона - у мужчин, тиреоглобулина и антител к нему, свободного трийодтиронина и антител к тиреопероксидазе) в сыворотке крови, местного и системного уровней основных цитокинов и васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) с этиологией воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза.
Впервые при воспалении увеального тракта установлена зависимость содержания простагландина Е2 в сыворотке крови и слезной жидкости от пола пациентов и развития рецидива заболевания.
Впервые предложено рассматривать воспаление сосудистой оболочки глаза как процесс, связанный с десинхронизацией функций иммуно-эндокринной регуляции, на основе выявления взаимосвязей между показателями иммунной и эндокринной систем методом корреляционного анализа.
Установлено, что дистрофические процессы в сетчатке при миопии средней и высокой степени и периферической витреохориоретинальной дистрофии, приведшие к ее отслойке, сопровождаются изменениями содержания цитокинов на местном и системном уровнях, характер которых обусловлен типом офтальмопатологии, приведшей к отслойке сетчатки, ее величиной и сроком давности развития.
Определены иммунологические критерии неблагоприятного течения воспалительного процесса в роговице, обусловленного вирусом простого герпеса (высокая концентрация TNF-a в слезной жидкости и дефицит местного и системного содержания IL-4), и сосудистой оболочке глаза при системных ревматических заболеваниях (содержание VEGF в сыворотке крови более 750 пкг/мл). Эти показатели могут служить основой прогнозирования течения воспаления увеального тракта.
Научно-практическая значимость работы
Установлены нарушения цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови и тканей глаза у пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в оболочках глаза. Определена важная роль в этом процессе нарушения цитокиновой сети, регулирующей баланс Th1/Th2-пути антигенспецифического иммунного ответа. Выявлен дисбаланс уровней цитокинов, простагландина Е2 и гормонов в сыворотке крови, сопряженных с этиологией заболевания, при воспалении увеального тракта. Методом корреляционного анализа установлена взаимосвязь функций иммунной и эндокринной систем при воспалительных процессах сосудистой оболочки глаза. Выявлены иммунологические факторы, обуславливающие риск прогрессирования и хронизации воспаления при его развитии в роговице и сосудистой оболочке глаза. Определены сходство и различия в нарушениях системы цитокинов при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза, обусловленные их анатомо-функциональными отличиями.
Полученные результаты представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения воспалительных и дистрофических заболеваний глаз, а также к коррекции дисбаланса локального и системного содержания цитокинов, своевременной профилактики развития хронических форм заболеваний, а также осложнений, возникающих при длительном воспалении.
Внедрение результатов исследования в практику
Материалы комплексных исследований, включающие показатели субпопуляционного состава лимфоцитов крови, цитокинового и иммунного статусов, используются в работе консультативной поликлиники, клинических отделений Уфимского НИИ глазных болезней и офтальмологической службы поликлиники № 52 г. Уфы. Основные положения и выводы диссертационной работы включены в программу обучения студентов, интернов, аспирантов и используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации по инфекционным и воспалительным заболеваниям глаз для врачей-офтальмологов РФ и РБ на базе Уфимского НИИ глазных болезней.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Для воспалительных и дистрофических процессов в оболочках глаза характерны изменения системы цитокинов на местном и системном уровнях, регулирующих тип, длительность и степень выраженности иммунного ответа.
2. Активация местного и системного иммунного ответа при реактивации персистирующих герпетической и хламидийной инфекциях выражается значимым увеличением концентрации IL-1b, IL-2, TNF-a, IL-6, IFN-g в сыворотке крови и слезной жидкости.
3. Цитокиновый профиль при герпес-индуцированных воспалительных процессах характеризуется ростом местного и системного уровней цитокинов (IL-1b, TNF-a, IL-6, IL-2, IFN-a и IFN-g) с более значимым повышением локального и системного содержания IFN-a и IFN-g при воспалении роговицы и TNF-a, IL-6, IL-2 - сосудистой оболочки глаза.
4. Развитие воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза характеризуется изменениями местного и системного уровней IL-1b, IL-2, TNF-a, IL-6, IFN-g, связанными с этиологией заболевания. Дисбаланс содержания простагландина Е2 в сыворотке крови и слезной жидкости сопряжен с полом пациентов и развитием рецидива заболевания.
5. Воспаление увеального тракта сопровождается транзиторным изменением содержания гормонов (кортизола, тестостерона, тиреотропного гормона, общего трийодтиронина, свободного тироксина) и антител к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе в сыворотке крови, а также наличием достоверных корреляционных связей уровней цитокинов и гормонов, опосредующих межсистемные иммуно-эндокринные взаимодействия.
6. Развитие дистрофических процессов в роговице при ее эндотелиально-эпителиальной дистрофии сопровождается достоверным увеличением содержания IL-4 в сыворотке крови и смещением баланса в сторону Th2-типа иммунного ответа.
7. Дистрофические процессы сетчатки, приведшие к ее отслойке, сопровождаются изменениями содержания цитокинов (IL-1b, IL-2, TNF-a, IL-6, IL-4) на местном и системном уровнях, характер которых обусловлен типом офтальмопатологии, приведшей к развитию отслойки сетчатки, ее величиной и сроком давности развития.
8. Риск развития неблагоприятного течения воспалительного процесса в роговице, вызванного вирусом простого герпеса, сопряжен с повышением уровня TNF-a в слезной жидкости и недостаточной местной и системной мобилизацией IL-4; воспаление сосудистой оболочки глаза, ассоциированное с системными ревматическими заболеваниями, совпадает с дисбалансом содержания TNF-a в виде повышения на местном уровне и недостатком на системном, и высоким (более 750 пкг/мл) содержанием VEGF в сыворотке крови.
Апробация работы
Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Ерошевские чтения» (Самара, 2002), конференции, посвященной 100-летию глазной клиники «Офтальмология в начале XXI века» (Саратов, 2002), Всероссийской научной конференции «Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической меди-цине» (Санкт-Петербург, 2004), научно-практических конференциях «Воспалительные заболевания органа зрения» (Челябинск, 2004), «Достижения в офтальмологии» (Москва, 2008), научно-практической конференции с международным участием «Современные технологии лечения заболеваний переднего и заднего сегментов глаза» (Уфа, 2008), научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии» (Уфа, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 53 работы, в т.ч. 2 монографии: «Хламидийный конъюнктивит: клиника, диагностика, лечение» (Уфа, 2003), «Цитокины в офтальмологии» (Уфа, 2008), 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 патентов РФ, 37 статей в материалах конференций и съездов.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 241 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель включает 287 источников (101 - отечественных и 186 – иностранных авторов).
Диссертационная работа выполнена по основному плану НИР ГУ «Уфимский НИИ глазных болезней» АН Республики Башкортостан.
Цитокиновый профиль при воспалительных и дистрофиче ских процессах в оболочках глаза
Серьезной медико-социальной проблемой практической офтальмологии остаются воспалительные заболевания глаз, наблюдаемые почти у половины амбулаторных больных и нередко приводящие к слабовидению и слепоте. В Российской Федерации- число больных, обращающихся к офтальмологу с воспалительными заболеваниями глаз, достигает 16 млн в год [Бойко Э.В. и др., 2007]. Среди воспалительной патологии-широко распространены инфекционные заболевания глаз, в т.ч. герпетической, аденовирусной и хла-мидийной этиологии, отличающиеся хроническим течением, тяжестью исходов и недостаточной эффективностью терапии. Как правило, у пациентов с офтальмоинфекциями выявляются те или иные нарушения иммунной системы. Воспалительные заболевания увеального тракта, в основе которых лежат иммунопатологические реакции, также достаточно часто встречаются, являются тяжелыми по клиническому течению и исходам.
Не менее важной проблемой офтальмологии остаются дистрофические заболевания глаз, в т.ч. дистрофические изменения сетчатки, приводящие к ее отслойке, и эндотелиально-эпителиальная дистрофия роговицы. Эти заболевания глаз можно излечить только хирургическим путем, а результат опе ративного лечения во многом зависит от иммунного статуса пациентов. Поэтому правильная диагностика, прогнозирование клинического течения и обоснование подходов к патогенетически ориентированной терапии воспалительных и дистрофических заболеваний глаз могут быть успешными только с учетом иммунного, в т.ч. цитокинового, статуса пациентов, гормональных отклонений и взаимодействия иммунной и гормональной систем.
Большая часть воспалительных и дистрофических заболеваний связаны с роговицей, т.к. она подвергается воздействию всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая инфекции или травмы, приводящие к срыву защитного механизма и локальным, а в ряде случаев и системным, иммунологическим сдвигам.
Особенностями строения, анастомозирования и иннервации краевой петлистой сети сосудов вокруг роговицы объясняется ее быстрая ответная реакция на развитие патологического процесса в склере, конъюнктиве, радужке и цилиарном теле. Роговица легко вовлекается в патологический процесс и медленно выходит из него, так как она не имеет сосудов, обеспечивающих системный иммунный ответ. Этим, вероятно, объясняются особенности течения воспалительных и дистрофических процессов в роговице. Все обменные процессы в роговице замедлены. Они осуществляются за счет влаги передней камеры глаза, слезной жидкости и сосудов перикорнеальной петлистой сети, расположенной вокруг роговицы.
Отсутствие сосудов в роговице восполняется обильной иннервацией, которая представлена трофическими, чувствительными и вегетативными нервными волокнами, отходящими от тройничного и лицевого нервов.
Полученные в последние годы данные свидетельствуют, что роговица способна активно участвовать в иммунном ответе [Jemenis-Martines М.С. et al., 2006; Hamrah P., Dana M.R., 2007]. Так, в эпителии роговицы присутствует фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, а во влаге передней камеры - иммуносупрессивные вещества. Антигенпрезентирующие клетки находятся не только на периферии роговицы, но и в ее центре, включая эпители альные клетки Лангерганса и дендритные клетки стромы. Во время воспаления строма обеспечивает гетерогенную популяцию клеток: повышается экспрессия молекул МНС II класса и ко-стимулирующих Т-лимфоцитов молекул - В7 (CD80/CD86) и CD40, а в задних ее слоях присутствуют макрофаги [Jemenis-Martines М.С., et al., 2006].
Среди разнообразных видов патологии роговицы основное место занимают воспалительные заболевания (кератиты) и дистрофии.
Воспалительный процесс в роговице сопровождается наличием воспалительного инфильтрата в разных ее отделах, характеризующегося многообразной формой, величиной, различной глубиной залегания, цветом, чувствительностью, васкуляризацией. В связи с тем, что воспаление роговицы характеризуется потерей ее прозрачности, возникает различной степени снижение зрения. К инфильтратам роговицы из области лимба могут подходить или в них врастать поверхностные либо глубокие сосуды, что обусловливает возможность перехода местных иммунологических реакций в системные.
Наибольший интерес представляет изучение иммунного статуса пациентов при развитии воспаления роговицы, вызванного инфекционными агентами, в частности, вирусом простого герпеса (ВПГ), аденовирусом, хлами-диями, а также при дистрофических процессах - эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы.
Воспаление роговицы - кератиты, вызванные вирусом простого герпеса, занимают особое место среди воспалительных заболеваний переднего отдела глаза. Так, с ВПГ связано 66,8 % всей воспалительной патологии роговицы, 55 % язвенных поражений роговицы и более 60 % — роговичной слепоты [Майчук Ю.Ф., 2001]. Для них в 20%-75% случаев характерно рецидивирующее течение [Дегтяренко Т.В. и др., 2000; Майчук Ю.Ф., 2002].
Еще в 1967 г. Н. Kaufman и др. при офтальмогерпесе выявили наличие вируса в эпителии конъюнктивы и слезных протоков. Кроме конъюнктивы и роговицы вирус может поражать веки, увеальный тракт и радужку, зрительный нерв и вызывать постгерпетическую кератопатию, что у хронических больных может служить источником реинфекции роговицы. В России в течение каждого года насчитывается от 250 до 300 тысяч случаев первичного или рецидивирующего герпеса глаз, причем в последние годы отмечается учащение и утяжеление течения данного заболевания, нередко приводящего к сла-бовидению и слепоте [Мальханов В.Б., 1997; Марванова З.Р., 2004].
Доля герпеса роговицы среди всех ее воспалительных заболеваний у больных, зарегистрированных в Республике Башкортостан, составляет более 50 % [Мальханов В.Б., 1997]. При этом, у мужчин, в отличие от женщин, наблюдается больший удельный вес глубоких форм поражения, чаще имеет место затяжной характер течения и высокая резистентность герпетической инфекции глаз к противовирусной терапии [Зайнутдинова Г.Х., 2002].
Значение вируса герпеса обусловлено повсеместным его распространением, многообразием и тяжестью клинических проявлений заболевания, различными путями передачи возбудителя инфекции. Всего описано более 100 типов герпесвирусов человека, герпетический кератит вызывается ВПГ типа 1. Типичные вирусы герпеса состоят из трех основных компонентов: нуклеоида (двунитчатой ДНК), капсида и липопротеидной оболочки, содержащей комплекс gH-gL, являющийся необходимым элементом инфекцион-ности вируса и основным антигеном для иммунной системы хозяина [Баринт ский И.Ф. и др., 1986; Peng Т. et al., 1998].
Методы лабораторной иммунодиагностики
По степени распространенности отслойки пациенты были распределены на 2 группы: у 18 (54,5 %) пациентов была диагностирована локальная отслойка сетчатки, площадью 1-2 квадранта, и у 15 (45,5 %) - тотальная, площадью 3-4 квадранта. У 13 (39,4 %) пациентов срок развития отслойки не превышал 1 месяца, у 12 (36,4 %) - от 1 до 3 месяцев и у 8 (24,2 %) - со времени развития отслойки сетчатки прошло более 3 месяцев.
В таблице 3 представлены данные о количестве пациентов, в биологических жидкостях которых было проведено определение содержания цито-кинов.
Контрольную группу составили 37 практически здоровых лиц в возрасте от 20 до 69 лет, сопоставимых по полу с исследуемыми группами пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в оболочках глаза. Таблица 3 - Распределение пациентов в соответствии с использованными методами исследования
Методы исследования Группы обследованных здоровыедоноры пациенты с воспалительными процессами в конъюнктиве, роговице и увеальном тракте пациенты с дистрофическими процессами герпетическая инфекция аденовирусная инфекция хла-мидий-ная инфекция воспаление увеаль-ного тракта в роговице в сетчатке
Определение содержания гормонов (кортизола, тестостерона, пролактина, тиреотропно-го гормона, тироксина, трийод-тиронина, аутоантител к тирео-пероксидазе) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа 15 — — — 96 — 2.2 Методы лабораторной иммунодиагностики
У пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в тканях глаза проводили комплексное сравнительное исследование иммунофено-типического статуса лимфоцитов, выявление особенностей продукции моно-нуклеарными лейкоцитами крови иммунорегуляторных цитокинов, у боль ных с воспалением увеального тракта осуществляли определение гормонального статуса.
Взятие крови осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых больных в стерильных условиях в 2 пробирки по 5 мл в каждую. В 1-ой пробирке для последующего иммунофенотипирования лимфоцитов кровь стабилизировали гепарином (1 капля), во 2 — отделяли сыворотку. Слезную жидкость собирали из конъюнктивальной полости пациентов с помощью меланжера. Субретинальную жидкость получали во время оперативного вмешательства по поводу отслойки сетчатки.
Определение уровней цитокинов - IL-ip, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-ос, IF-ot, IF-y, VEGF - в сыворотке крови и слезной жидкости пациентов проводили методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Ргосоп», С-Петербург, Россия; «Век-тор-Бест», п. Кольцово, Россия; «CYTELISA», США). Учет результатов проводили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пг/мл.
Иммунофенотипирование лимфоцитов крови по CD-маркерам (CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD 19+, CD71+, CD95+, HLA-DR+) осуществляли методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства) [Имельбаева Э.А. и др., 2004]. Мононуклеары крови выделяли в градиенте плотности (1,077 г/мл) фиколл-верографина, соединяли с моноклональными антитела и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После промывки добавляли вторые (антимышиные) антитела, меченные ФИТЦ (FITC anti Mi), инкубировали в холодильнике при 4С 30 мин. После промывки ресуспендированые клетки наносили в лунки на стекло и инкубировать их на стекле 20 минут при комнатной температуре. Затем вносили в каждую лунку по 20 мкл 50%-го раствора глицерина на физ. р-ре. Учет реакции проводили с помощью люминесцентного микроскопа «Люмам» (фильтр 525 нм) объектив микроскопа х90 (оку ляр х 2- 2,5), отмечали желтовато-зеленое свечение. Результаты выражали в абсолютных и относительных значениях (подсчитывается общее число клеток в 3-4 полях зрения, но в сумме не менее 200 клеток, и из них же - число светящихся, затем вычисляется процент последних).
Серологические исследования по определению уровней иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, а также с помощью диагностических имму-ноферментных систем («Вектор-Бест», п. Кольцово, Новосибирская обл.).
Изучение содержания показателей функционального состояния эндокринной системы - кортизола, тестостерона, пролактина, тиреотропного гормона (ТТГ), тиреоглобулина (ТГ), тироксина (ТД трийодтиронина (Тз), ауто-антител к тиреоидной пероксидазе (анти-ТПО) - в сыворотке крови 96 пациентов с воспалением увеального тракта осуществляли методом иммунофер-ментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителем тест-систем («Вектор-Бест», п. Кольцово, Россия). Результаты учитывали с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan» при длине волны 450 нм и выражали в стандартных единицах, принятых для каждого гормона.
Определение уровней простагландина Ег в сыворотке крови и слезной жидкости пациентов проводили методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителем тест-систем («R@D», США). Учет результатов проводили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пг/мл.
Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием стандартных методов параметрической и непараметрической статистики с использованием пакета современных прикладных программ [Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2006].
Она включала следующие этапы: 1. Дескриптивная статистика - определение дескриптивных стг Диетических данных: среднее выборочное значение (М); средне квадратичное отклонение (SD), показывающее изменчивость вариациоь п-го ряда. и
Для выявления значимой корреляции использовались методы одно факторного и многофакторного параметрического дисперсионного анализа. Метод дисперсионного анализа основан на разложении общей дисперсии на составляющие: факторальную дисперсию и случайную. На основании расчетов определяется коэффициент влияния контролирующего фактора - доля вариационных данных (по отношению к общим значениям), вызванная действием фактора, которым можно манирулировать или контролировать. В многофакторной схеме влияние факторов распределяется различным их сочетанием.
Цитокины при аденовирусной инфекции конъюнктивы и роговицы
Уровни IL-ip и IL-6 имели тенденцию к повышению, хотя статистически значимо не отличались от значений контрольной группы, при этом высокие значения данных цитокинов наблюдали соответственно в 50,9 % (26 больных) и 60,7 % (31 пациент) случаев. Содержание TNF-a было в 70,6 % случаев (36 больных) существенно выше (р 0,05), чем в контроле. При стихании воспалительного процесса содержание IL-ip и TNF-a в слезной жидкости нормализовалось, тогда как концентрация IL-6, напротив, продолжала увеличиваться, причем увеличилось число пациентов с высоким уровнем ци-токина - с 56,8 % до 88,2%. В слезной жидкости пациентов с хламидийной офтальмоинфекцией уровень противовоспалительного IL-4, в отличие от такового в сыворотке крови, оставался в пределах значений нормы, существенно не изменяясь и на стадии завершения воспаления.
Хламидийная инфекция конъюнктивы характеризовалась существенным сдвигом местного иммунологического реагирования в сторону Th-1 типа: значение соотношения уровней альтернативных цитокинов IF-y/IL-4 в слезной жидкости более чем в 3 раза превышало контрольное, составляя соответственно 34,9+7,1 и 19,2+1,1 единицы. На стадии завершения воспаления отмечали небольшое снижение данного коэффициента (до 26,7+4,2 ед.), однако Th-1 иммунный ответ, по-прежнему, был преобладающим.
Следовательно, вследствие дисфункций клеточного звена иммунитета, при хламидийной инфекции конъюнктивы наблюдается дисбаланс цитокинов, характеризующийся повышением средних уровней IL-ip, IL-6 и IL-4, и достоверно чаще, чем в контроле - TNF-a, в сыворотке крови. Хроническое осложненное (длительное, рецидивирующее) течение хламидийной инфекции конъюнктивы сопровождалось более высоким, чем неосложненное, подъемом концентрации IL-4, прямо коррелирующим с содержанием CD95+-лимфоцитов, свидетельствуя об участии этого цитокина в реализации апоп-тических процессов, что может иметь прогностическое значение. Помимо апоптоза, интенсивность активации иммунной системы и пролиферации лимфоцитов характеризовалась корреляцией уровня IL-ip с числом CD71+-лимфоцитов. Кроме того, при хламидийной инфекции конъюнктивы отмечено значимое изменение интерферонового статуса, характеризующееся ростом содержания IF-y и Ш-сс в слезной жидкости и сыворотке крови, причем только в слезе происходила нормализация уровня IF-a в стадии ранней реконва-лесценции.
Исследование профиля цитокинов при воспалении конъюнктивы, вызванном Chi. trachomatis, дает дополнительные возможности для более глубокого понимания общих закономерностей развития инфекции и ее особенностей при взаимодействии с бактериальными патогенами.
Итак, проведенные нами исследования показали, что вирусные и хла-мидийные инфекционные заболевания глаз сопровождаются существенными системными и локальными изменениями профиля цитокинов, имеющими ведущее значение в механизмах защиты организма, предотвращая возможность репродукции внедрившихся в клетку вируса и хламидий, обеспечивая цитолиз клеток-репродуцентов вируса активированными Т-цитотоксическими лимфоцитами, естественными киллерами и макрофагами.
На рисунке 17 представлено содержание провоспалительных цитокинов IL-1 (З, TNF-a, IL-6 в сыворотке крови и слезной жидкости при инфекционных заболеваниях глаз. При этом обращает на себя внимание одинаковая направленность изменений концентраций данных цитокинов и преобладание локального иммунологического реагирования над системным как при вирусных, так и при хламидийной (Chi. trachomatis) офтальмоинфекциях. содержание цитокинов в слезной жидкости, пг/мл содержание цитокинов в сыворотке крови, пг/мл Рисунок 17 - Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при офтальмоинфекциях 1 - содержание цитокинов при поверхностных формах офтальмогерпеса, 2 - при глубоких, 3 - при аденовирусной инфекции и 4 -хламидийной инфекции глаз
Таким образом, установлено иммунобиологическое значение цитокинов в течении воспалительных реакций при герпетической, аденовирусной и хламидийной офтальмоинфекциях, направленное на регуляцию типа, длительности и степени выраженности локального и системного иммунного ответа, характер которого зависит от вида патогенна, локализации воспаления в оболочках глаза человека, частоты реактивации латентной инфекции. Выявленные закономерности нарушения местного и системного цитокинопосре 117 дованного кооперативного взаимодействия клеток иммунной системы у пациентов с воспалительными процессами в конъюнктиве и роговице согласуются с концепцией типового иммунологического реагирования иммунной системы на инфекцию. Определена важная роль в этом процессе изменениия местной и системной концентрации цитокинов (IL-ip, IL-2, IL-6, TNF-a, IL-4, IF-a, IF-y), регулирующих баланс Тп1/Тп2-пути антигенспецифического иммунного ответа.
Впервые нами установлено, что повышение уровней IL-ip, TNF-a, IL-6 в сыворотке крови и слезной жидкости пациентов с вирусными (герпетической, аденовирусной) и вызванной Chlamydia trachomatis офтальмоинфекци-ях имеет сходство в профиле цитокинов (IL-ip, TNF-a, IL-6) и направленности иммунного ответа по Th-1 типу, но различается по степени выраженности иммунологического реагирования с преобладанием его на локальном уровне.
Проведенные исследования могут служить ориентацией для разработки стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов развития воспалительных процессов в оболочках глаза человека. Полученные результаты вносят вклад в понимание иммунопатогенетического аспекта данных заболеваний глаз и дают основание к целесообразности разработки новых подходов к прогнозированию течения воспалительных процессов, вызванных герпес- и аденовирусами, СЫ. trachomatis, в конъюнктиве и роговице.
Роль цитокинов при дистрофических процессах в сетчатке, вызвавших развитие регматогенной отслойки
Содержание TNF-a в сыворотке крови при воспалении сосудистой оболочки глаза, ассоциированного с РЗ, было статистически значимо (р 0,01) выше такового в контроле, при этом высокое его содержание наблюдалось у 15 (57,7 %) больных. При РЗ отмечен достоверный рост содержания IL-1RAB 76,9 % случаев, который оставался на высоком уровне и при стихании воспаления, тогда как содержание TNF-a, IL-6, IF-a, IF-y снижалось, а уровень IL-lp, напротив, повышался.
Известно, что РЗ, в частности, ревматоидный артрит, сопровождается накоплением IL-1J3 и TNF-a. Полученные нами данные свидетельствуют об увеличении содержания в сыворотке крови при воспалении увеального тракта на фоне ремиссии РЗ не только IL-lp, но также и IL-6, IF-y, IL-1RA.
Развитие воспалительных процессов в увеальном тракте при его инфицировании вирусом простого герпеса, в отличие от воспаления, ассоциированного с РЗ, сопровождалось статистически значимым (р 0,05-0,01) ростом уровней IF-a и IF-y в сыворотке крови соответственно в 45,2 % и 77,4 % случаев, которые оставались высокими и при клиническом выздоровлении.
Содержание IL-lp при герпес-индуцированном воспалении сосудистой оболочки глаза не изменялось, а TNF-a имело менее высокие значения, по сравнению с таковыми при РЗ. Период завершения воспалительного процесса сопровождался снижением уровней IL-2 при неизменных повышенных концентрациях IL-6 и TNF-a. При этом выявлена взаимосвязь уровня TNF-a и числом С095+-лимфоцитов (г=0,78, р=0,054), что свидетельствует как об участии данного цитокина в регуляции апоптоза, так и, наряду с ростом содержания IF-y, о развитии Th-1 иммунного ответа.
Воспаление увеального тракта при герпетической инфекции сопровождалось существенным ростом содержания IL-1RA в сыворотке крови, причем оно было выше такового при РЗ в стадии ремиссии. Стихание воспаления характеризовалось снижением концентрации данного цитокина.
Следует отметить, что при ревматоидных и герпетических увеитах на всех стадиях заболевания содержание противовоспалительного IL-4 в сыворотке крови было повышено относительно группы практически здоровых лиц. Однако при этом наблюдалась разная динамика изменений его уровня, свидетельствующая об отличиях в механизмах развития воспаления в уве-альном тракте в зависимости от причины, его вызвавшей. Так, при воспалительных процессах в сосудистой оболочке глаза, ассоциированных с РЗ, среднее значение IL-4 в сыворотке крови было более высокое, чем при герпесе глаза, затем при выздоровлении оно снижалось, тогда как при воспалении инфекционной этиологии концентрация IL-4, будучи выше контрольных значений, продолжала увеличиваться и на стадии реконвалесценции (р 0,001 и менее).
Сравнительная характеристика иммунорегуляторного коэффициента (соотношения I-y/IL-4) в сыворотке крови при воспалении увеального тракта, ассоциированного с РЗ и офтальмогерпесом Примечание: по оси абсцисс — увеит, по оси ординат — значение соотношения концентрации цитокинов.
Дисбаланс цитокинов в сторону ТЫ был значительно более выражен при герпетическом воспалении увеального тракта. Так, значение иммуноре-гуляторного коэффициента в период максимального развития воспаления при герпесе глаза составляло 20,4±3,5 ед., тогда как при ассоциации воспалительного процесса с РЗ оно было почти в 2 раза меньше - 11,2±0,9 единицы (рисунок 18). Стихание воспаления в тканях глаза сопровождалось нормализацией данного показателя, который в обоих случаях был равен 5,6±0,4 единицы.
Следовательно, проведенный сравнительный анализ профиля цитокинов при воспалении сосудистой оболочки глаза, обусловленном герпетической инфекцией или ассоциированном с РЗ, выявил более значительное увеличение содержания в сыворотке крови провоспалительных цитокинов при системных заболеваниях, тогда как при инфекционном процессе отмечали существенный рост уровней интерферонов, т.е. активизацию первого звена противовирусного иммунного ответа.
Из представленной диаграммы видно, что при развитии воспалительного процесса в конъюнктиве уровни IL-6, TNF-a и IL-lp в сыворотке крови наименьшие. При воспалении в роговице отмечалось увеличение содержания IL-6, TNF-a, концентрация IL-lp в сыворотке крови была практически такой же, как и при локализации воспаления в конъюнктиве. Развитие воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза сопровождалось наиболее выраженными системными изменениями: уровни данных цитокинов в сыворотке крови были максимальными, по сравнению с воспалением в других оболочках глаза. Что касается противовоспалительного IL-4, то его содержание в сыворотке крови в период развития воспаления во всех оболочках глаза существенных различий не имел.
Поскольку в патогенезе увеитов большую роль играют нарушения гемодинамики и ангиогенеза, а также изменения различных иммунологических параметров, включая и профиль цитокинов, одним из которых является вас-кулоэндотелиальный фактор роста (VEGF), то нам представилось интересным определить его содержание при воспалении сосудистой оболочки глаза, вызванной различными причинами.
Проведенные исследования показали, что, в целом, у пациентов с воспалением увеального тракта среднее содержание VEGF в сыворотке крови было существенно выше такового у практически здоровых лиц (таблица 22).
При этом, в 66,7 % случаев уровень васкулоэндотелиального фактора роста находился в пределах 100-500 пг/мл, в остальных 33,3 % он был еще выше, находясь в интервале 550-1780 пг/мл. На стадии купирования воспалительного процесса отмечали снижение содержания VEGF, хотя оно, по-прежнему, был статистически значимо выше контрольных значений.
Сравнительный анализ уровня VEGF в сыворотке крови при воспалительных процессах в сосудистой оболочке глаза в зависимости от причины, его вызвавшей, показал, что при воспалении, ассоциированном с РЗ, его содержание было наибольшим. Воспалительные процессы в увеальном тракте при герпетической офтальмоинфекции имели значения концентрации VEGF в 1,9 раза ниже, чем при РЗ. Развитие воспаления в сосудистой оболочке глаза, когда его причина не была установлена, сопровождалось, также как и во всех других исследуемых группах, статистически значимым (р 0,001 и менее) повышением содержания васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови.
